劉秀明，楊文婷，張雪萌，焦重達，姚 娜，楊美英，官麗莉，李海燕，李校堃

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

紅花查爾酮異構(gòu)酶基因全長cDNA的克隆及表達分析

劉秀明a,b，楊文婷a,b，張雪萌b，焦重達b，姚 娜a，楊美英b，官麗莉a，李海燕a,b，李校堃a

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

【目的】 克隆紅花(CarthamustinctoriusL.)黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI)基因的全長序列，研究其組織表達特異性，為紅花代謝調(diào)控研究提供參考?！痉椒ā?利用RT-PCR技術(shù)克隆CHI基因的cDNA全長，并對其全長基因進行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其與相似序列的同源性；利用實時熒光定量 PCR方法，分析CHI基因在紅花不同開花時期的表達量?！窘Y(jié)果】CHI基因全長1 161 bp，開放閱讀框長654 bp，編碼217個氨基酸，理論分子質(zhì)量約為23.14 ku，等電點為5.67，序列含有典型的加尾信號序列AATAA和Poly(A)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，該基因與其他物種CHI基因具有較高的同源性，其中與青木香的同源性最高，達到82%。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，CHI基因在紅花花蕾期的表達量最高?！窘Y(jié)論】 克隆得到了紅花CHI基因，其在紅花花蕾期的表達量最高。

紅花；查爾酮異構(gòu)酶；cDNA克?。籸eal-time PCR

紅花(CarthamustinctoriusL.)屬菊科，為一年生草本植物。紅花具有活血通經(jīng)，去瘀療傷，宣毒透疹等功效，其主要有效成分為紅花黃色素和紅花紅色素[1]。紅花黃色素為紅花中多種水溶性查爾酮成分的混合物，是黃酮化合物中重要的一類，不但是很有價值的食用色素，而且具有活血通絡(luò)、消炎鎮(zhèn)痛等功效，在血管性疾病、高血壓、糖尿病并發(fā)癥等方面亦有重要療效[2]。查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI；EC5.5.1.6)是植物黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[3-4]，其在黃酮化合物合成中將查爾酮異構(gòu)化生成槲皮素[5]。因此，超表達查爾酮異構(gòu)酶基因，可以提高紅花黃酮化合物的含量，為大量生產(chǎn)紅花黃色素提供了可能。目前，國內(nèi)外關(guān)于查爾酮異構(gòu)酶的研究報道較多，主要集中在葫蘆巴[6]、青木香屬[7]、苜蓿[8]、水稻[9]、柑橘[10]、桑樹[11]、金花茶[12]、水仙[13]、花生[14]等多種作物上，而有關(guān)紅花中查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達分析尚未見報道。本研究克隆獲得了紅花中的CHI基因，并對其進行生物信息學(xué)分析，以期為提高紅花中黃酮化合物的含量及紅花代謝調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物 紅花(CarthamustinctoriusL.)“吉紅”早熟品種種子購自新疆紅花緣科技有限公司。

1.1.2 試 劑 RNA提取試劑盒(RP3301)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RP6601)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；克隆所用載體pEASY-T1 Simple Cloning Kit(CT111-01)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司；race試劑盒購自羅氏公司；熒光定量試劑盒(RR420A)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 紅花花瓣RNA提取及第一鏈cDNA的合成 選取紅花盛花期花瓣，迅速放于液氮中，用錫箔紙包好后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。RNA提取按照試劑盒操作說明進行，提取的RNA用核酸檢測儀檢測其純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于 -20 ℃冰箱中備用。

1.2.2CHI基因的克隆 根據(jù)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心實驗室紅花花瓣454測序結(jié)果中挑選的候選基因，設(shè)計特異性引物，驗證CHI基因的中間片段。根據(jù)驗證的CHI基因中間片段，以紅花cDNA為模板，設(shè)計引物進行全長基因克隆，所用引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，10×LA Buffer 5 μL，Primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，LATaq0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 將擴增出全長片段的CHI基因PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，用膠回收試劑盒回收目的片段，將其連接到pEASY-T1 Simple載體上，進行藍白斑篩選，菌液PCR鑒定和酶切鑒定后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

將測得的序列利用DNAMAN 軟件進行核苷酸序列編輯和氨基酸序列推導(dǎo)，在NCBI 網(wǎng)站上通過BLAST 搜索同源性序列，利用clustalW1.83軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用ProtParam 軟件(http://web.expasy.org/)分析編碼蛋白氨基酸序列的組成、相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)[15]。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 分別提取紅花花蕾期、初花期、盛花期和衰落期花瓣RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實時熒光定量分析。定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，DNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 3 s，62 ℃退火，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花花瓣總RNA的提取

