林麗飛，唐寶林，羅 冰，王傳銘，金 秋，劉艷紅，張燦邦

(1 云南紅河學(xué)院 云南省農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自661100；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明650201；3 建水縣臨安鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 建水654399)

He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花組培體系的影響

林麗飛1，2，唐寶林3，羅 冰1，王傳銘1，金 秋1，劉艷紅1，張燦邦1

(1 云南紅河學(xué)院 云南省農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自661100；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明650201；3 建水縣臨安鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 建水654399)

【目的】 研究He-Ne激光輻照不同時(shí)間對(duì)燈盞花組織培養(yǎng)的影響，為燈盞花的開發(fā)利用提供參考?！痉椒ā?以燈盞花的種子、無(wú)菌培養(yǎng)苗、葉片、愈傷組織及芽為材料，用He-Ne激光輻照不同時(shí)間(種子分別為0(CK)，0.5，1，5，10 min；葉片分別為0(CK)，2，4，6，8 min；愈傷組織分別為0(CK)，1，2，3，4，5，6，7，8 min；分化芽分別為0(CK)，0.5，1，2，3，6 min；根分別為0(CK)，0.5，1，2 min)，分析He-Ne激光輻照對(duì)各組織的影響，篩選最佳輻照時(shí)間?！窘Y(jié)果】 He-Ne激光輻照1 min能夠提高燈盞花種子活力；誘導(dǎo)愈傷組織初期，較適宜的輻照時(shí)間是2 min，繼代后以輻照8 min的愈傷組織生長(zhǎng)最好；愈傷組織增殖培養(yǎng)時(shí)，輻照4 min效果最佳；誘導(dǎo)芽輻照3 min較適宜；生根培養(yǎng)以輻照2 min較好?！窘Y(jié)論】 一定量的He-Ne激光能夠提高燈盞花種子的萌發(fā)率、出愈率及愈傷組織誘導(dǎo)芽和生根效果。

He-Ne激光；燈盞花；組織培養(yǎng)；生理指標(biāo)

燈盞花學(xué)名短葶飛蓬[Erigeronbreviscapus(Vaniot) Hand.-Mazz]，屬菊科(Compositae) 飛蓬屬(Erigeron)植物，全草入藥，中藥名“燈盞細(xì)辛”，已入《中華人民共和國(guó)藥典》，自被1974年出版的《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》收錄以來(lái)，燈盞花被云南省制藥工業(yè)廣泛用作制藥原料，但燈盞花種子癟粒多，繁殖系數(shù)低，難以滿足市場(chǎng)需求。

激光誘變于20世紀(jì)60年代初興起， 并在水稻、豆類、花生等許多植物上都取得了重要的進(jìn)展[1-5]。研究表明，激光輻照可提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)等，并可改善植物葉片葉綠素含量，提高種子活性，增強(qiáng)光合作用強(qiáng)度和一些生物酶活性，有利于植物生長(zhǎng)，從而達(dá)到增產(chǎn)的目的[6-13]。當(dāng)激光作用于生物組織時(shí)，在波長(zhǎng)、照射時(shí)間、能量密度、功率等參量中，照射時(shí)間是決定性參量[14]。目前有關(guān)激光對(duì)燈盞花影響的研究鮮見報(bào)道[15]。因此，本試驗(yàn)用He-Ne 激光器，以不同的誘變時(shí)間處理燈盞花種子及脫分化組織，選育出了優(yōu)良細(xì)胞系，并對(duì)其生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，篩選適宜的照射劑量，以期為燈盞花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

燈盞花種子購(gòu)于紅河千山生物資源公司，手工揀除其中不飽滿的種子和絨毛；燈盞花無(wú)菌培養(yǎng)苗、葉片、愈傷組織及芽來(lái)自于紅河學(xué)院組培室，培養(yǎng)條件為：溫度(25±2) ℃ ，光照時(shí)間16 h/d，光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx。

所用儀器：He-Ne激光器(南京教學(xué)儀器設(shè)備廠)，TU-1901型；OHAUS-AR1140電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。激光器參數(shù)為：波長(zhǎng)632.8 nm(電源型號(hào)IN-TTL)，光斑直徑80 mm，功率1.2 mW，輻照裝置如圖1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料消毒與培養(yǎng)基的制備 材料消毒與培養(yǎng)基制備參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；(2)增殖培養(yǎng)基：MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；(3)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg/L+10%香蕉汁；(4)生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.3 mg/L。

