馬濤綜述，蔣孝華審校

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，湖南衡陽(yáng)421001）

丙型肝炎病毒體外復(fù)制模型的研究進(jìn)展

馬濤綜述，蔣孝華審校

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，湖南衡陽(yáng)421001）

肝炎，丙型；肝炎病毒；體外研究；細(xì)胞模型；綜述

持續(xù)感染的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)問題。全球有130～170萬人感染了這種病菌，感染者發(fā)生肝臟損傷的風(fēng)險(xiǎn)很高，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。由于丙型肝炎的潛伏期長(zhǎng)且大部分病人早期無明顯表現(xiàn)，估計(jì)在未來的5～10年HCV相關(guān)的肝臟疾病患者數(shù)量將會(huì)持續(xù)上漲[2]。迄今為止，未研究出可預(yù)防HCV感染的疫苗。然而，在靶向治療病毒和宿主方面，直接作用的抗病毒藥物（direct-acting antiviral drugs，DAAs）取得巨大進(jìn)步，能有效地阻止HCV的復(fù)制[3]。首個(gè)抑制HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3）的蛋白酶類抑制劑，增加了感染HCV1型患者的持續(xù)病毒應(yīng)答率，在聯(lián)合聚乙二醇化的α干擾素/利巴韋林這2種藥物治療的情況下，應(yīng)答率從45%上升至75%[4]。但是，這三重組合療法有許多不良反應(yīng)和一些禁忌證，并僅限于基因型1病毒。因此，更有效的DAAs是必需的。大部分DAAs的發(fā)展，都需要有可靠、實(shí)用的HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型。本文對(duì)HCV體外細(xì)胞模型的研究進(jìn)展作一綜述。

1 HCV的分子生物學(xué)特性

HCV是黃病毒科的一員，形成丙型肝炎病毒屬?；蚪M為單股正鏈RNA，含9 600個(gè)核苷酸。它包含1個(gè)長(zhǎng)開放閱讀框和兩側(cè)5′和3′非編碼區(qū)（nontranslated regions，NTRS）。5′非編碼區(qū)包含1個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES），可編碼約3 000個(gè)氨基酸的前體多聚蛋白[5]，翻譯后，前體多聚蛋白被宿主信號(hào)肽酶和病毒基因編碼的蛋白酶切割成10個(gè)獨(dú)立的片段[6]。包括核心蛋白，包膜糖蛋白E1和E2、p7中的離子通道蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。核心蛋白是病毒核衣殼的重要組成部分，其作用得到越來越多的關(guān)注，最近發(fā)現(xiàn)核心蛋白在肝癌的發(fā)生中可能直接作為致病因子[7]。高藝[8]認(rèn)為E1可能與載脂蛋白有關(guān)，主要是通過低密度脂蛋白受體得以進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。E1和E2屬于膜蛋白，構(gòu)成病毒外膜。E1、E2與病毒受體發(fā)生特異性結(jié)合，并介導(dǎo)膜融合與細(xì)胞穿入，是引發(fā)宿主受病毒感染的始動(dòng)因素[5]。p7不是病毒復(fù)制所必需的，但是在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)病毒擴(kuò)增時(shí)是必不可少的蛋白[5]。NS2具有半胱氨酸蛋白酶活性，能切割NS2和NS3的連接位點(diǎn)。NS3在N末端結(jié)構(gòu)域編碼絲氨酸蛋白酶，其需要NS4A輔助因子的激活。C端NS3區(qū)域編碼RNA復(fù)制所需的NTPase/解旋酶。NS4B誘導(dǎo)膜重塑，與病毒復(fù)制有關(guān)。NS5A是一種高度磷酸化的蛋白，參與病毒復(fù)制和組裝。NS5B是病毒依賴性RNA聚合酶。

