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美托洛爾對慢性心力衰竭患者外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子表達(dá)水平的影響研究

2015-02-22 03:38:48呂曉偉王熱華
實(shí)用心腦肺血管病雜志 2015年6期
關(guān)鍵詞:趨化因子洛爾外周血

呂曉偉,王熱華

·論著·

美托洛爾對慢性心力衰竭患者外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子表達(dá)水平的影響研究

呂曉偉,王熱華

心力衰竭;美托洛爾;Th17細(xì)胞

已有文獻(xiàn)表明,CHF患者存在Th17細(xì)胞百分率升高現(xiàn)象[3],但Th17細(xì)胞分化特征不同,正調(diào)控Th17細(xì)胞分化的核轉(zhuǎn)錄因子視黃酸相關(guān)核孤獨(dú)受體γt(RORγt)和負(fù)調(diào)控Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子信號傳送阻抑蛋白3(SOCS3)及Th17細(xì)胞相關(guān)趨化因子CX型趨化因子配體1(CXCL1)、CXCL5、CXCL8在疾病發(fā)生過程中的作用尚未明確。新一代β受體阻滯劑——美托洛爾可通過抑制炎性因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)等的表達(dá)而有效改善患者心功能,研究發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6均可誘導(dǎo)幼稚性CD4原始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化,因此本研究選擇美托洛爾治療CHF,并探討其對CHF患者外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1—6月福建省晉江市醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的CHF患者60例,其中男32例,女28例;病程1~8年;年齡48~76歲,平均年齡(62.8±8.6)歲;基礎(chǔ)疾?。焊哐獕盒呐K病16例,擴(kuò)張型心肌病24例,冠心病20例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)確診為CHF至少3個月;(2)紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級Ⅱ~Ⅳ級;(3)左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<40%。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)靜息狀態(tài)下心率<55次/min、血壓≤90/50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),Ⅱ度及以上房室傳導(dǎo)阻滯者;(2)患有短期內(nèi)可能導(dǎo)致死亡的疾病者;(3)有β受體阻滯劑禁忌證(如支氣管哮喘、房室傳導(dǎo)阻滯、胰島素依賴型糖尿病等)及不能耐受β受體阻滯劑治療者。入院后將60例患者隨機(jī)分成常規(guī)治療組和美托洛爾組,各30例,兩組患者性別、年齡、病程、基礎(chǔ)疾病及心功能分級比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1),具有可比性。另選擇同期在本院體檢健康者30例作為健康對照組,其中男16例,女14例;平均年齡(56.0±12.0)歲。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn),所有受試者知情同意。

1.2 治療方法 常規(guī)治療組患者給予洋地黃、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)等常規(guī)治療。美托洛爾組患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用美托洛爾,起始劑量為6.25 mg/次、2次/d,心力衰竭無加重者12.5 mg/周遞增,直至100 mg/d,1次/d。兩組患者均治療6個月,治療期間追蹤隨訪,定期到門診體檢,詳細(xì)觀察并記錄兩組患者治療前后心力衰竭癥狀、心率、血壓、呼吸等變化,記錄治療前后心電圖及24 h動態(tài)心電圖。

1.3 主要試劑與儀器 多甲藻葉綠素蛋白標(biāo)記的CD3(CD3-PerCP)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD4(CD4-FITC)、藻紅蛋白標(biāo)記的IL-17(IL-17-APC)流式抗體(德國Miltenyi公司);Trizol(美國Invitrogen公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清(美國Gibco公司);Ficoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液(福建諾普生物科技有限公司);流式染色用細(xì)胞固定和穿膜緩沖液、莫能菌素、離子霉素、佛波酯(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司);M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司),One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(日本Takara公司);Light Cycler實(shí)時熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司);BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.4 方法