核酸檢測儀檢測發(fā)現(xiàn)，提取的紅花花瓣RNA質(zhì)量濃度均在1 000 ng/μL左右。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，提取的紅花RNA有28S和18S 2條清晰帶，且28S條帶的亮度約為18S的2倍(圖1)。說明RNA提取完整，無降解，可以滿足后續(xù)試驗需要。

2.2 CHI基因中間片段的獲取及驗證

根據(jù)紅花花瓣454測序結(jié)果拼接比對，獲得了CHI基因的中間片段序列，通過RT-PCR擴增出209 bp的中間片段(圖2A)，經(jīng)過膠回收后連接到克隆載體pEASY-T1 Simple上，進一步通過菌液PCR(圖2B)和EcoRⅠ、Hand Ⅲ酶切鑒定(圖2C)，證實測序結(jié)果正確。

2.3 CHI基因cDNA克隆及序列分析

根據(jù)CHI基因209 bp的中間片段，以紅花花瓣cDNA為模板，分別設(shè)計引物進行3′race和5′race克隆，擴增出670 bp的3′端序列和636 bp的5′端序列。將測序結(jié)果利用DNAMAN進行拼接，得到紅花CHI基因的全長cDNA片段(圖3)。圖3顯示，CHI基因全長cDNA長度為1 161 bp。序列分析表明，該基因的開放閱讀框長654 bp，編碼217個氨基酸(圖4)，5′非翻譯區(qū)長度為250 bp，3′非翻譯區(qū)長度為257 bp，含有典型的加尾信號序列AATAA和Poly(A)。該基因所編碼的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量約為23.14 ku，等電點(pI)為5.67。帶負電荷殘基(Asp+Glu)共23個，總的帶正電荷殘基(Arg+Lys)共20個。將紅花CHI基因在NCBI上進行序列比對分析，搜索到青木香(Saussureamedusa)、大麗花(Dahliapinnata)、葡萄(Vitislabrusca)等21個物種的查爾酮異構(gòu)酶基因，利用clustalW1.83軟件進行多重序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖5)表明，紅花查爾酮CHI基因與青木香的同源關(guān)系最近，達到82%，與菊花和飛蓬的親緣關(guān)系也較近，說明克隆得到的基因確為紅花CHI基因。

圖3 紅花CHI基因全長序列的cDNA克隆
A.CHI基因3′端；B.CHI基因5′端；C.CHI基因全長;M.DL2000 Marker;1.3′race；2.5′race；3～5.cDNA ofCHI
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of cDNA ofCHIgene
A.PCR product ofCHIgene 3′ race；B.PCR product ofCHIgene 5′ race；C.PCR product ofCHIgene cDNA;
M.DL2000 Marker;1.3′ race；2.5′race；3-5.cDNA ofCHI

圖4 紅花CHI基因編碼的氨基酸序列
Fig.4 Amino acid sequence ofCHIgene of safflower

2.4 CHI基因在紅花中的表達特征

采集紅花不同開花時期的花瓣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以18S作為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量方法分析CHI基因在紅花不同開花時期的表達量，結(jié)果見圖6。由圖6可見，紅花CHI基因在花蕾期的表達量最高；其次為衰落期，幾乎是初花期表達量的17倍；表達量最低的是初花期。

3 討 論

CHI基因是黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶[16]，其催化查爾酮異構(gòu)化合成相應(yīng)的黃酮[17]。本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆得到紅花CHI基因的全長序列，且與其他物種CHI基因有較高的同源性。Park 等[18]研究表明，利用發(fā)根系統(tǒng)使黃芩中CHI基因超表達可以提高黃酮化合物的含量。Qin等[6]克隆了葫蘆巴CHI基因并在擬南芥突變體中表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化擬南芥植株的異黃酮含量比野生型擬南芥有較大提高。Zhang等[19]證實，CHI基因在黃酮化合物合成過程中具有重要的作用，甘草CHI基因在甘草發(fā)根中過量表達可明顯提高黃酮含量，這與CHI基因活性與轉(zhuǎn)錄水平的提高直接相關(guān)。Li等[7]的試驗證實，超表達青木香CHI基因是提高黃酮化合物產(chǎn)量的一個有效方法。

CHI基因存在組織表達特異性，不同組織部位表達不同。銀杏[17]CHI基因主要在葉片中表達，促進黃酮化合物積累合成，這與銀杏CHI基因啟動子區(qū)域功能是相關(guān)的。而巨峰葡萄[20]CHI基因在幼葉和幼根中都有表達，且在根中的表達受溫度誘導(dǎo)。本研究克隆的CHI基因在紅花花蕾期表達量最高，表明在花蕾期黃酮化合物的含量可能最高，這為后期研究該基因的超表達提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

