李曉栩，黃 瑊，楊誠忠，譚小玲，蔡明春，崔中來，官立彬

（第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系高原生理學(xué)與高原生物學(xué)教研室/教育部高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室和全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶400038）

復(fù)制慢性高原病動物模型實(shí)驗教學(xué)中注意事項分析

李曉栩，黃 瑊，楊誠忠，譚小玲，蔡明春，崔中來，官立彬

（第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系高原生理學(xué)與高原生物學(xué)教研室/教育部高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室和全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶400038）

該文主要介紹實(shí)驗教學(xué)中高原紅細(xì)胞增多癥合并高原心臟病動物模型復(fù)制的方法和注意事項，通過模型的復(fù)制，以及對存在的具體問題和注意事項的逐步剖析，使學(xué)生全面了解實(shí)驗方法和取材方法，在實(shí)驗前熟悉低壓艙使用、動物飼養(yǎng)及動物取材注意事項，為學(xué)生提供一個標(biāo)準(zhǔn)化的模型復(fù)制程序，使復(fù)制高原紅細(xì)胞增多癥合并高原心臟病的動物模型更加穩(wěn)定，降低動物的死亡率，提高模型復(fù)制的成功率，確保模型復(fù)制過程中進(jìn)艙人員的安全。

高海拔； 高原??； 模型，動物； 大鼠； 實(shí)驗教學(xué)

慢性高原病（chronicmountain sickness，CMS），國際上習(xí)慣稱為慢性高山病，是高原地區(qū)危害人體健康的常見慢性病，分為高原紅細(xì)胞增多癥、高原心臟病、高原血壓異常、高原衰退癥，國際上統(tǒng)一應(yīng)用青海標(biāo)準(zhǔn)作為其診斷標(biāo)準(zhǔn)[1-3]。CMS主要發(fā)生在長期生活工作在海拔3 000m以上的人群，其發(fā)病機(jī)制與高原低氧有直接關(guān)系[4-5]。高原紅細(xì)胞增多癥合并高原心臟病動物模型是研究CMS的一種常用的實(shí)驗?zāi)Ｐ?，但目前動物選擇、模型復(fù)制方法（缺氧方法、缺氧時間和海拔高度）尚不統(tǒng)一，而且實(shí)驗中的取材方法對實(shí)驗結(jié)果的影響報道甚少，而選擇合適的實(shí)驗動物和模型復(fù)制方法是教學(xué)科研成功的關(guān)鍵。

在實(shí)驗教學(xué)中，教師通常采用低壓低氧動物實(shí)驗艙模擬海拔5 000m復(fù)制大鼠高原紅細(xì)胞增多癥合并高原心臟病模型。本文通過對實(shí)驗過程和多次的大鼠解剖觀察，模型制備過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分析，總結(jié)出一套實(shí)驗準(zhǔn)備，模型復(fù)制和取材的注意事項。希望學(xué)生在教學(xué)實(shí)踐過程中通過對各環(huán)節(jié)影響因素的了解，達(dá)到提高模型復(fù)制的成功率，降低動物模型復(fù)制中的死亡率，順利完成實(shí)踐教學(xué)的目的，為以后進(jìn)行規(guī)范化的教學(xué)科研奠定基礎(chǔ)。

1 教學(xué)內(nèi)容

1.1 儀器與試劑 10%烏拉坦，肝素，生理鹽水，紅細(xì)胞稀釋液，血紅蛋白測定試劑盒，蒸餾水，顯微鏡，動脈導(dǎo)管，靜脈導(dǎo)管和大鼠鼠臺。

1.2 實(shí)驗方法 將SD大鼠分為平原組和缺氧組，缺氧大鼠組置于低壓艙內(nèi)，以200m/min速度上升至模擬海拔5 000m，進(jìn)行連續(xù)缺氧28 d，每48小時進(jìn)入過渡艙為大鼠添加食物、水及打掃衛(wèi)生，平原組大鼠放于另一低壓艙內(nèi)，在平原環(huán)境下飼養(yǎng)28 d。

1.3 動物取材 缺氧28 d后，進(jìn)行取材。缺氧組在模擬海拔4 000m下進(jìn)行取材，平原組則在平原環(huán)境下進(jìn)行。首先，使用10%烏拉坦，1mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，自大鼠右側(cè)頸外靜脈插入聚乙烯塑料微導(dǎo)管，導(dǎo)管另一側(cè)連接壓力傳感器，用多導(dǎo)生理記錄儀記錄平均肺動脈壓（mPAP）及右心室壓力（RVP）、與右心室內(nèi)壓變化速率等，待記錄完畢后，抽取大鼠動脈血測定血?dú)?，對紅細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，再加入1mL全血置于血球比積管中，3 000 r/min離心15min，測量血球壓積，根據(jù)血紅蛋白測定試劑盒說明書測定血紅蛋白，采血后快速打開胸腔取出大鼠心臟，去掉心房，沿室間隔邊緣小心分離右心室（RV）和左心室（LV）+室間隔（S），用生理鹽水漂洗2~3遍后，用濾紙吸干水分后稱量RV和LV+S的質(zhì)量，以RV/（LV+S）和RV/BW（體質(zhì)量）反映RV肥厚程度。

