秦冉冉 綜述 王志浩 審校

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250012)

近年來，血栓性疾病因其高發(fā)病率、高危害性及治療的高花費(fèi)越來越受到人們的重視，相關(guān)疾病遍布臨床各個科室，是臨床上比較棘手的問題之一。現(xiàn)有的抗血小板、抗凝藥物在心腦血管血栓性疾病的一級預(yù)防中不良反應(yīng)較多［1-2］。因此，尋找調(diào)控血栓形成的新物質(zhì)成為血栓治療的新方向。進(jìn)一步闡明血栓形成的復(fù)雜機(jī)制對于血栓形成性疾病的預(yù)防和治療，提高心腦血管疾病患者的生存質(zhì)量和時間具有重要意義。近年來，人們逐漸認(rèn)識到血小板活化和凝血因子的激活存在一個共同的規(guī)律，即參與其過程的主要的功能性蛋白的活化大多受變構(gòu)二硫鍵的控制，而這些變構(gòu)二硫鍵受蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)的調(diào)控［3］。因此PDI 在血栓形成的研究中成為熱點(diǎn)，也為血栓疾病的治療提供了新思路。

1 血栓形成的經(jīng)典理論

目前已知，血栓的形成有兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié):血小板活化和凝血系統(tǒng)激活。

1.1 血小板的活化

在人體內(nèi)，血管受損后，內(nèi)皮下膠原暴露，從而觸發(fā)血小板與內(nèi)皮膠原的黏附。血小板膜上有多種膠原蛋白受體，血小板的激活包括蛋白水解、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和配體蛋白質(zhì)的相互作用，是一系列復(fù)雜的過程，至今還未完全闡明。對于這一過程的簡要總結(jié)就是受損的內(nèi)皮細(xì)胞將導(dǎo)致膠原蛋白暴露從而讓糖蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)吸引血小板。血小板單層排列，輪流為更多的血小板聚集引起一系列瀑布反應(yīng)產(chǎn)生更多的凝血酶［4］。血小板也開始分泌其他活性物質(zhì)來綁定血小板受體和增加細(xì)胞內(nèi)鈣含量。這將導(dǎo)致血小板受體結(jié)合纖維蛋白原從而增加血小板的黏附和血栓的形成。許多與血小板激活有關(guān)的整合素受體包括血小板膜糖蛋白Ⅰb(glycoproteinⅠb，GPⅠb)、糖蛋白Ⅵ(glycoproteinⅥ，GPⅥ)、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)即αⅡbβ3整合素和α2β1整合素等含有豐富的半胱氨酸亞單位，可能允許PDI 調(diào)節(jié)硫醇的氧化還原狀態(tài)［5］。

1.2 凝血系統(tǒng)的激活

眾所周知，凝血系統(tǒng)的激活包括兩條途徑:內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑。內(nèi)源性凝血途徑是指參與凝血的因子全部來自血液，通常因血液與帶負(fù)電荷的異物(如膠原等)表面接觸而啟動，其過程是:由Ⅻ因子被激活形成Ⅺa-Ⅷa-Ca-PL 復(fù)合物并激活Ⅹ因子。外源性凝血途徑是指由來自于血液之外的組織因子(tissue factor，TF)暴露于血液而啟動的凝血過程，又稱TF 途徑。其過程則是指從TF 被釋放到TF-Ⅶa-Ca 復(fù)合物形成并激活因子Ⅹ的過程。二者共同通路是指因子Ⅹa 形成后，兩條途徑合二為一，激活凝血酶原并最終生成纖維蛋白的過程。目前普遍認(rèn)為，外源性凝血途徑對動靜脈凝血過程的啟動有著非常重要的作用，而內(nèi)源性途徑只對凝血過程起一個放大和維持的作用。在生理條件下，TF 在細(xì)胞表達(dá)，不暴露于循環(huán)中。在病理條件下TF 可能會暴露于內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞，啟動血栓相關(guān)事件，如動脈粥樣硬化、癌癥或膿毒癥。動脈或靜脈內(nèi)血液凝固的啟動大多由TF 而不是Ⅻ因子所觸發(fā)。

