王 茜，李玉艷 綜述，梁志清審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400038)

·綜 述·

干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

王 茜，李玉艷 綜述，梁志清△審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400038)

干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；成體干細(xì)胞；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；雌性生殖細(xì)胞

近年來(lái)，醫(yī)學(xué)對(duì)于女性腫瘤患者的關(guān)注已從生存時(shí)間和生存率，逐步轉(zhuǎn)為如何保留患者的生育能力。其中部分患者即使通過(guò)輔助生殖技術(shù)也無(wú)法獲得有功能的卵子，利用干細(xì)胞技術(shù)獲得卵細(xì)胞不僅可以為這類患者解決無(wú)法生育的難題，而且可能在研究器官發(fā)生發(fā)育、瀕危動(dòng)物保護(hù)、基因治療等方面起到重要作用[1-5]。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段和分化性質(zhì)不同，將干細(xì)胞分為3類，包括：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESCs)，成體干細(xì)胞(adult stem cell,ASCs)，以及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)。現(xiàn)將近期各種干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的研究進(jìn)展綜述如下。

1 ESCs向雌性生殖細(xì)胞的分化

ESCs具有發(fā)育全能性，能分化為機(jī)體的任意一種細(xì)胞類型，包括：生殖細(xì)胞[1-2]。Hubner等[6]于2003年首次報(bào)道成功誘導(dǎo)鼠ESCs在體外分化為卵母細(xì)胞，表達(dá)生殖系的特異RNA和蛋白標(biāo)記物。Hu等[7]進(jìn)行pFigla-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建，并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，最終將一部分GFP+細(xì)胞分化為類卵母細(xì)胞。Hayashi等[8]則報(bào)道利用mESCs先分化培養(yǎng)出外胚層樣細(xì)胞，在更換培養(yǎng)基添加骨形成蛋白(BMP)4、BMP8a等培養(yǎng)3～4 d，將外胚層樣細(xì)胞分化為原始生殖細(xì)胞(PGCLCs)，并將該類原始生殖細(xì)胞與12.5 d的雌性胚胎性腺細(xì)胞共培養(yǎng)，再將共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)移植至小鼠卵巢包膜下，最終發(fā)現(xiàn)該類原始生殖細(xì)胞分化發(fā)育為胚泡期卵母細(xì)胞。該卵母細(xì)胞周圍依附著類似顆粒細(xì)胞的FOxI2+細(xì)胞。于體外促成熟后，該胚泡期卵母細(xì)胞可進(jìn)一步進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ期，再利用體外授精技術(shù)，最終成功產(chǎn)生健康、有生育功能的后代。近期，Wan等[9]研究發(fā)現(xiàn)維A酸和齊墩果酸均有誘導(dǎo)小鼠ESCs R1/E (MESC-R1/E)向生殖細(xì)胞分化的潛能。利用MESC-R1/E來(lái)源形成的胚胎小體(EBs)在正常的細(xì)胞培養(yǎng)板生長(zhǎng)，然后分別加入維A酸、齊墩果酸，72 h后，均增加了MESC-R1/E向生殖細(xì)胞的分化，并且數(shù)據(jù)分析顯示，維A酸可以誘導(dǎo)MESC-R1/E分化為雌性生殖細(xì)胞，而齊墩果酸則可以誘導(dǎo)MESC-R1/E分化為雄性和雌性兩種生殖細(xì)胞。Geens等[10]將人ESCs與鼠支持細(xì)胞共培養(yǎng)，可以有效提高人ESCs分化為生殖細(xì)胞樣細(xì)胞，對(duì)比他們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同樣有效促進(jìn)人ESCs分化的BMP4，認(rèn)為一種或多種誘導(dǎo)因子與人ESCs共培養(yǎng)，可以有效提高h(yuǎn)ESCs的分化。

綜上，雖然ESCs是雌性生殖細(xì)胞的理想來(lái)源，并且多個(gè)實(shí)驗(yàn)證明，ESCs可以誘導(dǎo)為類卵母細(xì)胞[6-10]，甚至小鼠ESCs細(xì)胞經(jīng)體外分化培養(yǎng)后已成功誕生后代小鼠[8]，但是，ESCs誘導(dǎo)為卵細(xì)胞的具體機(jī)制仍然清楚，且有潛在的畸胎瘤形成風(fēng)險(xiǎn)、免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)及倫理爭(zhēng)議等諸多無(wú)法逃避的問(wèn)題，也注定ESCs在人類和動(dòng)物的研究受到限制[11]。

