李巖（黑龍江省綏化市青岡縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 青岡 151600）

口蹄疫診斷技術(shù)研究進(jìn)展

李巖
（黑龍江省綏化市青岡縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 青岡 151600）

為了系統(tǒng)地了解口蹄疫診斷技術(shù)，本文概述了口蹄疫的病原學(xué)、血清學(xué)與分子生物學(xué)診斷技術(shù)。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷主要依賴于動(dòng)物接種以及細(xì)胞培養(yǎng)，用于病毒的增殖、分離和鑒定。血清學(xué)診斷技術(shù)則包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)口蹄疫的診斷從細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平，國(guó)內(nèi)外相繼建立了口蹄疫核酸雜交和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等分子生物學(xué)診斷技術(shù)。這些方法比傳統(tǒng)診斷方法具有更高的敏感性和特異性。

口蹄疫；診斷技術(shù)；病原學(xué)；血清學(xué)；分子生物學(xué)

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是目前影響動(dòng)物健康的重要疫病之一，世界大部分地區(qū)均有發(fā)生，常在牛群及豬群大范圍流行。此病的致死率很低，但是感染率很高。FMD的大規(guī)模流行，會(huì)給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成極大的危害，并波及到市場(chǎng)上毛、皮、肉、奶的供應(yīng)以及以毛、皮、肉、奶為原料的食品加工業(yè)和輕工業(yè)，給畜牧業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，直接威脅著國(guó)家聲譽(yù)和人類食品衛(wèi)生安全，因而受到國(guó)內(nèi)外的普遍關(guān)注。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為A類家畜傳染病之首。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）為單股、正鏈RNA，約有8 500個(gè)核苷酸，病毒衣殼由4種結(jié)構(gòu)蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60個(gè)拷貝組成，其中VP1和VP3是主要的免疫性抗原。該病毒共有7個(gè)血清型分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型，每個(gè)型又可以進(jìn)一步分為亞型。由于不斷發(fā)生抗原漂移，因此并不能嚴(yán)格區(qū)分亞型。FMD在世界各地幾乎都被列為必須申報(bào)的疾病，診斷只能在指定的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。送檢樣品包括水泡液、剝落的水泡、抗凝血或血清等。死亡動(dòng)物可采集淋巴結(jié)、扁桃體及心臟。樣品應(yīng)冰凍保存，或置pH 7.6的甘油緩沖液中保存[1]。FMD的有效控制關(guān)鍵在于早期檢測(cè)，然而有很多疾病癥狀與FMD相似，僅靠臨床癥狀難以確診，因此必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷[2]。現(xiàn)就目前常用的診斷方法作以綜述。

1 傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法

病毒分離技術(shù)是檢測(cè)FMDV的黃金標(biāo)準(zhǔn)，主要有細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物接種兩種方法[3]。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)病毒檢測(cè)FMDV最初用的細(xì)胞是單層原代豬腎細(xì)胞，后來隨著細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的不斷增多，有許多細(xì)胞都可用于FMDV的分離。其中初代小牛甲狀腺（CYT）細(xì)胞分離FMDV時(shí)特別敏感，此外還有小牛腎細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK-21等。一些樣品在經(jīng)過長(zhǎng)途運(yùn)送后，由于病料受到各種因素的影響，可能只有少量的感染病毒存活，CYT細(xì)胞在檢測(cè)這種病料時(shí)具有特殊的價(jià)值。目前許多實(shí)驗(yàn)室都將CYT細(xì)胞和IB-RS-2培養(yǎng)細(xì)胞（豬腎細(xì)胞系）作為分離FMDV的常規(guī)細(xì)胞。這兩種細(xì)胞系可將FMDV和SVDV（豬水泡病病毒）區(qū)分開，因?yàn)镕MDV可在這2種細(xì)胞上生長(zhǎng)，且有相似的細(xì)胞病變，而SVDV只能在IBRS-2細(xì)胞上生長(zhǎng)。

1.2動(dòng)物接種試驗(yàn)動(dòng)物接種常用乳鼠進(jìn)行，通常情況下進(jìn)行病毒分離需要用8～10只小鼠，以便于觀察接種鼠的死亡情況和獲得足夠多的抗原，并在進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)時(shí)需要獲得明顯的陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)致病性毒株非常重要時(shí)，也可用牛等動(dòng)物來分離FMDV[4]。