1.4.2 實(shí)時熒光定量PCR 使用EDTA-K2抗凝管抽取各組受試者前臂外周血3 ml,同上所述提取PBMC(1×106/ml),將PBMC沉淀彈勻,加入1 ml Trizol,充分混勻,室溫放置30 min。而后加入200 μl預(yù)冷三氯甲烷,充分震蕩混勻15 s,室溫放置2~3 min,再次震蕩15 s,室溫放置2~3 min。4 ℃,12 000×g離心15 min,小心吸取上層水相500 μl,移至無RNase的EP管中。再加入500 μl異丙醇上下輕輕顛倒混勻,室溫放置20 min。4 ℃,12 000×g離心10 min,小心棄上清液,RNA沉于管底,提取得到總RNA。參照M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,RORγt、SOCS3、IL-6、IL-17、IL-23、CXCL1、CXCL5、CXCL8的引物設(shè)計(jì)采用Primer5程序,并在BLAST數(shù)據(jù)庫比對后由上海Invitrogen公司合成(見表2)。反應(yīng)體系均為20 μl,擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min,40個循環(huán)的95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s。樣本均為一式3份,mRNA含量用比較域值的方法通過相對每個樣本的內(nèi)參基因GAPDH計(jì)算。目的基因量=2-ΔΔCt,ΔCt 是目的基因和內(nèi)參基因循環(huán)域值的差值。數(shù)據(jù)通過健康對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因-健康對照組Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行產(chǎn)物的溶解曲線分析,系統(tǒng)軟件自動分析在每個周期中產(chǎn)生的熒光信號,閾循環(huán)值用于確定與GAPDH作為參考基因計(jì)算基因表達(dá)的相對定量。

表1 兩組患者一般資料比較

注:a為χ2值

1.4.3 心功能檢測 CHF患者于入院24 h及治療6個月隨訪時檢測心功能,采用心臟彩超儀(GE公司)于左心長軸切面腱索水平采用M型超聲檢測LVEF,于胸骨旁左心長軸切面腱索水平檢測左心室舒張末期直徑(LVEDD)。

2 結(jié)果

2.2 各組血清Th17細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá) 治療前3組PBMC中RORγt、IL-6、IL-17、IL-23及趨化因子CXCL1、CXCL5、CXCL8 mRNA表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中常規(guī)治療組和美托洛爾組患者PBMC中RORγt、IL-6、IL-17、IL-23及趨化因子CXCL1、CXCL5、CXCL8 mRNA表達(dá)水平高于健康對照組,SOCS3 mRNA表達(dá)水平低于健康對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而常規(guī)治療組和美托洛爾組患者RORγt、SOCS3、IL-6、IL-17、IL-23及趨化因子CXCL1、CXCL5、CXCL8 mRNA表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后美托洛爾組患者PBMC中RORγt、IL-6、IL-17、IL-23、CXCL1、CXCL5、CXCL8 mRNA表達(dá)水平均低于常規(guī)治療組,SOCS3 mRNA表達(dá)水平高于常規(guī)治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3~5)。CXCL1、CXCL5、CXCL8與IL-17 mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.438、0.345、0.423,P<0.01)。

2.3 CHF患者心功能指標(biāo)比較 兩組CHF患者治療前LVEF和LVEDD比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后美托洛爾組患者LVEF高于常規(guī)治療組,LVEDD小于常規(guī)治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表6)。

Table 3 Comparison of RORγt and SOCS3 mRNA expression levels of PBMC among the three groups before and after treatment

組別例數(shù)RORγt治療前 治療后SOCS3治療前 治療后健康對照組300 35±0 08-0 98±0 23-常規(guī)治療組301 63±0 50a0 95±0 220 45±0 09a0 66±0 02美托洛爾組301 66±0 49a0 47±0 13b0 47±0 08a0 86±0 14bF(t)值101 377 987c120 497 798cP值0 0000 0010 0000 001

注:-表示未測;與健康對照組比較,aP<0.05;與常規(guī)治療組比較,bP<0.05;c為t值

表2 基因引物序列

注:RORγt=核轉(zhuǎn)錄因子視黃酸相關(guān)核孤獨(dú)受體γt,SOCS3=細(xì)胞因子信號傳送阻抑蛋白3;IL-6=白介素6,IL-17=白介素17,IL-23=白介素23;CXCL1=CX型趨化因子配體1,CXCL5=CX型趨化因子配體5,CXCL8=CX型趨化因子配體8

圖1 各組受試者PBMC中細(xì)胞百分率

表4 3組受試者治療前后PBMC中IL-6、IL-17及IL-23 mRNA表達(dá)水平比較

注:-表示未測;與健康對照組比較,aP<0.05;與常規(guī)治療組比較,bP<0.05;c為t值

表5 3組受試者治療前后PBMC中CXCL1、CXCL5及CXCL8 mRNA表達(dá)水平比較

注:-表示未測;與健康對照組比較,aP<0.05;與常規(guī)治療組比較,bP<0.05;c為t值

Table 6 Comparison of cardiac function index between the two groups before and after treatment

