焦灝琳，張延龍,牛立新

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 林學(xué)院，b 園藝學(xué)院，陜西 楊凌712100)

卷丹鱗莖多酚組成及其抗氧化活性研究

焦灝琳a，張延龍a,牛立新b

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 林學(xué)院，b 園藝學(xué)院，陜西 楊凌712100)

【目的】 研究卷丹鱗莖提取物的多酚物質(zhì)組成及其抗氧化活性，為卷丹的進(jìn)一步開發(fā)提供理論參考。【方法】 以野生卷丹鱗莖為材料，用Folin-Ciocalteau法測定卷丹鱗莖多酚提取物的總酚含量，用HPLC法測定多酚組分，并測定了卷丹鱗莖提取物對ABTS、DPPH和羥自由基的清除能力?！窘Y(jié)果】 卷丹鱗莖提取物總酚含量為48.78 mg/g；HPLC共鑒定出10種酚類成分，其中表兒茶素、蘆丁和二氫槲皮素為主要成分，其含量分別為4.58,3.10和 1.45 mg/g；多酚提取物對ABTS·、DPPH·和OH·3種自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，且清除作用與多酚質(zhì)量濃度呈顯著性正相關(guān)，R2分別為0.964，0.992和0.838?！窘Y(jié)論】 卷丹鱗莖提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可作為一種天然的植物抗氧化劑來源。

卷丹；抗氧化活性；酚類物質(zhì)；HPLC

卷丹(LiliumlancifoliumThunb)，百合科百合屬(Lilium)多年生草本植物，在我國分布極廣，主產(chǎn)于長江流域。卷丹不僅具有較高的觀賞價(jià)值，而且其鱗莖部位藥食兼用，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效[1]，是我國藥典收錄的3種藥用百合之一，也是百合藥材的主要來源。現(xiàn)代研究表明，卷丹鱗莖中含有多糖、甾體皂苷、生物堿、黃酮、酚酸甘油酯等多種生物活性物質(zhì)[2]；藥理學(xué)分析表明，卷丹鱗莖的醇提取物具有抗氧化、抗真菌[3]與抗炎[4]的作用。植物酚類化合物大多具有抗氧化能力，而抗氧化能力與其抗腫瘤、抗菌、抗炎等生物活性直接相關(guān)[5]。目前，對卷丹鱗莖生物活性物質(zhì)的研究主要集中在甾體皂苷上，而對其酚類物質(zhì)組成和抗氧化能力的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以野生卷丹鱗莖為試驗(yàn)材料，分析其鱗莖提取物的多酚含量和具體組分,以及對多種自由基的抑制和清除能力，以期為卷丹的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷丹百合種球于2012-08采自陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)天臺(tái)山。將新鮮百合鱗莖去泥洗凈，真空冷凍干燥，粉碎，過0.15 mm篩，密封備用。

所用試劑：ABTS、DPPH、沒食子酸、矢車菊素蕓香糖苷、飛燕草素、木犀草素、兒茶素、綠原酸、根皮苷、柚皮素、表兒茶素、二氫楊梅酮、蘆丁、對香豆酸、二氫槲皮素、圣草酚和山奈酚，標(biāo)準(zhǔn)品級(jí)(中國上海Sigma公司)；甲醇，色譜級(jí)(天津博迪化學(xué)試劑公司)；其余試劑為分析純(西安化學(xué)試劑公司)。

所用儀器：LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)，LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，KDC-140HR高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 多酚提取 準(zhǔn)確稱取百合干粉5.0 g， 加入25 mL甲醇，超聲提取20 min(40 ℃、 100 W)，離心10 min(8 000 r/min)后取上清液，重復(fù)上述過程3次。合并提取液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用甲醇定容至25 mL，4 ℃保存。