2 ASCs向雌性生殖細(xì)胞的分化

ASCs是一種具有修復(fù)和再生能力的干細(xì)胞，存在于成人的各種組織和器官當(dāng)中，實(shí)驗(yàn)表明，在一定條件下，ASC會(huì)進(jìn)行自我更新而形成新的干細(xì)胞，或者進(jìn)行分化而形成功能細(xì)胞[3]。

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell BMSCs) BMSCs是目前應(yīng)用較廣泛的一類ASCs[12]。Santiquet等[13]嘗試將BMSCs移植到經(jīng)過(guò)化療藥物處理的PU.1小鼠和重癥綜合性免疫缺陷(SCID)小鼠及胎牛卵巢，但結(jié)果顯示移植BMSCs僅提高了SCID小鼠的生育率。Ghasemzadeh等[14]則比較了小鼠雄性和雌性來(lái)源的BMSCs在向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)特異標(biāo)記物的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Dazl和Rnf17均不表達(dá)，絕大多數(shù)檢驗(yàn)基因在二者表達(dá)水平幾乎相等。而雄性來(lái)源的BMSCs高表達(dá)Piwil2，很可能與其在雄性生殖細(xì)胞的分化過(guò)程扮演重要角色有關(guān)。進(jìn)一步結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，雌性來(lái)源的BMSCs更易分化為雌性生殖細(xì)胞。雖然BMSCs已被證實(shí)有潛在分化為卵母細(xì)胞的潛能[12-14]，但免疫排斥和臨床捐助者有限等問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用[12]。

2.2 臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell UCMSCs) UCMSCs同樣是一種具有多項(xiàng)分化潛能的ASCs，且來(lái)源更加方便[12]。自2003年開(kāi)始，許多實(shí)驗(yàn)室都開(kāi)始進(jìn)行UCMSCs的分離和其多能性的檢驗(yàn)。Ghasemzadleh等[14]報(bào)道利用卵泡液或卵巢提取液體外誘導(dǎo)UCMSCs形成了EBs及類似卵母細(xì)胞的大細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且表達(dá)原始生殖細(xì)胞標(biāo)記物；進(jìn)一步通過(guò)精卵泡液(PFF)小鼠模型，發(fā)現(xiàn)人UCMSCs能夠在卵巢局部存活并生長(zhǎng)。2013年，Qiu等[15]探討了人UCMSCs來(lái)源于不同性別是否會(huì)影響生殖細(xì)胞的形成，分別選取培養(yǎng)男性胎兒來(lái)源的UCMSCs和女性胎兒來(lái)源的UCMSCs，同樣利用20%的卵泡液進(jìn)行誘導(dǎo)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者都可以分化為類卵母細(xì)胞并且表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記物，但是女性胎兒來(lái)源的UCMSCs生殖細(xì)胞特異標(biāo)記物的表達(dá)更早，雌二醇更高，形成的類卵母細(xì)胞也更大。

2.3 其他ASCs Dyce等[16]在前期發(fā)現(xiàn)胎兒豬皮膚來(lái)源的干細(xì)胞可以分化為類卵母細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)新生小鼠皮膚來(lái)源的干細(xì)胞有向卵母細(xì)胞分化的潛能。Xiao等[17]則在近期報(bào)道分離了CD117+/CD44+的人羊膜液干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞不僅表達(dá)生殖細(xì)胞特異標(biāo)記物，并且在5%的POF的培養(yǎng)基中，有接近2%的成體卵細(xì)胞(hAFSCs)分化成減數(shù)分裂期的生殖細(xì)胞并表達(dá)卵泡生成和卵子形成相關(guān)標(biāo)記物。