2 PDI 的結(jié)構(gòu)與分布

2.1 PDI 的結(jié)構(gòu)

PDI 作為一種廣泛存在于真核細(xì)胞的氧化還原蛋白家族的成員，具有氧化還原酶、異構(gòu)酶及分子伴侶的作用，能夠催化二硫鍵與巰基之間的互變反應(yīng)。其家族成員包括PDI、ERp57、ERp72 等20 多個成員。50多年來經(jīng)眾多學(xué)者分離、純化、研究測定出PDI 蛋白是由517 個氨基酸組成:其有4 個結(jié)構(gòu)域(a、b、a’、b’)、一個羧基末端伸展域(C)和連接子(X)、4 個硫氧還原蛋白樣的結(jié)構(gòu)域組成一個扭曲的“U”型［6］。PDI 的a 和a’域具有同源硫氧還蛋白，每個域包含一個獨(dú)立的活性部位(巰基二硫鍵中心)，每個活性功能域包含CXXC(Cys-Xaa-Xaa-Cys)的活性位點(diǎn)，這兩個鄰位的半胱氨酸可形成二硫鍵或以游離巰基形式存在，調(diào)節(jié)PDI 的活動［7］。不活躍的域(b 和b’)是彼此相似的序列但不是硫氧還蛋白，它們是底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，也有學(xué)者認(rèn)為兩個b 域被認(rèn)為有助于其伴侶功能［8］。C-末端是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)駐留信號。在PDI 分子中，底物結(jié)合域決定其底物特異性。

2.2 PDI 的分布

PDI 在真核細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，高度集中在ER 的氧化環(huán)境中，確保新形成蛋白質(zhì)的二硫鍵的形成。雖然PDI 有一個C 端ER 保留序列，PDI 已被確定在不同亞細(xì)胞位置甚至細(xì)胞以外。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PDI 分布于血小板表面及內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞［9］。

2.3 PDI 的主要功能

PDI 有很多功能，其中對硫醇二硫鍵的氧化還原、互換和分子伴侶活性這三個催化活動是ER 的核心功能。PDI 的氧化還原異構(gòu)酶作用主要在ER 腔內(nèi)進(jìn)行，其中大約50%PDI 的a 和a’結(jié)構(gòu)域活性中心皆為還原狀態(tài)，15%PDI 的a 和a’結(jié)構(gòu)域的活性中心是氧化狀態(tài);另外，20%PDI 的a 結(jié)構(gòu)域活性中心是氧化狀態(tài)，a’結(jié)構(gòu)域的活性中心是還原狀態(tài);還有15%PDI的a’結(jié)構(gòu)域活性中心是氧化狀態(tài)，a 結(jié)構(gòu)域的活性中心是還原態(tài)［10］。PDI 活性中心的氧化還原狀態(tài)的不同決定其生理功能的不同:氧化狀態(tài)時，PDI 能將來自于活性中心的二硫鍵傳遞給底物，使其形成一對二硫鍵，并將PDI 活性中心還原為還原態(tài);而當(dāng)PDI 活性中心為還原狀態(tài)時，PDI 能使底物的二硫鍵產(chǎn)生異構(gòu)，或者奪取底物的二硫鍵使自身的活性中心變成氧化態(tài)。

PDI 還是ER 分子伴侶家族的重要成員，作為分子伴侶，PDI 在蛋白質(zhì)的翻譯及翻譯后進(jìn)行的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中均起著重要作用。PDI 區(qū)分展開、部分展開和折疊的蛋白質(zhì)［11］，可幫助錯誤折疊或未折疊蛋白進(jìn)行重新折疊。以往認(rèn)為PDI 的分子伴侶活性獨(dú)立于其二硫鍵異構(gòu)酶活性而存在，然而最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PDI 的伴侶活動是由它的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)的。Wang 等［6］于2012年獲得人類PDI 的還原和氧化形式的晶體結(jié)構(gòu)，并于2013年［12］發(fā)表文章顯示氧化狀態(tài)有一個更開放的構(gòu)象，允許伴侶蛋白的底物(如展開肽)進(jìn)入與其結(jié)合，而還原型PDI 有一個封閉的構(gòu)象抑制其底物的進(jìn)入，這進(jìn)一步說明了活躍位點(diǎn)的構(gòu)象變化引起的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)分子伴侶活性。