1.2.2 多酚總量測定 采用Folin-Ciocalteau法[6]測定卷丹鱗莖中的總酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。用甲醇配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)稀釋得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為0.5，0.25，0.13，0.06，0.03和0.015 mg/mL。準(zhǔn)確吸取各梯度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和多酚提取液各0.1 mL于具塞試管中，依次加入7.9 mL蒸餾水和0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑，混勻后反應(yīng)5 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% 的Na2CO3溶液1.5 mL，暗處反應(yīng)2 h后于765 nm處測定吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.973 0x+0.010 8，R2=0.998 4，多酚含量表示為mg/g。

1.2.3 多酚組分的高效液相色譜(HPLC)檢測和含量測定 將制備的多酚提取液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，備用，通過與各標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的對比進(jìn)行單體酚物質(zhì)定性，峰面積定量。

色譜條件：LC-2010AHT高效液相色譜儀，配備自動(dòng)進(jìn)樣器和光電二級(jí)陣列檢測器；色譜柱：Hibar C18反相色譜柱 (250 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A 乙酸水(V(乙酸)∶V(水)=99.6∶0.4)，B乙腈；洗脫程序：0～40 min、5%～40% B，40～45 min、40%～100% B，45～60 min、100% B；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：280～360 nm。標(biāo)準(zhǔn)品從固定的質(zhì)量濃度(1 mg/mL)開始進(jìn)行連續(xù)的稀釋以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，多酚單體酚含量單位為mg/g。

1.2.4 多酚的抗氧化活性 (1)對ABTS自由基的清除能力。參照Re等[7]的方法，將卷丹鱗莖多酚提取液用甲醇配制成5個(gè)不同質(zhì)量濃度(1，2，3，4，5 mg/mL)的溶液。ABTS陽離子制備方法為，將7 mmol/L 5 mL ABTS溶液與140 mmol/L 80 μL過硫酸鉀溶液暗處反應(yīng)12 h以上，使用前用甲醇稀釋到A734 nm為0.7左右。取0.1 mL 不同質(zhì)量濃度卷丹鱗莖多酚提取液，加入3.9 mL ABTS·溶液，以相同體積的甲醇代替多酚提取液為空白對照(A0)，反應(yīng)6 min 后于734 nm處測定吸光值(AS)，計(jì)算清除率。

(2)對DPPH自由基的清除能力。參考Brand-Williams等[8]的方法，并略有改動(dòng)。取0.1 mL不同質(zhì)量濃度卷丹鱗莖多酚提取液，加入3.9 mL 6.25×10-5mol/L DPPH (加甲醇配制)，充分混勻；以相同體積的甲醇代替多酚提取液為空白對照(A0)，暗處反應(yīng)30 min后在517 nm 處測定吸光值(AS)，計(jì)算清除率。

(3)對羥自由基的清除能力。參照Sroka等[9]的方法，將9 mmol/L FeSO41 mL、體積分?jǐn)?shù) 0.15% H2O245 μL和9 mmol/L水楊酸溶液1 mL依次加入4 mL蒸餾水中，與1 mL不同質(zhì)量濃度卷丹鱗莖多酚提取液混勻后，于37 ℃水浴30 min，以相同體積的甲醇為空白對照(A0)，在536 nm處測定吸光值(AS)，計(jì)算清除率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

自由基清除率的計(jì)算公式為：清除率=[1-(AS-A0)]×100%；分析清除率(y)與多酚提取物質(zhì)量濃度(x)之間的關(guān)系。通過SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷丹鱗莖中多酚含量及組成

多酚類物質(zhì)具有2個(gè)或多個(gè)活潑的酚羥基結(jié)構(gòu)，可通過提供氫原子或電子有效清除自由基，直接參與體內(nèi)的抗氧化過程[5]。如表1所示，卷丹鱗莖提取物總酚含量為48.78 mg/g。HPLC共鑒定出10種酚類物質(zhì)，包括2種酚酸(綠原酸、對香豆酸)、2種黃烷醇單體(兒茶素、表兒茶素)、2種黃酮醇(蘆丁、山奈酚)、2種黃烷酮醇(二氫楊梅酮、二氫槲皮素)、1種黃烷酮(圣草酚)和1種花青素(矢車菊素蕓香糖苷)。這10種多酚單體含量總和為10.69 mg/g，占總酚含量的21.91%,其中表兒茶素(4.58 mg/g)、蘆丁(3.10 mg/g)和二氫槲皮素(1.45 mg/g)含量較高，為卷丹鱗莖中主要的酚類物質(zhì)。