組別例數(shù)LVEF(%)治療前 治療后LVEDD(mm)治療前 治療后常規(guī)治療組3031 7±5 441 0±6 164 7±6 562 0±5 9美托洛爾組3033 4±5 253 6±5 669 6±5 557 8±5 8t值0 3455 3210 4263 799P值1 2310 0041 0120 003

注:LVEF=左心室射血分?jǐn)?shù),LVEDD=左心室舒張末期直徑

3 討論

美托洛爾作為新一代β受體阻滯劑,不僅能通過阻斷β受體而改善患者心功能,還具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等輔助作用[10]。本研究結(jié)果顯示,美托洛爾組患者治療后心功能指標(biāo)改善程度優(yōu)于常規(guī)治療組,這可能與其阻斷β受體作用相關(guān),該結(jié)果與Schiller[11]的研究結(jié)果一致。同時本研究結(jié)果還提示,美托洛爾可能具有抑制Th17細(xì)胞分化、下調(diào)Th17細(xì)胞功能、改善慢性炎癥的作用,這可能是美托洛爾從機(jī)體免疫方面改善CHF患者心功能的作用機(jī)制之一,該結(jié)果與Tian等[12]報(bào)道的關(guān)于美托洛爾對于趨化因子的抑制作用相符。

綜上所述,CHF患者存在強(qiáng)烈的Th17細(xì)胞免疫反應(yīng),增高的IL-6、IL-17、IL-23、CXCL1、CXCL5、CXCL8有利于維持CHF患者Th17細(xì)胞優(yōu)勢的體內(nèi)微環(huán)境,并通過RORγt和SOCS3兩種途徑共同調(diào)控TH17細(xì)胞的優(yōu)勢分化。美托洛爾可以通過抑制機(jī)體Th17細(xì)胞極向分化而逆轉(zhuǎn)該疾病的發(fā)展,改善患者預(yù)后。由于本研究樣本量較小,隨訪時間短,因此需要擴(kuò)大樣本量證實(shí)美托洛爾對改善CHF患者預(yù)后及確切機(jī)制,為臨床治療提供參考價(jià)值。

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(本文編輯:謝武英)

Impact of Metoprolol on Peripheral Blood Th17 Cells and Related Factors Levels in Patients with Chronic Heart Failure

LYVXiao-wei,WANGRe-hua.DepartmentofCardiovascularDisease,JinjiangMunicipalHospital,Jinjiang362000,China

Heart failure;Metoprolol;Th17 cell

國家自然科學(xué)基金青年基金科學(xué)項(xiàng)目(31400858)

362000福建省晉江市醫(yī)院心血管內(nèi)科(呂曉偉);福建省立醫(yī)院心血管內(nèi)科(王熱華)

呂曉偉,王熱華.美托洛爾對慢性心力衰竭患者外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子表達(dá)水平的影響研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志,2015,23(6):7-12.[www.syxnf.net]

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.06.003

2015-04-12;

2015-06-14)

【編者按】 慢性心力衰竭是指持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài),目前,免疫因素作為慢性心力衰竭發(fā)病的重要原因已被廣泛認(rèn)可。美托洛爾為新一代β受體阻滯劑,被廣泛用于治療心絞痛及心力衰竭,但關(guān)于美托洛爾對慢性心力衰竭患者外周血Th細(xì)胞影響的研究報(bào)道較為少見。本研究探討了美托洛爾對慢性心力衰竭患者外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子表達(dá)水平的影響,結(jié)論認(rèn)為慢性心力衰竭患者存在強(qiáng)烈的Th17細(xì)胞免疫反應(yīng),美托洛爾具有抑制Th17細(xì)胞分化、下調(diào)Th17細(xì)胞功能、改善慢性炎癥等作用,提出了美托洛爾治療慢性心力衰竭的可能的免疫作用機(jī)制,選題新穎,結(jié)論可靠,臨床指導(dǎo)價(jià)值較高。

Lyv XW,Wang RH.Impact of metoprolol on peripheral blood Th17 cells and related factors levels in patients with chronic heart failure[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease,2015,23(6):7-12.

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