秦曉藝，王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642 )

杏鮑菇采后木質(zhì)化相關(guān)基因?qū)崟r定量PCR中內(nèi)參基因的選擇

秦曉藝，王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642 )

【目的】 篩選出合適的內(nèi)參基因，為分析不同貯藏時期杏鮑菇(Pleurotuseryngii)子實體中木質(zhì)化相關(guān)基因的表達(dá)提供支持?！痉椒ā?以4 ℃低溫貯藏0，3，6，9，12，15和18 d的杏鮑菇子實體為材料，采用實時熒光定量 PCR(Quantitative real-time PCR，RT-qPCR)技術(shù)，分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH5個候選內(nèi)參基因在不同貯藏時期杏鮑菇的表達(dá)情況；通過GeNorm和NormFinder 2種軟件篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；選取最佳內(nèi)參基因，采用相對表達(dá)定量法對木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，即苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse，PAL)基因的表達(dá)進行定量分析。【結(jié)果】 5個內(nèi)參基因均能特異擴增， 其中GAPDH基因表達(dá)豐度較低，不適合用作內(nèi)參基因；經(jīng)GeNorm 軟件分析計算，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定度平均值M分別為0.527，0.527，0.584，0.875，最適內(nèi)參基因組合為β-actin、β-tubulin和ELF；由NormFinder 軟件分析計算，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA穩(wěn)定值S分別為0.221，0.356，0.583，1.092，β-actin穩(wěn)定性最高；綜合分析認(rèn)為β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性最高，為最佳內(nèi)參基因；以β-actin為內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)4 ℃低溫貯藏3，6，9，12，15和18 d的杏鮑菇子實體中PAL基因表達(dá)量分別比新鮮樣品(0 d)增加了11.3%，10.8%，11.3%，11.5%，11.4%，10.7%?！窘Y(jié)論】β-actin可作為杏鮑菇子實體采后貯藏條件下品質(zhì)變化相關(guān)基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

杏鮑菇；采后木質(zhì)化；內(nèi)參基因；實時定量PCR

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側(cè)耳，隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、無隔擔(dān)子菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種[1]。隨著杏鮑菇栽培和供應(yīng)量的大幅增加，如何在采后貯藏中保持鮮菇的品質(zhì)已成為杏鮑菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，采后貯藏條件下的杏鮑菇容易發(fā)生由木質(zhì)化引起的質(zhì)地劣變。發(fā)生木質(zhì)化劣變的杏鮑菇子實體中木質(zhì)素的含量顯著增加，硬度上升，韌性增強，嚴(yán)重影響其質(zhì)地和口感，降低其食用價值和商品價值。木質(zhì)化的發(fā)生與植物組織細(xì)胞壁中木質(zhì)素的沉積有關(guān)，而木質(zhì)素的生成由一系列酶來調(diào)控[2]。因此，研究不同貯藏時期杏鮑菇中與木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況對闡明木質(zhì)化發(fā)生的分子機制尤為重要。