1.2.2 輻照劑量的優(yōu)化 選取飽滿燈盞花種子及接種好的外植體，用He-Ne激光進(jìn)行照射處理，輻照時(shí)間分別為種子0(CK)，0.5，1，5，10 min；葉片0(CK)，2，4，6，8 min；愈傷組織0(CK)，1，2，3，4，5，6，7，8 min；分化芽0(CK)，0.5，1，2，3，6 min；根0(CK),0.5,1,2 min。輻照時(shí)先用反光鏡反光，再經(jīng)過擴(kuò)束鏡使光斑擴(kuò)大，然后將種子平鋪于光斑內(nèi)進(jìn)行照射處理[17]。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子萌發(fā)率 將經(jīng)激光輻照的燈盞花種子接種到MS培養(yǎng)基上，每天觀察種子的萌發(fā)情況，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽速率、發(fā)芽指數(shù)等相關(guān)指標(biāo)[18-19]，測(cè)量數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行分析。

發(fā)芽率=正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽勢(shì)=規(guī)定時(shí)間(7 d)內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽速率=∑(Gt×Dt)/發(fā)芽率(式中Gt指7 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)，Dt指發(fā)芽日數(shù))；發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt。

1.3.2 愈傷組織出愈率、增長(zhǎng)率及誘導(dǎo)芽 將經(jīng)激光輻照處理的葉片接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，培養(yǎng)16和30 d時(shí)觀察愈傷組織的生長(zhǎng)情況，計(jì)算出愈率。出愈率=出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

將試驗(yàn)中輻照時(shí)間為0(CK)誘導(dǎo)出的愈傷組織0.5 g接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行激光輻照，培養(yǎng)30 d時(shí)測(cè)定愈傷組織鮮質(zhì)量，計(jì)算愈傷組織鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率。鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率=[(培養(yǎng)后的鮮質(zhì)量-接種時(shí)的鮮質(zhì)量)/接種時(shí)的鮮質(zhì)量]×100%。

將經(jīng)過增殖培養(yǎng)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，用激光照射0(CK)，0.5，1，2，3，6 min，培養(yǎng)10 和30 d時(shí)觀察芽生長(zhǎng)情況。

1.3.3 生根數(shù) 將經(jīng)激光輻照形成的無(wú)根苗接種到生根培養(yǎng)基上，30 d后觀察生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，He-Ne激光輻照不同時(shí)間對(duì)燈盞花種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽速率都會(huì)產(chǎn)生影響，隨輻照時(shí)間延長(zhǎng)，上述指標(biāo)均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且均在輻照1 min時(shí)達(dá)到最大值。He-Ne激光輻照處理燈盞花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽速率均高于對(duì)照，說(shuō)明He-Ne激光輻照有利于提高燈盞花種子的活力，最佳輻照時(shí)間為1 min。

2.2 He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

將經(jīng)He-Ne激光輻照的燈盞花葉片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果見表2和圖2。由表2和圖2可以看出，培養(yǎng)16 d后，均有少量愈傷組織形成，從出愈率看表現(xiàn)為2 min>0 min>8 min>6 min>4 min，從長(zhǎng)勢(shì)上來(lái)看表現(xiàn)為2 min>8 min>0 min>6 min>4 min，說(shuō)明愈傷組織誘導(dǎo)初期較好的輻照時(shí)間為2 min；培養(yǎng)30 d后，輻照0(CK)，2，8 min 的出愈率都達(dá)到100%，長(zhǎng)勢(shì)較好的為輻照8 min處理，經(jīng)過繼代后愈傷組織的增長(zhǎng)量最多，幾乎布滿整個(gè)瓶子，表明繼代后經(jīng)過8 min輻照的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)最好。

2.3 He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花愈傷組織增長(zhǎng)率的影響

從表3可以看出，繼代后的燈盞花愈傷組織經(jīng)He-Ne激光輻照后，愈傷組織的增長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。輻照4 min的愈傷組織鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率最大，為80.8%，其次為輻照1 min處理，為75.8%，表明4 min的輻照時(shí)間對(duì)燈盞花愈傷組織的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)。從表3還可以看出，輻照1，2，4和7 min愈傷組織的鮮質(zhì)量增加量均高于CK，其中以輻照4 min的愈傷組織鮮質(zhì)量增加量最大，為2.11 g，其次為1 min處理，達(dá)1.57 g。上述結(jié)果表明，He-Ne激光輻照4 min有利于愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