血清學(xué)診斷技術(shù)主要包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)和ELISA等。

2 血清學(xué)診斷技術(shù)

2.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)1952年Brooksby建立了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，它是最早標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，成功地用于FMDV分型鑒定，一直被世界參考實(shí)驗(yàn)室和FMD研究或定型中心應(yīng)用至今[5]。在有補(bǔ)體存在的條件下，溶血素能溶解紅細(xì)胞，這三者構(gòu)成的溶血系統(tǒng)在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中起顯示作用。該方法可鑒定抗原（水泡皮、水泡液、鼠組織毒，而細(xì)胞毒需濃縮后方可檢測(cè)），亦可鑒定抗體，并可進(jìn)行定量測(cè)定。一般用常量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為待檢血清定型，微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)用于亞型和毒株抗原差異分析。

2.2 病毒中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)也稱血清中和試驗(yàn)，該方法是最經(jīng)典和最具權(quán)威性的FMDV檢測(cè)方法。20世紀(jì)70年代末期，Rweyemamu等[6]建立中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)是利用血清中和抗體與病毒的特異中和作用，使病毒對(duì)易感動(dòng)物和敏感細(xì)胞失去感染能力的原理建立的。根據(jù)接種病毒——血清混合物的動(dòng)物發(fā)病死亡數(shù)或產(chǎn)生細(xì)胞病變的細(xì)胞管數(shù)來判定血清中所含抗體的量和型別。檢測(cè)病毒——血清混合物的方法有乳鼠中和試驗(yàn)、細(xì)胞中和試驗(yàn)、微量細(xì)胞中和試驗(yàn)和空斑減少中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)既可定性又可定量，國(guó)際檢疫條款規(guī)定用此法判定進(jìn)出境動(dòng)物是否感染或攜帶FMDV。

2.3 凝集試驗(yàn)

2.3.1 正向間接血凝試驗(yàn) 是當(dāng)前最為快速、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)血清方法[7]。是將滅活的各型FMDV致敏綿羊紅細(xì)胞制備的診斷試劑，當(dāng)其遇到相應(yīng)型的血清時(shí)即可發(fā)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。可檢測(cè)出豬和牛發(fā)病后10～150 d的血清抗體。其靈敏度高于中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，但缺點(diǎn)是不同批號(hào)的產(chǎn)品效價(jià)有波動(dòng)。

2.3.2 反向間接血凝試驗(yàn) 是將各型血清的IgG致敏綿羊紅細(xì)胞，當(dāng)其遇到相應(yīng)型抗原時(shí)即可發(fā)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，這一方法和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)一樣不能直接檢測(cè)淋巴結(jié)和骨髓中的FMDV，須經(jīng)乳鼠傳代增毒后再研磨鼠組織，制成懸液，然后離心測(cè)定上清液。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EELLIISSAA）ELISA試驗(yàn)檢測(cè)FMDV具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便和可靠性好等特點(diǎn)，且能自動(dòng)化操作，并能迅速地檢測(cè)大量樣品，在FMD的診斷中日益受到人們的重視，現(xiàn)已成為國(guó)際上檢測(cè)FMD的常規(guī)方法之一。

楊永欽等[8]建立了檢測(cè)FMDV的斑點(diǎn)ELISA檢測(cè)方法（分為一步法和間接法）結(jié)果證實(shí)，用硝酸纖維素膜作固相載體，很好地解決了在常規(guī)ELISA中使用的聚苯乙烯微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體包被不牢的缺點(diǎn)，提高了診斷的準(zhǔn)確性和可靠性，而且可以制成方便攜帶的診斷膜，應(yīng)用更為方便，而且操作簡(jiǎn)單，縮短了試驗(yàn)周期，完全可以在野外進(jìn)行實(shí)地診斷檢測(cè)，在基層具有良好的推廣前景，但是由于一步法的操作更為簡(jiǎn)化，敏感性稍有下降。楊永欽[9]還研制出用于檢測(cè)FMDV的生物素-親和素強(qiáng)化斑點(diǎn)ELISA試驗(yàn)方法，用光敏素標(biāo)記的純化A蛋白代替第二抗體，通過AP標(biāo)記的親和素檢測(cè)生物素化抗體，該法能檢出微量抗體，比常規(guī)ELISA更為敏感。Sorensen等建立了可檢測(cè)FMD抗SAT1、SAT2、SAT3血清型病毒抗體的生物素—親和素系統(tǒng)阻斷ELISA方法，并與世界參考實(shí)驗(yàn)室的液相ELISA方法進(jìn)行了比較，結(jié)果證實(shí)，該方法具有高特異性和靈敏性，可作為抗體水平評(píng)估的一種精確可行的方法。