在現(xiàn)有的基因表達(dá)分析方法中，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)具有靈敏性高、特異性強、快速準(zhǔn)確等特點[3-4]，已成為基因表達(dá)定量分析的首選方法，廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)基因功能的研究[5-6]。然而，在基因表達(dá)分析中，有很多可變參數(shù)需要加以控制，如起始RNA的質(zhì)量和數(shù)量、反轉(zhuǎn)錄合成效率及擴增效率等，這些因素都有可能導(dǎo)致RT-qPCR分析結(jié)果產(chǎn)生差異[7]。因此，需要引入合適的內(nèi)參基因?qū)悠愤M行歸一化處理，然后再對目的基因的表達(dá)量進行分析。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同試驗條件下和不同細(xì)胞或組織中均能夠恒定表達(dá)。實際研究中通常選用持家基因作為內(nèi)參基因，如α微管蛋白和β微管蛋白基因(α-tubulin、β-tubulin)、β肌動蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、延伸因子1(ELF)、多聚泛素酶基因(UBQ)以及18S核糖體RNA基因(18SrRNA)等[8]。但任何一種持家基因的穩(wěn)定表達(dá)都是在一定條件下相對穩(wěn)定，因此在應(yīng)用RT-qPCR分析基因表達(dá)的研究時，必須根據(jù)不同樣品和不同的試驗條件，選擇出相對合適的內(nèi)參基因及其數(shù)目，進行數(shù)據(jù)的校正和標(biāo)準(zhǔn)化，才能對目的基因表達(dá)進行準(zhǔn)確可靠的定量[9]。目前，內(nèi)參基因的篩選在靈芝(Ganodermalucidum)[10-11]、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)和肺形側(cè)耳(Pleurotuspulmonarius)[12]、白靈側(cè)耳(Pleurotuseryngiivar.tuoliensisC.J. Mou)[13]、草菇(Volvariellavolvacea)[14-15]等食用菌上已有一些報道，但多是采用半定量RT-PCR技術(shù)分析食用菌液體培養(yǎng)或生長發(fā)育過程中候選內(nèi)參基因或目的基因的轉(zhuǎn)錄特征，尚未見與食用菌采后貯藏品質(zhì)變化相關(guān)內(nèi)參基因的研究報道。為此，本研究以不同貯藏時期的杏鮑菇子實體為材料，選擇β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH5個常用的持家基因，采用RT-qPCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm[7]和 NormFinder[16]分析軟件對5個候選基因在不同貯藏時期杏鮑菇中的表達(dá)穩(wěn)定性進行評價，篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并分析本課題組克隆的木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PAL(GenBank：KF938514)在不同貯藏期的相對表達(dá)模式，以期為后續(xù)杏鮑菇采后木質(zhì)化衰敗相關(guān)基因的表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用杏鮑菇采于廣東藍(lán)田農(nóng)業(yè)有限公司。選取大小均勻、品質(zhì)良好的杏鮑菇用保鮮袋包裝不密封，貯藏溫度為4 ℃，相對濕度為98%。每隔3 d取1次樣，取樣位置均為距離菌蓋1 cm處。取樣后立即用液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

分別取 100 mg貯藏0，3，6，9，12，15，18 d的杏鮑菇子實體組織樣品，在無菌研缽中用液氮研磨成粉末，按照 E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit(Omega公司)試劑盒說明書提取總 RNA，采用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳(6 V/cm，恒壓)檢測其完整性，并用NanoDrop核酸濃度測定儀測定其濃度，根據(jù)A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm確定 RNA 的純度。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA時，按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa 公司)試劑盒的操作說明，在10 μL的反應(yīng)體系中依次加入dNTP Mixture(10 mmol/L) 1 μL，Oligo dT Primer(2.5 μmol/L) 1 μL，Total RNA(1 000 ng/μL) 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，瞬時離心混勻，65 ℃變性退火5 min，冰浴條件下再在上述反應(yīng)液中加入5×PrimeScript?Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL，PrimeScript?RTase(for 2 step)0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，30 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃反應(yīng)30 min，95 ℃反應(yīng)5 min使酶失活，所得產(chǎn)物即為初始cDNA，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和基因表達(dá)穩(wěn)定性的分析。

1.3 引物設(shè)計及qPCR

根據(jù)相關(guān)研究文獻(xiàn)[10-11,15]，選取了5個候選內(nèi)參基因，包括β-肌動蛋白基因(β-actin)、18S核糖體RNA基因(18SrRNA)、β-微管蛋白基因(β-tubulin)、延伸因子 1(ELF)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。根據(jù)NCBI中已公布的杏鮑菇及與其同源性較高的序列，用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計5個內(nèi)參基因以及PAL基因特異性引物序列(表1)，并驗證引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。引物合成和擴增產(chǎn)物的基因序列測定均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