2 HCV復(fù)制子系統(tǒng)

1999年趙婷等[9]建立了選擇性雙順反子亞基因組HCV RNA復(fù)制子系統(tǒng)，標(biāo)志著HCV體外培養(yǎng)技術(shù)的一大進(jìn)步。此系統(tǒng)將核心蛋白至p7或核心蛋白至NS2區(qū)域的編碼用2個(gè)非HCV序列替代，即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neo）和由腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）衍生的一個(gè)額外IRES。由此形成了HCV復(fù)制子的雙順反子。將該復(fù)制子轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞系Huh7，經(jīng)G418抗性篩選，發(fā)現(xiàn)通過敏感的Northern blotting分析很容易檢測(cè)（一個(gè)含有HCV復(fù)制子的細(xì)胞含有1 000～5 000正鏈RNAs和10倍以下的負(fù)鏈）[10]。在此基礎(chǔ)上，研究者在HCV復(fù)制子基因序列中插入適應(yīng)性突變，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)復(fù)制子的感染與復(fù)制能力，但這些適應(yīng)性突變?cè)鰪?qiáng)復(fù)制的機(jī)制仍不清楚[11-12]。

研究主張HCV復(fù)制子的自主復(fù)制，但仍不能排除一些無意整合進(jìn)入細(xì)胞DNA的病毒序列及因此合成的病毒RNA，這是主要的問題。當(dāng)發(fā)現(xiàn)在放線菌素D（一種DNA依賴的RNA聚合酶強(qiáng)抑制劑）的存在下，病毒RNA能夠放射性標(biāo)記與代謝[3H]尿苷，問題得以解決。因此，第一個(gè)可靠實(shí)用的HCV亞基因復(fù)制子細(xì)胞模型成功建立了。然而復(fù)制子只能模擬HCV復(fù)制，不能產(chǎn)生感染性病毒顆粒。

3 HCV全基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型

最初，只有少數(shù)HCV分離物衍生的復(fù)制子可在細(xì)胞培養(yǎng)中繁衍，包括CON1、HCV-N和H77株（基因型1）。后來觀察到了其他病毒株，如HCV-BK（基因型1b）和J6（基因型2a）[13]。直到Takaji Wakita等從日本1例爆發(fā)性肝炎患者的血清中克隆出了一種基因型2a病毒株，命名為JFH-1，在沒有適應(yīng)性突變的情況下能有非常高水平的復(fù)制。此病毒株也可以在不易感染的細(xì)胞系復(fù)制，如HepG2、宮頸癌Hela或293T細(xì)胞。JFH-1高效復(fù)制的分子機(jī)制還沒有完全清楚。然而，在Con-1和JFH-1復(fù)制子的比較中，確定了更快的JFH-1的負(fù)鏈RNA合成動(dòng)力學(xué)，他們認(rèn)為這種病毒株能編碼更有效的復(fù)制酶[14]。用JFH-1全基因組RNA體外轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后Northern blotting檢測(cè)到HCV RNA，并在72 h后仍為陽(yáng)性結(jié)果；免疫熒光檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染后72 h，70%～80%的細(xì)胞表達(dá)核心蛋白和NS3蛋白，證明該細(xì)胞模型能穩(wěn)定地支持HCV RNA復(fù)制[15]。在轉(zhuǎn)染后5 d，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCV RNA和蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰，并在接下來的7 d中維持在高水平，稍后出現(xiàn)輕微下降。

第一個(gè)在非Huh-7細(xì)胞如Hela或鼠的肝癌細(xì)胞系Hepa-6上成功建立的HCV復(fù)制子在2003年被報(bào)道，從而證明了HCV RNA復(fù)制本身不依賴于僅在人肝細(xì)胞表達(dá)的宿主因子。通過在這些復(fù)制子上使用高效的JFH-1病毒株，可以在許多不同的細(xì)胞系如人肝細(xì)胞系HepG2和IMY-9、非肝細(xì)胞系293和HeLa和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）相當(dāng)容易地建立起來[16-17]。

可用的易感染細(xì)胞克隆系、復(fù)制增強(qiáng)的突變和JFH-1株大大拓寬了HCV復(fù)制的應(yīng)用范圍。高效含有熒光素酶基因的復(fù)制子，適用于瞬時(shí)（短期）測(cè)定，也是可用的。此外，含有選擇性報(bào)道基因復(fù)制子的細(xì)胞株適用于高通量篩選的目的。只含有HCV IRES的單順反子復(fù)制子的構(gòu)建，更加真實(shí)地模仿了病毒基因組的轉(zhuǎn)錄屬性[18]。最后，NS5A一個(gè)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)允許其內(nèi)部框架插入綠色熒光蛋白（GFP），從而首次允許通過細(xì)胞生命成像來進(jìn)行推定病毒復(fù)制位點(diǎn)的研究[19]。