美國(guó)聯(lián)合生物制藥公司于2000年成功推出以合成肽為基礎(chǔ)的FMD ELISA試劑盒，目前已在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)使用。該試劑盒是根據(jù)傳統(tǒng)的ELISA方法設(shè)計(jì)的，所不同的是采用的包被抗原是化學(xué)合成的非結(jié)構(gòu)蛋白3B和結(jié)構(gòu)蛋白VP1中的抗原位點(diǎn)來取代傳統(tǒng)的病毒抗原或生物合成抗原，并可區(qū)分免疫抗體和感染抗體[10]。

De等研制出基于3ABC蛋白的間接捕獲ELISA技術(shù)，可區(qū)分野毒感染和疫苗毒感染。該方法具有良好的敏感性和特異性。3ABC抗原的抗體最早可于免疫后8 d測(cè)出，并且抗體測(cè)出時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)至少1年。此ELISA方法安全、經(jīng)濟(jì)。鑒于其優(yōu)良特點(diǎn)，可參與FMD根除運(yùn)動(dòng)和防控計(jì)劃。Sorensen等[11]開發(fā)出以桿狀病毒表達(dá)的抗原構(gòu)建的ELISA方法，可分別檢測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白3AB、3ABC、3D，其中3AB、3ABC、3D ELISA均可檢測(cè)FMDV的7種血清型病毒抗體。3DELISA與檢測(cè)結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA方法相比，具有相當(dāng)?shù)奶禺愋?、?zhǔn)確性和敏感性，他們同時(shí)也可證實(shí)3AB和3ABC-ELISA，可在免疫后的畜群中判斷是否存在野毒感染。Kweon等以桿狀病毒表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白3A為抗原，以抗3A的單抗作為捕獲抗體，建立起間接捕獲ELISA方法，此方法與3ABC-I-ELISA相比，具有較好的敏感性和特異性。

Cullough等建立了一種液相ELISA，此ELISA比間接ELISA敏感6～8倍，在效能上與雙夾心或抗原捕獲ELISA相當(dāng)，可用于檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)及雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測(cè)。Hamblin等建立了用于檢測(cè)FMDV抗體的液相阻斷夾心ELISA，該方法比病毒中和試驗(yàn)更敏感，檢出率更高。Oliver等將檢測(cè)抗原的雙抗體夾心ELISA與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)就檢測(cè)抗原方面的效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，ELISA方法比補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)具有更高的敏感性。

Van建立了可檢測(cè)A、O、C型FMDV的單抗介導(dǎo)的復(fù)合型捕獲阻斷ELISA方法，在這個(gè)方法中，同時(shí)應(yīng)用2個(gè)單抗分別針對(duì)抗原上不同的抗原決定簇，有感染力的、未滅活的和滅活的FMDV都可以應(yīng)用于此ELISA方法中。此ELISA方法和其他ELISA方法一樣，不僅敏感性好，而且診斷快速，可重復(fù)測(cè)定，其在疫苗效力試驗(yàn)中對(duì)免疫應(yīng)答水平的評(píng)估非常實(shí)用。Odonneu等應(yīng)用3D蛋白開發(fā)出3D液相阻斷夾心ELISA用于檢測(cè)FMDV抗體。此ELISA可檢測(cè)自然或?qū)嶒?yàn)室感染的A、O、C型FMD抗體，感染后最早5 d即可測(cè)到抗體。此 ELISA方法可用于檢測(cè)病毒活性及對(duì)未感染FMDV動(dòng)物的證實(shí)。