RT-qPCR 反應(yīng)體系為 20 μL：熒光染料iQTMSYBR?Green Supermix (2×)10 μL ，雙蒸水7.2 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，混勻。反應(yīng)在熒光定量PCR管(TLS-0851， BIO-RAD公司)和CFX96 Connect實時熒光定量PCR 儀(BIO-RAD公司)上進行，經(jīng)摸索和優(yōu)化，最終確定的實時熒光定量 PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 10 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸15 s，50 個循環(huán)；最后在 65～95 ℃監(jiān)測熔解曲線過程，每 0.5 ℃進行 1 次熒光監(jiān)測。經(jīng)熔解曲線分析確認(rèn)所設(shè)計的引物無非特異擴增及引物二聚體后，將cDNA 模板按 1∶5 梯度稀釋成 5 個濃度梯度進行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，并計算不同引物的擴增效率。每個處理進行 3 次重復(fù)，對照用已經(jīng)處理過的滅菌水代替模板。數(shù)據(jù)讀取由實時熒光定量PCR儀自動完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

依據(jù)公式Q=EΔCt，應(yīng)用 Excel 2003軟件，計算每個擴增樣品的Ct值所對應(yīng)的相對表達(dá)量Q值。其中E為基因擴增效率(一般情況下將基因擴增設(shè)為理想擴增，E值默認(rèn)為2)，ΔCt=Ctmin-Ct樣品(Ctmin為全部樣品中最低Ct值，Ct樣品為各樣品的Ct值)[17]。

將相對定量數(shù)據(jù)導(dǎo)入 GeNorm軟件(http://medgen.ugentbe/～jvdesomp/genorm)，分析得到不同貯藏期杏鮑菇中各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度平均值(M)并進行排序(M值越低，基因表達(dá)越穩(wěn)定)。此外，用GeNorm軟件分析內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異值Vn/(n+1)值，以 0.15 為默認(rèn)取舍值[18]，確定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目(即當(dāng)Vn/(n+1)大于0.15，則有必要引入第n+1個基因作為RT-qPCR 定量分析的內(nèi)參基因，反之，則不必使用 ≥n+1 個基因作為內(nèi)參基因)[19]。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入NormFinder軟件(http://www.mdl.dk/publicationsnorm finder.htm)，分析得到不同貯藏期杏鮑菇中各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值(S)并得出最穩(wěn)定的基因(S值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定)[20]。綜合2種軟件分析結(jié)果，確定不同貯藏期杏鮑菇中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。選取最佳內(nèi)參基因，采用相對表達(dá)定量法(2-ΔΔCt法)對目的基因PAL在不同貯藏期杏鮑菇中的基因表達(dá)進行定量分析，其中，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇子實體總 RNA 的提取及品質(zhì)檢測

不同貯藏期杏鮑菇子實體總RNA的電泳結(jié)果見圖1。

圖1結(jié)果顯示28S rRNA、18S rRNA 和 5S rRNA 3 條帶，其中 28S rRNA和 18S rRNA 條帶明亮，5S rRNA 條帶較暗淡，說明RNA 完整性較好。測定其濃度時，A260 nm/A280 nm為1.8～2.2，A260 nm/A230 nm為2.0～2.4，說明所測定貯藏0，3，6，9，12，15，18 d的7種杏鮑菇的RNA純度和質(zhì)量均較好。綜上所述，提取的杏鮑菇子實體總 RNA可以用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和基因表達(dá)穩(wěn)定性的分析

2.2 杏鮑菇5個候選內(nèi)參基因的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

對5個候選內(nèi)參基因的熔解曲線進行分析，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)其熔解曲線均為單峰，反應(yīng)過程中無非特異性擴增和引物二聚體，說明這5個基因引物特異性良好。將7個不同貯藏期杏鮑菇cDNA 模板按 1∶5 梯度分別稀釋成相同倍數(shù)的濃度梯度，以Ct值為縱坐標(biāo)，相對拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)進行相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，結(jié)果(表2)表明，除GAPDH外其他基因的擴增效率為 99.4%～105.0%，決定系數(shù)為 0.999～1.000。非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，5個候選內(nèi)參基因的擴增片段條帶整齊，無可見引物二聚體。