4 HCV體外自然感染模型

HCV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平較高，但其轉(zhuǎn)染方法操作比較繁雜，需要構(gòu)建復(fù)制子、重組質(zhì)?；騺喕驈?fù)制子才能進(jìn)行轉(zhuǎn)染。且不能真實(shí)反映病毒復(fù)制狀態(tài)。感染模型雖病毒復(fù)制水平低，但與自然感染狀態(tài)最為接近，能夠比較真實(shí)地模擬HCV感染細(xì)胞的狀態(tài)，比較適于進(jìn)行HCV發(fā)病機(jī)制及藥物研發(fā)等相關(guān)研究。

日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院和日本國(guó)立衛(wèi)生研究院的學(xué)者認(rèn)為感染細(xì)胞模型的建立必不可少的是HCV陽(yáng)性血清：（1）血清中HCV的懸浮密度小于1.06 g/mL；（2）抗病毒核心抗體檢不出或很低；（3）HCV顆粒對(duì)細(xì)胞的吸附性好，HCV RNA含量高。

在感染細(xì)胞模型的建立中，易感的靶細(xì)胞是另一個(gè)必不可少的條件，肝細(xì)胞是HCV自然感染的細(xì)胞，成為建立細(xì)胞模型的首選靶細(xì)胞。有研究證明人類淋巴細(xì)胞Ⅰ型病毒感染的T細(xì)胞，人類肝癌細(xì)胞系，外周血單個(gè)核細(xì)胞等都不同程度對(duì)HCV敏感。根據(jù)研究目的不同，可選擇不同的靶細(xì)胞。

通過研究表明篩選合適的HCV陽(yáng)性血清樣品，并選擇敏感的細(xì)胞株作為感染靶細(xì)胞，可以建立HCV體外細(xì)胞感染模型，在培養(yǎng)上清中能夠持續(xù)檢測(cè)到HCV RNA正鏈的表達(dá)，并可間斷檢測(cè)到HCV負(fù)鏈RNA。這可作為綜合評(píng)價(jià)感染細(xì)胞模型的指標(biāo)，也可能被用于抗HCV藥物及疫苗研究的評(píng)價(jià)。近幾年，由于感染模型更加貼近于自然感染，已有不少學(xué)者成功建立了自然感染模型，但仍需要進(jìn)一步優(yōu)化，這將成為未來研究發(fā)展的主要方向。

5 肝炎病毒作用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)藥物的發(fā)展

亞基因組復(fù)制系統(tǒng)在丙型肝炎病毒靶向的DAAs的發(fā)展中起著重大作用[20]。（1）它是第一個(gè)可用的HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，1999年，當(dāng)復(fù)制模式第一次被報(bào)道后，HCV的2個(gè)關(guān)鍵酶被編碼出，NS3蛋白酶和NS5B RdRp，這兩種酶能充分顯示和高度篩選已確定的候選抑制劑的靶向目標(biāo)。（2）該復(fù)制子概括了細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制循環(huán)的步驟。（3）亞基因組復(fù)制子包含所有抗病毒治療的主要目標(biāo)，也就是，NS3蛋白酶和NS5B RdRp[21]，提供了一個(gè)基于細(xì)胞的合適的篩選平臺(tái)。（4）高通量篩查復(fù)制子細(xì)胞中新的和未知的目標(biāo)，最顯著的是NS5A復(fù)制酶因子[22]和宿主細(xì)胞編碼的親環(huán)A[23-24]。（5）第一個(gè)復(fù)制子是基于基因型1分離出的，對(duì)于以干擾素為基礎(chǔ)療法的研究，這是最普遍和艱難的。（6）亞基因組復(fù)制子不支持病毒生產(chǎn)，因此可以在一個(gè)沒有特殊的生物安全防護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室使用。（7）亞基因組復(fù)制子可適應(yīng)多重篩選格式。例如，含有穩(wěn)定選擇性復(fù)制子的細(xì)胞系能夠表達(dá)螢光素酶報(bào)道基因，非常適用于細(xì)胞化合物的高通量篩選。用于抗病毒藥物研發(fā)的雙重選擇性穩(wěn)定復(fù)制子細(xì)胞可以提供一種極好的工具，以產(chǎn)生耐藥變異體，因?yàn)檫@種方法通常產(chǎn)生的克隆細(xì)胞群，能夠使其中的抗性突變保守的保留在病毒基因組中。這種方法是必不可少的屏障，以表征某些化合物的阻力，并確定了之后觀察到的被治療患者的主要耐藥變異[25-26]?？傊?，該復(fù)制系統(tǒng)一個(gè)不可缺少的工具，不僅為DAAs的發(fā)展和篩選抗病毒藥物，還是對(duì)這些藥物病毒抗性的表征。