Mackay等建立起診斷FMD的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，以滅活的純化FMDV為抗原，并在系統(tǒng)中應(yīng)用了多克隆抗血清，與液相阻斷ELISA相比，敏感性與液相阻斷ELISA相當(dāng)。Chenard等建立了一種簡(jiǎn)便的固相阻斷ELISA檢測(cè)O型FMDV所刺激而產(chǎn)生的抗體。用此方法對(duì)感染和未感染FMDV的牛、豬和羊進(jìn)行了大量的血清田間試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，特異性為96%，對(duì)148份感染FMDV的豬、牛和羊的血清進(jìn)行檢測(cè)， 證實(shí)其敏感性大于99%，特異性和靈敏性滿足ELISA的檢測(cè)要求[12]。

Lomakina等建立了檢測(cè)FMDV的PCR-ELISA方法，在PCR中應(yīng)用的是針對(duì)3D蛋白基因的通用引物。應(yīng)用該方法成功的檢測(cè)到32株口蹄疫病毒株。

3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.1 核酸探針法即用放射性同位素標(biāo)記核酸的cDNA拷貝，可以特異地同待檢樣品中的病毒核酸結(jié)合，這種結(jié)合可以通過放射自顯影顯現(xiàn)出來。這一方法是當(dāng)前最敏感的方法。其缺點(diǎn)是試驗(yàn)程序較為繁瑣，而且同位素標(biāo)記半衰期短，并污染環(huán)境。相關(guān)學(xué)者用32P標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上的FMDV基因組聚合酶序列作為探針，對(duì)試驗(yàn)感染牛的食道/咽部刮取物進(jìn)行了檢測(cè)，認(rèn)為此法為進(jìn)出口動(dòng)物FMD檢測(cè)提供了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[13]。吳時(shí)友等將重組質(zhì)粒中的FMDV基因片段提出，用光敏生物素標(biāo)記成cDNA探針進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)出10 pg以上的病毒核酸。楊永欽[18]應(yīng)用cDNA探針成功檢出了FMDV。蘇衛(wèi)等用PCR技術(shù)直接合成生物素化核酸探針，一方面可克服同位素探針的放射危害及半衰期短等缺點(diǎn)，另一方面也可克服生物素標(biāo)記的復(fù)雜操作過程。

3.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PPCCRR）PCR診斷技術(shù)用于診斷FMD的報(bào)道始見于1991年。在使用時(shí)以特殊設(shè)計(jì)的引物作介導(dǎo)及在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用PAGE、瓊脂糖電泳或硝酸銀染色檢查，看擴(kuò)增出的DNA片段大小與設(shè)計(jì)是否相符。Meyer采用PCR檢測(cè)牛食道—咽部分泌物中的FMDV RNA；Laor在變化的VP1基因序列中選擇引物，則可用于鑒別FMDV以色列株；國(guó)內(nèi)吳時(shí)友等就FMDV的PCR檢測(cè)研究作了報(bào)道；蔣正軍等應(yīng)用RT-PCR一步法和Nested-PCR法快速檢測(cè)到A型10-6倍稀釋、O型10-4倍稀釋乳鼠肌肉毒。王伊琴等應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)口蹄疫滅活疫苗中的病毒RNA。朱彩珠等采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)牛和豬組織中的FMDV，將FMDV的檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)法進(jìn)行比較，靈敏度提高6～12倍，最高可檢出20 TCID50細(xì)胞毒或0.16～0.32 LD50組織毒，2次擴(kuò)增還可提高檢出靈敏度100倍。婁高明等應(yīng)用RT-PCR技術(shù)能準(zhǔn)確快速地（8 h）檢測(cè)肉類、奶類、分泌物及排泄物的帶毒、排毒情況。羅長(zhǎng)保等[14]應(yīng)用熒光RT-PCR技術(shù)能檢測(cè)出進(jìn)口凍肉中的FMDV。PCR檢測(cè)法與其他方法相比，其特點(diǎn)是特異性好，靈敏度高，簡(jiǎn)便快速，對(duì)檢測(cè)樣品要求低。在分子流行病學(xué)中RT-PCR可與序列分析結(jié)合研究不同分離株之間的系統(tǒng)關(guān)系，也有助于追蹤該病暴發(fā)的傳染源。