經(jīng)熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的共同分析，除GAPDH外，所設(shè)計的 4 個內(nèi)參基因引物均符合 RT-qPCR 試驗要求。而GAPDH經(jīng)普通PCR擴增后在110 bp左右有1條單一較亮的帶，說明引物特異性良好，但在RT-qPCR中直到33個循環(huán)后才起峰，擴增效率低，分析其原因可能是GAPDH為糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶[22]，GAPDH主要是在物質(zhì)合成時表達(dá)較高，而在貯藏階段主要以降解為主，基因表達(dá)豐度較低，不適合用作內(nèi)參基因。

2.3 杏鮑菇4個候選內(nèi)參基因的Ct值穩(wěn)定性評價

以不同貯藏期的杏鮑菇cDNA為模板進行RT-qPCR，得Ct值如圖4所示。從圖4可以看出， 不同貯藏期的杏鮑菇在擴增同一基因，或同一貯藏期的杏鮑菇在擴增4種不同基因時，Ct值均有明顯差異，其原因主要是不同組織同一基因以及同一組織不同基因的表達(dá)強度均有所不同。用Excel 2003對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示同一擴增反應(yīng)的3個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差很小，Ct值非常接近，說明擴增反應(yīng)重復(fù)性好，能準(zhǔn)確反映基因的轉(zhuǎn)錄水平。

2.4 杏鮑菇4個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價

經(jīng)GeNorm 軟件分析計算，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定度平均值M由低到高分別為0.527，0.527，0.584，0.875。由此可見，穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因是β-actin和β-tubulin，而ELF和18SrRNA穩(wěn)定性較差。分析內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異值Vn/(n+1)，結(jié)果(圖6)表明：Vn/(n+1)均大于 0.15，其中V2/3=0.185>0.15，所以若選用多個內(nèi)參基因校正杏鮑菇不同貯藏期 mRNA 的表達(dá)水平，理想的內(nèi)參基因數(shù)目為 3個，由此建議選用β-actin、β-tubulin和ELF組合。

用NormFinder 軟件分析內(nèi)參基因的原理是根據(jù)基因表達(dá)穩(wěn)定值S的大小衡量，與GeNorm 軟件分析類似，穩(wěn)定值S越小，其內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越大，但該軟件不能預(yù)測內(nèi)參基因組合的數(shù)目。 NormFinder軟件分析結(jié)果(圖7)顯示，在杏鮑菇7個不同貯藏期，4 個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值S為β-actin(0.221)<β-tubulin(0.356)

由于軟件間的算法和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同，不同軟件得出同一內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性不一致，因此評估內(nèi)參基因時宜綜合分析后進行排序比較[23]。由GeNorm軟件分析得出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-actin、β-tubulin和ELF，最合適的內(nèi)參基因數(shù)目為3個；通過NormFinder軟件評價得到的最穩(wěn)定內(nèi)參基因為β-actin，所以結(jié)合2種軟件分析結(jié)果確定選用β-actin作為內(nèi)參基因,用于校正實時熒光定量分析中目的基因PAL的表達(dá)。