ESCs卵母細(xì)胞分化不同，目前無(wú)ASCs分化所得卵母細(xì)胞的排卵、受精能力的報(bào)道。但臨床來(lái)源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，避免了免疫排斥反應(yīng)及倫理道德問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，使其成為卵子的理想來(lái)源[18]。若能進(jìn)一步優(yōu)化體外培養(yǎng)誘導(dǎo)方法、探明非卵巢來(lái)源干細(xì)胞體外分化及替代治療機(jī)制，將為體外獲得卵子進(jìn)而為體外受精治療提供新的希望。

3 iPSCs向雌性生殖細(xì)胞的分化

iPSCs是利用技術(shù)將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞內(nèi)，使體細(xì)胞發(fā)生重編程從而成為多能干細(xì)胞[4]。這些細(xì)胞有兩個(gè)重要屬性,自我更新能力和分化成人體的任何細(xì)胞類型的能力?？赡苡兄诶斫饧膊〉臋C(jī)制、制作新疾病模型、藥物開(kāi)發(fā)/藥物毒性的測(cè)試,基因療法,細(xì)胞替代療法等。所以該細(xì)胞在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中都具有極大利用價(jià)值[19]。

Takahashi等[20]于2006年，首次報(bào)道了體細(xì)胞來(lái)源的iPSCs，在2007年，他們又通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒將關(guān)鍵多能基因：Oct3/4,Sox2,Klf4,和c-Myc(Yamanaka 因子) 導(dǎo)入成人上皮纖維母細(xì)胞而首次產(chǎn)生出人iPSCs[21]。Medrano等[22]則發(fā)現(xiàn)，利用過(guò)表達(dá)Vasa或Dazl的iPSCs可以分化為原始生殖細(xì)胞，并且可以通過(guò)減數(shù)分裂過(guò)程達(dá)到成熟，并認(rèn)為在進(jìn)化上具有無(wú)關(guān)性的和相異的RNA結(jié)合蛋白可以促進(jìn)人類來(lái)源的生殖細(xì)胞在體外的減數(shù)分裂。2013年，Niu等[23]建立了iPSCs系，在經(jīng)過(guò)3 d的懸浮培養(yǎng)后可以自主分化為EBs，表達(dá)3個(gè)胚層的特異標(biāo)記物。然后，通過(guò)加入維A酸和POF培養(yǎng)得到的EBs并最終分化為類卵母細(xì)胞，因此認(rèn)為由iPSCs分化可以分化為類卵母細(xì)胞。而近期，Medrano等[24]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，利用成人來(lái)源的iPSCs，在添加豬皮凝膠的培養(yǎng)基中進(jìn)行卵母細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，14 d后，顯微鏡下形態(tài)學(xué)提示，分化細(xì)胞類似卵母細(xì)胞，并且包括Vasa、SCP3在內(nèi)的多種生殖細(xì)胞標(biāo)記物呈高表達(dá)。同ASCs一樣，雖然大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示iPSCs具有向雌性生殖細(xì)胞分化的潛能[20-24]，但還未報(bào)道分化所得卵母細(xì)胞具有排卵、受精能力。此外，潛在遺傳和表觀遺傳異常發(fā)展導(dǎo)致的腫瘤性，不同基因誘導(dǎo)的iPSCs的分化和發(fā)育潛能存在差異等問(wèn)題[20]，提示尋求一個(gè)更有利于向生殖系發(fā)育的iPSCs顯得尤為重要。

5 展 望

找到理想的卵子來(lái)源，是解決女性腫瘤患者不孕的關(guān)鍵。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為雌性生殖細(xì)胞的研究，為由于各種原因?qū)е聼o(wú)法產(chǎn)生有功能卵子的女性患者帶來(lái)了曙光。雖然，目前有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)可以由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為有功能的卵母細(xì)胞并產(chǎn)生后代，但還無(wú)法保證所有誘導(dǎo)出的類卵母細(xì)胞都具有功能，并且誘導(dǎo)分化過(guò)程的具體機(jī)制等也還不清楚，均需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1]Wallace WH.Oncofertility and preservation of reproductive capacity in children and young adults[J].Cancer,2011,117(10):2301-2310.

[2]Woodruff TK.The oncofertility consortium-addressing fertility in young People with cancer[J].Nat Rev Clin Oncol,2010,7(8):466-475.

[3]Wyns C,Curaba M,Vanabelle B,et al.Options for fertility preservation in prepubertal boys[J].Humanit Rep Update,2010,16(3):312-328.