3.3 電聚焦運(yùn)用電聚焦技術(shù)診斷FMD和進(jìn)行FMDV的流行病學(xué)研究。電聚焦是根據(jù)等電點(diǎn)的不同來分離像蛋白質(zhì)這樣的兩性電解物。FMDV的結(jié)構(gòu)和成分比較簡(jiǎn)單.在電聚焦技術(shù)中，F(xiàn)MDV誘導(dǎo)的肽都能聚成清晰的、通常是單一的區(qū)帶，而且成熟多肽數(shù)量少，能產(chǎn)生單一的電焦型，可在單向電聚焦時(shí)與其他病毒帶對(duì)照比較，因此電聚焦技術(shù)在FMDV流行病學(xué)研究中，具有較大的研究潛力，能快速地、簡(jiǎn)單地、大量地分離病毒株，常被用于FMDV遺傳變異等方面的研究。

4 其他診斷方法

用于診斷FMD的方法還有SPA偶聯(lián)抗體法、基因工程改造細(xì)胞發(fā)光法、免疫金標(biāo)記快速檢測(cè)試紙法、自我染色復(fù)制法和色譜帶試驗(yàn)等，其中色譜帶試驗(yàn)敏感性等同于實(shí)驗(yàn)室的抗原ELISA，而且可在15 min內(nèi)判定結(jié)果。由于控制FMDV的關(guān)鍵之一在于早期診斷，因此探索一種能夠大量、快速、高效的檢測(cè)方法將仍是今后研究的熱點(diǎn)。在將來，一種同源分析的新型ELISA也許會(huì)應(yīng)用于診斷FMD的血清學(xué)試驗(yàn)中，這種新型ELISA比傳統(tǒng)的需要洗板的ELISA方法更適合于機(jī)器操作。另外，基因芯片和蛋白上清檢測(cè)系統(tǒng)也將最終應(yīng)用于FMD的檢測(cè)技術(shù)。

綜上所述，對(duì)FMD的診斷仍然依賴于傳統(tǒng)的流行病學(xué)并結(jié)合新的生物技術(shù)方法。經(jīng)典的病毒分離、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和病毒中和試驗(yàn)可靠準(zhǔn)確，目前仍在使用，但FMD病毒分離培養(yǎng)工作量較大，病料采樣的部位、時(shí)間、樣品處理、病程類型、發(fā)病動(dòng)物的抗病毒抗體水平等因素對(duì)病毒分離成功與否有一定的影響，而最主要的是分離病毒的細(xì)胞是否敏感和有效。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)有些樣品中存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測(cè)結(jié)果；體外病毒中和試驗(yàn)需要單層培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)變化不均，病毒對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性有別，細(xì)胞易受細(xì)菌和霉形體的污染，并且有些血清樣品對(duì)細(xì)胞有毒性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展及其在FMD診斷中的應(yīng)用，建立了多種FMD的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。從動(dòng)物試驗(yàn)到血清學(xué)試驗(yàn)以至分子生物學(xué)診斷技術(shù)，特異性越來越好，靈敏度越來越高，被檢樣品的局限性愈來愈小，具有較大應(yīng)用潛力的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、ELISA、PCR和病毒基因組核苷酸序列分析。

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The progress in diagnosis technology of foot and mouth disease

Li Yan

（Animal husbandry and veterinary bureau of Qinggang,Heilongjiang Qinggang 151600）

To systematically understand the diagnosis technology of FMD,this paper summarizes the diagnosis technology of FMD including etiological,serological and molecular biological diagnosis technology.In terms of biological diagnostic technology,the diagnosis methods of FMD mainly rely on animal experiments,cell culture.The serological diagnosis technologies including complement fixation test,virus neutralization test,agglutination test,enzyme-linked immunosorbent assay.With the development of molecular biology,the molecular diagnosis technologies of FMD become more important.These methods including nucleic acid hybridization,RT-PCR,and so on,which have higher sensitivity and specificity than the traditional diagnosis method.

Foot and mouth disease;Diagnostic technology;Etiology;Serology;Molecular biology

S855.3

A

1672-9692(2015)12-0038-05

2015-10-27

李巖（1974-），男，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，獸醫(yī)站長(zhǎng)，主要從事動(dòng)物疾病防治。