2.5 杏鮑菇中PAL相對表達(dá)模式

苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，是木質(zhì)素和多酚類物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶[2]。根據(jù)杏鮑菇內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用相對表達(dá)定量法(2-ΔΔCt法)，檢測杏鮑菇不同貯藏時間(3，6，9，12，15 和18 d)PAL基因相對于新鮮樣品(0 d)基因表達(dá)量(默認(rèn)為 1)的變化，結(jié)果如圖8 所示。由圖8可以看出，與新鮮樣品相比，PAL在貯藏期間(3，6，9，12，15 和18 d)的相對表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。其中在0～3 d的相對表達(dá)量升高到1.11，3～6 d又有所降低，之后又開始上升，至12 d升至最高值1.12，12～18 d又有一定幅度的下降，貯藏終點時相對表達(dá)量為1.11，其變化趨勢與試驗中測得的木質(zhì)素含量的變化趨勢相似。此外，低溫貯藏期間杏鮑菇中多酚含量也顯著高于新鮮樣品，這可能是PAL基因表達(dá)量在貯藏期間一直處于較高水平的原因之一。

圖7 候選內(nèi)參基因在不同貯藏期杏鮑菇中表達(dá)穩(wěn)定值的NormFinder分析
Fig.7 Stability values of candidate reference genes ofPleurotuseryngiiat different storage periods analyzed by NormFinder

圖8 不同貯藏期杏鮑菇中PAL基因相對表達(dá)量的比較
Fig.8 Relative expression levels ofPALinPleurotuseryngiiat different storage periods

3 結(jié)論與討論

實時熒光定量PCR是分析基因表達(dá)的一種有效方法，選用一種合適的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量進行校正可以提高該方法的靈敏度和重復(fù)性[6]，因此在基因相對表達(dá)研究中選擇合適的內(nèi)參基因十分關(guān)鍵?？捎糜谠u價內(nèi)參基因穩(wěn)定性的方法較多，如qBasePlus軟件[24]、REST軟件[25]、BestKeeper軟件[26]等。由于穩(wěn)定的內(nèi)參基因并不多，多數(shù)內(nèi)參基因在不同的組織、細(xì)胞及不同條件下的轉(zhuǎn)錄量并不恒定，甚至差別很大[27]，因此為了保證定量 PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性，內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定性非常重要。本試驗采用RT-qPCR技術(shù)，并結(jié)合GeNorm 、NormFinder 2種軟件，對β-actin、ELF、β-tubulin、18SrRNA和GAPDH5個常用內(nèi)參基因在不同貯藏期杏鮑菇中的表達(dá)穩(wěn)定性進行綜合評估，篩選出最佳內(nèi)參基因，用于木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因——PAL相對表達(dá)模式的分析。

本試驗選用GeNorm 、NormFinder 2種軟件對經(jīng)杏鮑菇qPCR分析后的β-actin、ELF、β-tubulin和18SrRNA4 種候選內(nèi)參基因在不同貯藏時期的表達(dá)穩(wěn)定性進行綜合評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18SrRNA、β-tubulin和ELF在杏鮑菇不同貯藏期的表達(dá)穩(wěn)定性均較差，不適合作為內(nèi)參基因，而β-actin表達(dá)最穩(wěn)定，為理想的內(nèi)參基因。本研究中選用β-actin作為內(nèi)參基因，建立了一種杏鮑菇不同貯藏時期基因相對表達(dá)量的研究體系，通過木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因PAL的 RT-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)PAL在貯藏期間(3，6，9，12，15，18 d)表達(dá)顯著上調(diào)，說明PAL可能在采后杏鮑菇木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮著重要作用。