從紅花中克隆得到了CHI基因的中間片段，進而獲得其全長cDNA序列，通過對基因全長序列的生物信息學(xué)分析及比對發(fā)現(xiàn)，其序列中含有典型的加尾信號序列AATAA和Poly(A)，且與其他物種的CHI基因具有較高的同源性。Real-time PCR結(jié)果表明，CHI基因在紅花花蕾期的表達量最高，說明該基因相關(guān)的黃酮化合物可能在花蕾期積累最多。

[1] 王巖軍.紅花的組織培養(yǎng)及基因工程研究進展 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,45(S1):237-241.

Wang Y J.Advance of research on tissue culture and gene engineering of safflower [J].Xinjiang Agricultural Sciences,2008,45(S1):237-241.(in Chinese)

[2] 田 蘭,吳桂榮,王 巖.紅花黃色素研究進展 [J].西北藥學(xué)雜志,2007,22(4):218-220.

Tian L,Wu G R,Wang Y.The progress of safflower yellow [J].Northwest Pharmaceutical Journal,2007,22(4):218-220.(in Chinese)

[3] 雒曉鵬,白悅辰,高 飛,等.金蕎麥查爾酮異構(gòu)酶的基因克隆及其花期表達與黃酮量分析 [J].中草藥,2013,44(11):1481-1485.

Luo X P,Bai Y C,Gao F,et al.Gene cloning and expression characterization of chalcone isomerase fromFagopyrumdibotrys[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2013,44(11):1481-1485.(in Chinese)

[4] 李 莉,孫 欣,馬君蘭,等.異黃酮合成代謝調(diào)控關(guān)鍵酶CHS、CHI的特性與研究前景 [J].大豆科學(xué),2007,26(5):762-765.

Li L,Sun X,Ma J L,et al.Progress on key enzymes CHS,CHI of isoflavones synthesize [J].Soybean Science,2007,26(5):762-765.(in Chinese)

[5] Yuan Y,Ma X H,Shi Y M,et al.Isolation and expression analysis of six putative structural genes involved in anthocyanin biosynthesis inTulipafosteriana[J].Scientia Horticulturae,2013,153:93-102.

[6] Qin J C,Zhu L,Gao M J.Cloning and functional characterizationof a chalcone isomerase fromTrigonellafoenum-graecumL. [J].Planta Med,2011,77(7):765-770.

[7] Li F,Jin Z,Qu W,et al.Cloning of a cDNA encoding theSaussureamedusachalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco [J].Plant Physiol Biochem,2006,44(7/8/9):455-461.

[8] Hur S,Newby Z E,Bruice T C.Transition state stabilization by general acid catalysis,water expulsion,and enzyme reorganization inMedicagosavitachalcone isomerase [J].Proc Natl Acad Sci,2004,101(9):2730-2735.

[9] Druka A,Kudrna D,Rostoks N,et al.Chalcone isomerase gene from rice (Oryzasativa) and barley (Hordeumvulgare):Physical,genetic and mutation mapping [J].Gene,2003,302(1/2):171-178.

[10] Wang Y,Li J,Xia R X.Expression of chalcne synthase and chalcone isomerase genes and accumulation of correspondi flavonoids during fruit maturation of Guoqing No.4 satsuma mandarin (CitrusunshiuMarcow) [J].Scientia Horticulturae,2010,125:110-116.

[11] 劉長英,趙愛春,李 軍,等.桑樹查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆與原核表達分析 [J].林業(yè)科學(xué),2013,49(2):39-45.

Liu C Y,Zhao A C,Li J,et al.Cloning and prokaryotic expression of chalcone isomerase gene from mulberry (Morusalba) [J].Scientia Silvae Inicae，2013,49(2):39-45.(in Chinese)

[12] 周興文,李紀(jì)元,范正琪.金花茶查爾酮異構(gòu)酶基因全長克隆與表達的初步研究 [J].林業(yè)科學(xué)研究,2012,25(1):93-99.

Zhou X W，Li J Y,Fan Z Q.Cloning and expression analysis of chalcone isomerase gene cDNA fromCamellianitidissima[J].Forest Research,2012,25(1):93-99.(in Chinese)

[13] 蔡雪玲,陳曉靜,葉一江,等.中國水仙查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆與表達分析 [J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(12):2287-2292.

Cai X L，Chen X J，Ye Y J,et al.Cloning and expression analysis of chalcone isomerase gene fromNarcissustazettavar.Chinensis [J].Chinese Journal of Tropical Crops,2011,32(12):2287-2292.(in Chinese)

[14] 溫世杰，邱金梅，劉海燕,等.花生查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及其序列分析 [J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(11):2084-2087.