表1 卷丹鱗莖中總酚含量、多酚組分及其含量
Table 1 Content of total phenols and individual phenolic compound from bulbs ofLiliumlancifoliummg/g

2.2 卷丹鱗莖多酚提取物的抗氧化活性

2.2.1 對ABTS自由基的清除能力 ABTS·法是一種快速、簡便，廣泛應(yīng)用于日常檢測的分光光度分析法。ABTS陽離子自由基是ABTS原液與過硫酸鉀黑暗中反應(yīng)12 h以后產(chǎn)生的，其溶液呈綠色，在734 nm處有最大吸光值。在供氫抗氧化劑加入后，ABTS中單電子配對褪色。由圖1可知，卷丹鱗莖多酚提取物對ABTS·的清除作用與多酚質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系，ABTS·清除率(y)與多酚質(zhì)量濃度(x)的線性方程為y=13.68x-6.356，R2值為0.964。

2.2.2 對DPPH自由基的清除能力 DPPH自由基是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，其醇溶液呈紫色，在517 nm處有較強(qiáng)吸收，與樣品提供的氫原子反應(yīng)后吸光值變小。因此，測定樣品的DPPH·清除率可簡便準(zhǔn)確地評價(jià)其抗氧化能力。圖2表明，卷丹鱗莖多酚提取物對DPPH·的清除作用明顯，清除率隨多酚提取物質(zhì)量濃度增加而加大，DPPH·清除率(y)與多酚質(zhì)量濃度(x)的線性方程為y=17.24x-15.72，R2值為0.992。

2.2.3 對羥自由基的清除能力 羥自由基是生物體內(nèi)非常活躍的自由基，對機(jī)體危害很大，可穿過細(xì)胞膜與絕大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等反應(yīng)，造成細(xì)胞死亡和組織損傷[12]。本試驗(yàn)用EDTA二價(jià)鐵鹽與雙氧水生成羥自由基，水楊酸作為OH·的捕捉劑，通過比色法定量測定OH·的產(chǎn)率及卷丹鱗莖對OH·的清除作用。結(jié)果(圖3)表明，卷丹鱗莖多酚提取物對OH·的清除率隨多酚提取物質(zhì)量濃度增加明顯增大，OH·清除率(y)與多酚質(zhì)量濃度(x)的線性方程為y=12.13x+2.720，R2值為0.838。

3 討 論

多酚物質(zhì)具有2個(gè)或多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，易溶于有機(jī)溶劑，甲醇是應(yīng)用最廣泛的多酚提取溶劑。Cai等[10]用相同的Folin-Ciocalteau法測定了112種中國傳統(tǒng)中草藥藥用部位的總酚含量。本研究中卷丹鱗莖的多酚含量(48.78 mg/g)高于文獻(xiàn)[10]中的95種中草藥，僅低于五倍子、石榴皮等17種中草藥。陸英等[11]以百合(Liliumbrownii)鱗莖為材料，用甲醇回流提取，并利用大孔吸附樹脂對提取物進(jìn)行純化后測得其多酚含量為6.68%，高于本研究中卷丹的多酚含量(4.88%)，其原因主要與純化效果有關(guān)。