Jain等[28]通過對水稻(Oryzasativa)中10個常用內(nèi)參基因的考察，發(fā)現(xiàn)eEF-1α在不同組織中的表達(dá)較一致，18SrRNA在不同環(huán)境處理下表達(dá)較穩(wěn)定；李冉等[29]發(fā)現(xiàn)，水稻經(jīng)機械損傷處理、二化螟處理、稻縱卷葉螟處理后最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次為eEF-1α、25SrRNA和Actin；蔣曉梅等[30]以柳枝稷根組織為材料，同樣發(fā)現(xiàn)在不同的非生物環(huán)境脅迫條件下，最適合的內(nèi)參基因各不相同；Reid等[31]發(fā)現(xiàn)，在葡萄漿果發(fā)育期間GAPDH表達(dá)水平總是保持一致，Gu等[32]在高溫脅迫處理下的菊花中也得到相似的結(jié)論。孫美蓮等[33]利用熒光定量PCR分析茶樹不同器官組織中的基因表達(dá)差異時，發(fā)現(xiàn)α-tubulin和18SrRNA的穩(wěn)定性都不如β-actin，而比較不同成熟度的葉片和愈傷組織時，GAPDH比18SrRNA和β-actin表達(dá)更穩(wěn)定。侯志強等[34]對不同脅迫條件下鮮切馬鈴薯中 4 個常用內(nèi)參基因的表達(dá)分析表明，β-actin基因表達(dá)相對穩(wěn)定，EF1α最不穩(wěn)定。由此可見，在實際研究中內(nèi)參基因只是細(xì)胞處于特定條件下的相對穩(wěn)定表達(dá)[35]。

本研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)內(nèi)參基因β-actin在不同貯藏時期杏鮑菇組織中的表達(dá)相對穩(wěn)定，而18SrRNA、ELF、β-tubulin和GAPDH4種候選基因表達(dá)則不穩(wěn)定。同時，應(yīng)用GeNorm、NormFinder 2種軟件篩選出低溫貯藏杏鮑菇最合適的內(nèi)參基因，對后續(xù)研究杏鮑菇木質(zhì)化相關(guān)酶基因以及其他未知功能基因與木質(zhì)化的聯(lián)系具有重要意義。

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Selection of reference gene for quantitative real-time PCR analysis of lignification related genes in postharvestPleurotuseryngii

QIN Xiao-yi,WANG Jie

(CollegeofFoodScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

【Objective】 The objective of this experiment was to select suitable reference gene to support analysis of the expression of lignification related genes inPleurotuseryngiiat different storage periods.【Method】 In this study,quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was used to analyze the mRNA expression of five candidate reference genes,β-actin,18SrRNA,β-tubulin,ELFandGAPDH,inPleurotuseryngiistored at 4 ℃ for different periods (0,3,6,9,12,15 and 18 d).The most stable genes were selected by GeNorm and NormFinder.Then,with the relative quantification method,the expression of Phenylalanina ammonia-lyse (PAL),a key enzyme in lignin biosynthesis pathway,was valuated.【Result】 All of the five reference genes could amplify specially.GAPDHwas unsuitable because of its less abundant expression.Mean stabilities ofβ-actin,β-tubulin,ELF,and 18SrRNAwere 0.527,0.527,0.584,and 0.875,analyzed by GeNorm,respectively.The optimum reference genes were a combination ofβ-actin,β-tubulinandELF.Stability values ofβ-actin,β-tubulin,ELF,and 18SrRNAanalyzed by NormFinder were 0.221,0.356,0.583,and 1.092,andβ-actinwas the most stable one.Comprehensive analysis showed thatβ-actinwith the highest stability was the most suitable gene.Then usingβ-actinas the reference gene,relative changes ofPALexpression inPleurotuseryngiiat different storage periods (3,6,9,12,15 and 18 d) increased significantly (11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,and 10.7%,respectively) compared to fresh sample (0 d).【Conclusion】β-actinwas the most suitable reference gene to normalize mRNA levels of quality related genes inPleurotuseryngii.

Pleurotuseryngii;postharvest lignification;reference gene;quantitative real-time PCR

2014-04-18

國家自然科學(xué)基金項目(31101589)；廣東省科技計劃項目(2011B020310006)

秦曉藝(1990-)，女，河南三門峽人，碩士，主要從事食用菌生理生化及分子生物學(xué)研究。 E-mail：qinxiaoyi0503@163.com

王 杰(1978-)，女，河南駐馬店人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事食藥用真菌生物工程研究。 E-mail：wjcasey@scau.edu.cn

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.024

Q789;S646

A

1671-9387(2015)07-0219-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.024.html