Wen S J,Qiu J M,Liu H Y,et al.Cloning and sequence analysis of cDNA of chalcone isomerase gene from peanut (ArashypogaeaL.) [J].Chinese Journal of Tropical Crops,2011,32(11):2084-2087.(in Chinese)

[15] 呂娟娟,王進軍,高新菊,等.二斑葉螨乙酰輔酶A 羧化酶基因全長cDNA 克隆及其生物信息學(xué)分析 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(8):1736-1744.

Lü J J,Wang J J,Gao X J,et al.Cloning and bioinformatics analysis of Acetyl-CoA carboxylase gene cDNA inTetranychusurticae[J].Scientia Agricultura Sinica,2013,46(8):1736-1744.(in Chinese)

[16] 顏 華,宋 云,李翊云,等.查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆序列分析及在大腸桿菌中的表達 [J].植物學(xué)報,1997，39(11):1030-1034.

Yan H,Song Y,Li Y Y,et al.Molecular cloning,sequencing of chalcone isomerasegene and its expression inE.coli[J].Acta Botanica Sinica,1997,39(11):1030-1034.(in Chinese)

[17] Cheng H,Li L,Cheng S,et al.Molecular cloning and function assay of a chalcone isomerase gene (GbCHI) fromGinkgobiloba[J].Plant Cell Rep,2011,30(1):49-62.

[18] Park N I,Xu H,Li X,et al.Enhancement of flavone levels through overexpression of chalcone isomerase in hairy root cultures ofScutellariabaicalensis[J].Funct Integr Genomics,2011,11(3):491-496.

[19] Zhang H C,Liu J M,Lu H Y,et al.Enhanced flavonoid production in hairy root cultures ofGlycyrrhizauralensisFisch bycombining the over-expression of chalcone isomerase gene with the elicitation treatment [J].Plant Cell Rep,2009,28(8):1205-1213.

[20] 周 軍,姚泉洪,彭日荷,等.巨峰葡萄查爾酮異構(gòu)酶基因克隆及表達分析 [J].西北植物學(xué)報,2009,29(9):1723-1729.

Zhou J,Yao Q H,Peng R H,et al.Cloning and expression analysis of CHI of Kyoho grape by semi-quantity RT-PCR [J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2009,29(9):1723-1729.(in Chinese)

Cloning and expression of Chalcone isomerase gene cDNA ofCarthamustinctorius

LIU Xiu-minga,b,YANG Wen-tinga,b,ZHANG Xue-mengb,JIAO Zhong-dab,YAO Naa,YANG Mei-yingb,GUAN Li-lia,LI Hai-yana,b,LI Xiao-kuna

(aMinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment, bCollegeofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun，Jilin130118，China)

【Objective】 This study cloned full-length of Chalcone isomerase(CHI)gene in flavonoids biosynthesis fromCarthamustinctoriusand investigated tissue expression specificity to provide reference for the research ofCarthamustinctoriusmetabolic regulation.【Method】 The full-length cDNA ofCHIgene fromCarthamustinctoriuswas cloned using RT-PCR and analyzed using the bioinformatics methods.Phylogenetic tree was constructed for studying homology with similar sequences and the expression at different flowering periods was analyzed by real-time PCR.【Result】 The full-length cDNA ofCHIgene was 1 161 bp with an opening reading frame (ORF) of 654 bp encoding 217 amino acids.The putative protein ofCHIgene had a molecular weight of 23.14 ku and a theoretical pI of 5.67,containing typical AATAA tail signal sequence and Poly(A).Genealogical tree showed thatCHIgene had high homology with other species and the highest value was 82% withSaussureamedusa.Real-time PCR results indicated that relative expression ofCHIgene was highest in bud stage. 【Conclusion】CHIgene was cloned successfully fromCarthamustinctoriusflower,which had highest expression inCarthamustinctoriusbud stage.

Carthamustinctorius;Chalcone isomerase;cDNA cloning;real-time PCR

2014-01-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(2011AA100606)；國家自然科學(xué)基金項目(31101172,31201237)；吉林省科技廳中青年科技領(lǐng)軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團隊項目(20111815)；教育部博士點基金項目(20122223120002)

劉秀明(1981-)，女，吉林松原人，實驗師，主要從事植物生物反應(yīng)器研究。E-mail:xiuming1211@163.com

李海燕(1971-)，女，吉林舒蘭人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆與生物反應(yīng)器研究。E-mail：hyli99@163.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.020

Q786

A

1671-9387(2015)07-0201-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.020.html