[4]Jahnukainen K,Ehmcke J,Hou M,et al.Testicular function and fertility preservation in male cancer patients[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2011,25(2):287-302.

[5]Deutsch MA,Kaczmarek I,Huber S,et al.Sirolimus-associated infertility:Case report and literature review of possible mechanisms[J].Am J Transplant,2007,7(10):2414-2421.

[6]Hubner K,Fuhrmann G,Christenson LK，et al.Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells[J].Science,2003,300(5623):1251-1256.

[7]Hu Y,Sun J,Wang J,et al.Characterization of female germ-like cells derived from mouse embryonic stem cells through expression of GFP under the control of Figla promoter[J].J Cell Biochem,2012,113(4):1111-1121.

[8]Hayashi K,Saitou M.Generation of eggs from mouse embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells[J].Nat Protoc,2013,8(8):1513-1524.

[9]Wan Q,Lu H,Wu LT,et al.Retinoic acid can induce mouse embryonic stem cell R1/E to differentiate toward female germ cells while oleanolic acid can induce R1/E to differentiate toward both types of germ cells[J].Cell Biol Int,2014,38(12):1423-1429.

[10]Geens M,Semon KD,van de Velde HA.Sertoli cell-conditioned medium induces germ cell differentiation in human embryonic stem cells[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(5):471-480.

[11]Lisa MS,Celso PS,Igor K,et al.The promoter of the oocyte-specific gene,Gdf9,is active in population of cultured mouse embryonic stem cells with an oocyte-like phenotype[J].Methods,2008,45(2):172-181.

[12]Li CX,Wang FY,Liang ZQ,et al.In vitro female germline potential of human umbilical cord-derived matrix stem cells[J].J Clin Rehabilit Tissue Engineer Res,2010,14(40):7583-7587.

[13]Santique N,Vallieres L,Pothier F,et al.Transplanted bone marrow cells do not provide new oocytes but rescue fertility in female mice following treatment with chemotherapeutic agents[J].Cell Reprogram,2012,14(2):123-129.

[14]Ghasemzadeh HM,Eslaminejad MB.Male and female rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells are different in terms of the expression of germ cell specific genes[J].Anat Sci Int,2014,[Epub ahead of print]

[15]Qiu P,Bai Y,Liu C,et al.Gender depended potentiality of differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into oocyte-Like cells in vitro[J].Cell Biochem Funct,2013,31(5):365-373.

[16]Dyce PW,Liu J,Tayade C,et al.In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin[J].PLoS One,2011,6(5):1-14.

[17]Xiao LY,Ning W,Rong Q,et al.Human amniotic fluid stem cells possess the potential to differentiate into primordial follicle oocytes in vitro1[J].Bio Reproduct,2014,90(4):73,1-11.

[18]Kuroda Y,Dezawa M.Mesenchymal stem cells and their subpopulation,pluripotent muse cells,in basic research and regenerative medicine[J].Anat Rec (Hoboken),2014,297(1):98-110.

[19]Fernandez Tde S,de Souza Fernandez C,Mencalha AL.Human Induced pluripotent stem cells from basic research to potential clinical applications in c-ancer[J].Biomed Res Int,2013,2013:430290.

[20]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[21]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

[22]Medrano JV,Ramathal C,Nguyen HN,et al.Divergent RNA-binding proteins,DAZL and VASA,induce meiotic progression in human germ cells derived in vitro[J].Stem Cells,2012,30(3):441-451.

[23]Niu Z,Hu Y,Chu Z,et al.Germ-like cell differentiation from induced pluripotent stem cells(iPSCs)cell biochemistry and function[J].Cell Biochem Funct,2013,31(1):12-19.

[24]Medrano JV,Simon C,Pera RR.Human germ cell differentiation from pluripotent embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells[J].Methods Mol Biol,2014,1154:563-578.

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.16.044

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101058)；重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CSTC2011jjA10075)。

王茜(1990-)，碩士在讀，主要從事生殖醫(yī)學(xué)研究工作。

△通訊作者，Tel:13320332902;E-mail：zhi.lzliang@gmail.com。

Q21

A

1671-8348(2015)16-2274-03

2014-11-08

2015-02-10)