本研究通過HPLC從卷丹鱗莖中鑒定出10種酚類物質(zhì)，其中表兒茶素、蘆丁和二氫槲皮素是主要的酚類物質(zhì)。表兒茶素已被證明具有強(qiáng)的抗氧化性，能夠清除體內(nèi)羥自由基、超氧化物和過氧化氫自由基，具有降低血脂的作用[12]。蘆丁可有效抑制細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化過程，具有保護(hù)組織黏膜和增強(qiáng)血管活性的作用[13]。Francis等[14]報(bào)道，麝香百合花瓣的有效藥用成分主要是山奈酚和槲皮素，其能夠有效清除自由基并抑制環(huán)氧合酶的表達(dá)，從而減輕人體炎癥，這2種物質(zhì)在卷丹鱗莖中均被檢測到。但本試驗(yàn)僅對卷丹鱗莖的多酚粗提物及其體外抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，對于多酚單體的體內(nèi)抗氧化活性還有待進(jìn)一步研究。

靳磊等[15]研究了宜昌百合3個(gè)生態(tài)型的鱗莖多酚提取物對DPPH·和OH·的清除能力，在相同質(zhì)量濃度(2 mg/mL)下，卷丹鱗莖多酚提取物對DPPH·的清除能力(41.75%)高于西鄉(xiāng)縣宜昌百合(40.04%)、立節(jié)鎮(zhèn)宜昌百合(32.29%)，但是低于留壩縣宜昌百合(44.34%)[15]；而對OH·的清除率均高于3種宜昌百合。這表明不同百合品種鱗莖多酚提取物抗氧化能力存在差異，卷丹鱗莖多酚提取物對OH·的清除能力更強(qiáng)。周中流等[16]比較了卷丹鱗莖乙醇提取物及不同極性部位的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)卷丹抗氧化活性部位主要集中在乙酸乙酯和正丁醇提取部位。

4 結(jié) 論

卷丹鱗莖富含多酚物質(zhì)， HPLC共檢測出10種酚類物質(zhì)，其中表兒茶素、蘆丁和二氫槲皮素是其主要成分。多酚提取物對ABTS·、DPPH·和OH· 3種自由基具有明顯的清除能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。因此將卷丹鱗莖作為功能性食品和天然抗氧化劑，有較好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

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Phenolic composition and antioxidant activity of polyphenols from bulbs ofLiliumlancifoliumThunb

JIAO Hao-lina,ZHANG Yan-longa,NIU Li-xinb

(aCollegeofForestry,bCollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 Phenolic compounds extracted from bulbs ofLiliumlancifoliumThunb were investigated and their antioxidant activity was evaluated to provide basis for further development and application.【Method】 ABTS radical-scavenging,DPPH radical-scavenging and hydroxyl radical-scavenging assay were carried out to evaluate the antioxidant activities,total phenolic content was measured using the Folin-Ciocalteau method and phenolic composition was identified by HPLC.【Result】 The total phenolic content fromLiliumlancifoliumbulbs was 48.78 mg/g.A total of ten phenolic compounds were identified and quantified,in which (-)-epicatechin,rutin and dihydroquercetin were the major compounds with contents of 4.58,3.10,and 1.45 mg/g,respectively.The bulb extracts exhibited strong radical scavenging capacities to ABTS·,DPPH·,and OH· radical,and the activities positively correlated with mass concentration of phenolic compounds withR2value of 0.964,0.992 and 0.838,respectively.【Conclusion】 The bulb extracts ofLiliumlancifoliumThunb had significant antioxidant capacity and could be a potential nature source of antioxidants.

LiliumlancifoliumThunb;antioxidant activity;phenols;HPLC

2014-01-02

陜西省林業(yè)廳項(xiàng)目(陜林計(jì)字[2011]70號(hào))

焦灝琳(1989-)，女，陜西西安人，碩士，主要從事百合鱗莖抗氧化活性研究。E-mail:njaujiaohaolin@163.com

張延龍(1964-)，女，陜西延安人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事園林植物資源與育種研究。 E-mail:zhangyanlong@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.013

S682.2+65

A

1671-9387(2015)07-0150-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.013.html