2 注意事項

2.1 低壓艙使用注意事項

2.1.1 確保進(jìn)倉人員的安全 進(jìn)入低壓艙的學(xué)生必需身體健康，患有嚴(yán)重的心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病或感冒者勿入。進(jìn)入低壓艙前，學(xué)生必須熟悉低壓艙的使用規(guī)則，了解艙內(nèi)設(shè)施情況，如通訊設(shè)施、遞物艙、吸氧設(shè)備的位置，并由專業(yè)人員對通訊，遞物艙，吸氧設(shè)備的使用方法進(jìn)行培訓(xùn)。在低壓艙模擬開始時再次檢查吸氧設(shè)備的工作情況。另外，為了確保學(xué)生在艙內(nèi)的安全，禁止單人進(jìn)入。由于在上升過程中外界壓力迅速降低，而中耳內(nèi)壓力高，容易導(dǎo)致中耳脹氣，引起耳部不適，因此學(xué)生在上升過程中應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)咀嚼活動，而在下降過程中，外界壓力迅速增高，而中耳內(nèi)壓力低，容易導(dǎo)致耳膜壓痛，甚至穿孔，因此學(xué)生在下降過程中應(yīng)進(jìn)行咽鼓管充氣。若發(fā)生高原反應(yīng)，如心率過快、頭痛劇烈、耳鳴等不適癥狀，應(yīng)迅速吸氧并聯(lián)系艙外工作人員，降至平原。

2.1.2 動物飲水瓶灌裝的注意事項 低壓艙在上升過程中，由于外界壓力變化，會導(dǎo)致動物飲水瓶中的水不斷滴入動物籠中，如果滴水過多，動物籠中則會過于潮濕，會導(dǎo)致病原微生物和寄生蟲的過度繁殖，墊料和飼料易發(fā)生霉變，不利于大鼠的健康，易造成大鼠的死亡。因此，在進(jìn)行減壓前，應(yīng)該完全灌滿全部飲水瓶，減少滴水的發(fā)生。

2.2 動物飼養(yǎng)注意事項

2.2.1 實(shí)驗動物 高原紅細(xì)胞增多癥合并高原心臟病模型復(fù)制常選用健康成年SD大鼠，清潔型，體質(zhì)量180~ 220 g，6~10周齡，體質(zhì)量過輕將增加實(shí)驗動物模型復(fù)制過程中的死亡率，體質(zhì)量過重影響因素將增多，影響模型復(fù)制的穩(wěn)定性。在性別選用上，應(yīng)盡量選擇雄性動物或雌雄各一半進(jìn)行缺氧模型制作。有研究表示，雌性動物可分泌雌激素，而雌激素有顯著的抗缺氧作用，降低模型復(fù)制的成功率[6-8]。此外，動物領(lǐng)回后須在平原環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，方可進(jìn)行低壓缺氧實(shí)驗。

2.2.2 動物飼養(yǎng) 平原組和缺氧組大鼠均應(yīng)在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度為（22.0±3.5）℃，濕度為（50±10）%，明暗交替為12 h∶12 h，飼料、墊料經(jīng)高壓滅菌，飲水為冷開水。夏季須每天更換墊料，冬季每周更換3次，冬季還應(yīng)注意保暖。飼養(yǎng)間應(yīng)保持干燥、無嘈雜。環(huán)境溫度、濕度等的不適均會導(dǎo)致大鼠心情煩躁易怒，影響模型復(fù)制的成功率。模型復(fù)制期間，所有進(jìn)艙換水換料均不能降至平原環(huán)境進(jìn)行，否則將引起動物缺氧-復(fù)氧-再缺氧循環(huán)，造成氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致模型復(fù)制的失敗。低壓艙環(huán)境密閉，需要經(jīng)常觀察動物情況，大鼠低壓缺氧后，前7天內(nèi)食量會顯著下降，體質(zhì)量降低，也是動物模型復(fù)制過程中死亡的高峰期，應(yīng)重點(diǎn)觀察，避免動物死亡后尸體的腐臭味影響環(huán)境。另外，還應(yīng)重點(diǎn)保證飲水的供給。

2.3 動物取材注意事項 取材前大鼠需禁食12~18 h，時間過長會增加大鼠的死亡率，時間過短達(dá)不到禁食效果，此時還應(yīng)給予充足的飲水。取材時，大鼠麻醉后進(jìn)行插管，插管結(jié)束后，動物取材應(yīng)盡快完成，夏季通常在動物死后4 h內(nèi)完成，時間過長，組織容易變性、腐敗，影響實(shí)驗結(jié)果。冬季可適當(dāng)延長取材時間。另外，所有操作均需在冰上進(jìn)行。采血時需要將采血管適當(dāng)上下顛倒混勻，以避免采血過程中發(fā)生凝血或溶血。

3 結(jié) 語

在教學(xué)或研究慢性高原病的發(fā)病機(jī)理及其防治對策時，建立一個理想的實(shí)驗動物缺氧模型無疑具有極其重要的意義。理想的低壓缺氧動物模型可用于高原環(huán)境所致的心、腦、肺[9-11]等相關(guān)疾病機(jī)理及防治的研究。理想的實(shí)驗?zāi)Ｐ蛻?yīng)具備重復(fù)性好、操作性強(qiáng)，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。細(xì)節(jié)往往是決定實(shí)驗?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功的關(guān)鍵因素，注重細(xì)節(jié)，選擇模型復(fù)制的有利因素，規(guī)避模型復(fù)制的危害因素，可以很大程度上提高模型復(fù)制的成功率，也可使低壓缺氧大鼠模型的復(fù)制更加穩(wěn)定，對實(shí)踐教學(xué)，甚至慢性高原病病因、發(fā)病機(jī)制等研究順利進(jìn)行起到積極作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.055

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1009-5519（2015）09-1410-03

2015-01-27）

國家973計劃項目（2012CB518201）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81370150，30973446）；重慶市研究生教育教學(xué)改革研究項目（yjg143068）。

李曉栩（1985-），女，重慶榮昌人，實(shí)驗師，碩士研究生，主要從事高原病等基礎(chǔ)研究；E-mail：kangleshizhu@163.com。

官立彬（E-mail：libinguan84@163.com）。