但該復(fù)制系統(tǒng)也具有幾個(gè)明顯的缺點(diǎn)：（1）選擇性復(fù)制子中異源IRES的存在是一個(gè)在進(jìn)行藥物篩選時(shí)可能的缺陷。（2）在細(xì)胞增殖過程中要細(xì)心的培養(yǎng)，因?yàn)樵诨贖uh-7系的復(fù)制子細(xì)胞中的HCV復(fù)制非常依賴于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。（3）復(fù)制增強(qiáng)的突變可能會(huì)影響藥物靶點(diǎn)的特性。（4）不能排除結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)給定化合物抗病毒活性的影響。然而，利用基因組復(fù)制子，這可以被檢測(cè)出。（5）缺乏病毒的生產(chǎn)，因而排除了使用該復(fù)制系統(tǒng)來篩選影響早期和晚期的病毒復(fù)制周期步驟的抑制劑（病毒進(jìn)入和裝配/釋放）。

限制了HCVcc的模型在HCV藥物研發(fā)中的使用有幾個(gè)原因：（1）基因型2a對(duì)于藥物的研發(fā)是不理想的，因?yàn)橐呀?jīng)被認(rèn)可的干擾素/利巴韋林治療用在這種基因型上，有很高的應(yīng)答率。許多的DAAs只對(duì)某些基因型產(chǎn)生作用，特別是非核苷NS5B抑制劑和第一代蛋白酶抑制劑[39]。事實(shí)上，有許多對(duì)基因型1b高效的DAAs（第一代），原因可能是基因型1b復(fù)制子是最初唯一可用的。（2）與亞基因組復(fù)制子相比，感染病毒的工作需要更高的生物安全水平。然而，最近建立的具有復(fù)制能力的病毒株和HCVcc模型，覆蓋了更廣泛的HCV變異體，可能為未來研發(fā)針對(duì)每個(gè)HCV基因型的最佳組合療法有著重要的作用。

6 展望

丙型肝炎患病率的持續(xù)增長(zhǎng)，已經(jīng)成為全球迫切需要解決的公共衛(wèi)生問題。目前關(guān)于丙型肝炎研究大部分以HCV細(xì)胞模型為基礎(chǔ)。HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，不僅是DAAs發(fā)展必不可少的先決條件，也推動(dòng)了基礎(chǔ)研究。HCV體外自然感染模型需進(jìn)一步研究改善。

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讀者·作者·編者

論文前言的撰寫方法

論文前言（亦稱引言）是論文的開場(chǎng)白，要求開門見山，簡(jiǎn)明扼要，介紹論文的寫作目的、范圍和相關(guān)領(lǐng)域研究概況，說明目前研究的熱點(diǎn)及存在的問題，引出本文主題，給讀者以引導(dǎo)。可簡(jiǎn)述本研究?jī)?nèi)容、結(jié)果、意義及前景，但切忌寫成討論、綜述和回顧，一般要求在200個(gè)漢字以內(nèi)。

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.026

A

1009-5519（2015）03-0389-03

2014-11-19）

馬濤（1989-），女，湖南常德人，碩士研究生，主要從事慢性肝病的防治工作；E-mail：308502676@qq.com。

蔣孝華（E-mail：matao5047@163.com）。