2.4 He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

從圖3可以看出，對(duì)輻照后的愈傷組織誘導(dǎo)芽，培養(yǎng)10 d后，輻照時(shí)間為0(CK)與3 min的愈傷組織均有芽形成，從芽的長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，CK優(yōu)于3 min處理，從形成的新愈傷組織來(lái)看，0.5 min輻照較好，輻照6 min也有新的愈傷組織形成，但是出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象。從表4可以看出，培養(yǎng)30 d之后，在輻照3 min處理下芽的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于0 min；從愈傷組織的生長(zhǎng)看，輻照2 min的有褐化出現(xiàn)，輻照6 min的愈傷組織較緊密，而輻照0.5 min的則只有新的愈傷形成，且形成的愈傷從疏松程度和增殖量來(lái)看都比其他處理好。說(shuō)明He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花愈傷組織分化有利，3 min的照射時(shí)間有利于芽的形成。

2.5 He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花生根培養(yǎng)的影響

將經(jīng)He-Ne激光輻照的愈傷組織形成的小植株誘導(dǎo)生根，30 d后輻照2 min處理的長(zhǎng)根最多，根為乳白色，細(xì)長(zhǎng)，幾乎布滿整個(gè)瓶底，植株生長(zhǎng)旺盛，長(zhǎng)葉較多，長(zhǎng)勢(shì)較好；輻照1 min的長(zhǎng)勢(shì)也好，但次于2 min處理；而輻照0.5 min處理的根短而粗壯，植株生長(zhǎng)旺盛，其中有幾片葉子較寬、厚，與其他葉片不同(圖4)。總體來(lái)看，以輻照2 min的長(zhǎng)勢(shì)最好。

3 討 論

He-Ne激光輻照種子后，種子及其萌發(fā)的植物體能產(chǎn)生各種各樣的非基因變異性表型效應(yīng)[14]。本研究結(jié)果表明，He-Ne激光輻照燈盞花種子不同時(shí)間后，燈盞花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽速率均高于對(duì)照，說(shuō)明He-Ne激光輻照有利于提高燈盞花種子的活力，輻照最佳時(shí)間為1 min，這與張舉成等[15]的研究結(jié)果一致。

用He-Ne激光輻照處理的葉片誘導(dǎo)愈傷組織，從出愈率及長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，愈傷組織誘導(dǎo)初期輻照2 min誘導(dǎo)效果好，而繼代后(30 d)則以輻照8 min的葉片所誘導(dǎo)的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)最好，增殖最快。

在燈盞花愈傷組織的增殖培養(yǎng)中，經(jīng)He-Ne激光輻照4 min后的愈傷組織較有利于增殖培養(yǎng)；有利于燈盞花愈傷組織分化芽的輻照時(shí)間為3 min；生根培養(yǎng)的輻照時(shí)間2 min較好。

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Influence of He-Ne laser on tissue culture ofErigeronbreviscapus

LIN Li-fei1,2,TANG Bao-lin3,LUO Bing1,WANG Chuan-ming1, JIN Qiu1,LIU Yan-hong1,ZHANG Can-bang1

(1KeyLabaoratoryforCropHighQualityCutltivationandSecuriyControlofYunnanProvince,YunnanHongheUniversity,Mengzi,Yunnan661100,China;2CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China;3ExtensionCentreofAgro-TechniqueofLin’an,Jianshui,Yunnan654399,China)

【Objective】 Experiment was carried out to study the effects of He-Ne laser on tissue culture system ofErigeronbreviscapusand improveE.breviscapusdevelopment and utilization.【Method】 Seeds,leaves,callus and roots were used as material and different irradiation times were set up.The irradiation times for germination of seed were 0(CK),0.5,1,5,and 10 min,for inducement of leaves were 0(CK),2,4,6,and 8 min,for callus were 0(CK),1,2,3,4,5,6,7,and 8 min,for callus were 0(CK),0.5,1,2,3,and 6 min while for rooting were 0(CK),0.5,1,and 2 min.Then effects of He-Ne laser irradiation were analyzed to select optimum irradiation times.【Result】 The suitable irradiation times for improving seed vigor,early to callus,successive culture to callus,during the multiplication culture,bud inducement,and root were 1 min,2 min,8 min,4 min,3 min,and 2 min,respectively.【Conclusion】 A certain dose of irradiation was suitable to improve rate of germination and growth of callus,shot,and root.

He-Ne laser;Erigeronbreviscapus;tissue culture;physiological indexes

2014-06-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61068003)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2009ZC131M)；第一批紅河學(xué)院中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目(2010PY0104)；紅河學(xué)院碩士點(diǎn)植物保護(hù)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

林麗飛(1978-)，女，云南建水人，副教授，在讀博士，主要從事植物保護(hù)、植物細(xì)胞工程研究。 E-mail:llf_biology2@126.com

張燦邦(1965-)，男，云南紅河人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事光學(xué)物理學(xué)研究。E-mail:cbzhanguoh@gmail.com

時(shí)間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.021

S567

A

1671-9387(2015)07-0207-06

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