3 PDI 在血栓形成過程中的生物作用

3.1 PDI 對于TF 解密的作用

在生理和病理條件下，TF 是凝血的主要發(fā)起者，作為血漿蛋白酶因子Ⅶa(FⅦa)的受體和變構(gòu)輔助因子，酶復(fù)合物(TF-FⅦa)通過有限的蛋白水解凝血因子Ⅹ(FⅩ)啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)。TF 在此瀑布式反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，最終導(dǎo)致凝血酶生成和纖維蛋白的形成。體外研究已表明大多數(shù)TF 暴露在不同的細(xì)胞環(huán)境中處于低促凝血的或“加密”狀態(tài)，需要激活步驟也就是解密，才能使TF 最大限度地表達(dá)促凝血的潛力。磷脂酰絲氨酸在應(yīng)對多重刺激(如細(xì)胞溶菌作用、鈣離子載體和凋亡信號)時暴露，促進(jìn)TF 解密，磷脂酰絲氨酸和PDI 協(xié)同作用促進(jìn)TF 的解密過程［13］。

普遍認(rèn)為隱蔽的和激活的TF 的不同構(gòu)象在于TF的隱蔽形式包含未配對的Cys186-Cys209 半胱氨酸硫醇，而TF 的激活形式被認(rèn)為是包含一個配對的Cys186-Cys209 的二硫鍵［13-14］。桿菌肽是PDI 家族的非選擇性抑制劑，當(dāng)其存在時，TF-Ⅶa 信號被抑制，沖刷實(shí)驗后，PDI 與TF 重新組合可完全逆轉(zhuǎn)桿菌肽對TF-Ⅶa 信號的抑制作用。這些數(shù)據(jù)顯示在細(xì)胞模型中和生理水平的TF 存在時，PDI 在TF-Ⅶa 細(xì)胞信號和凝血的直接的激活過程中充當(dāng)切換開關(guān)的作用［15］。

在細(xì)胞內(nèi)PDI 作為一個調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)TF 的功能，但是PDI 怎樣使隱蔽的、非凝血形式的TF 激活現(xiàn)在仍未完全闡明。有人提出了PDI 通過異構(gòu)化TF 的Cys186-Cys209 巰基-二硫鍵互換從而控制TF 促凝血和信號功能。但有數(shù)據(jù)顯示:當(dāng)存在FⅦa 的飽和濃度時，TF 突變體即使缺乏Cys186-Cys209 二硫鍵也可表現(xiàn)出特定的與野生型TF 相同的促凝血活性。這些數(shù)據(jù)表明，Cys186-Cys209 二硫鍵的形成不是TF 解密所必需的［16］。

雖然PDI 可能通過切換TF 的二硫鍵促進(jìn)凝血，也不排除其他機(jī)制和其他PDI 目標(biāo)。Versteeg 等［17］于2007年發(fā)表文章:TF 凝血功能增強(qiáng)獨(dú)立于PDI 的氧化還原酶活性，PDI 伴侶活性足以提高TF 凝血活性。他們用桿菌肽完全封鎖了PDI 對TF-Ⅶa 介導(dǎo)的FⅩ活化的影響。然而，當(dāng)PDI 存在時，用氧化苯胂封鎖附近的硫醇(硫醇是PDI 的還原酶和異構(gòu)酶活動所需的，而PDI 的伴侶功能通常被認(rèn)為是獨(dú)立于臨近的催化的硫醇)，不會降低凝血活動。這些數(shù)據(jù)表明氧化還原酶活性不影響PDI 對TF 的作用，提示PDI 通過其伴侶活性來增強(qiáng)TF 促凝血的活動而不是依賴于氧化還原酶的活性。然而，Persson［18］于2008年又提出相反的觀點(diǎn):PDI 實(shí)際上不是通過伴侶機(jī)制影響FⅩ激活。他認(rèn)為是牛PDI 磷脂污染物，而不是牛PDI 本身介導(dǎo)FⅩ激活的增強(qiáng)TF-Ⅶa，因為通過重組人類PDI 無法刺激FⅩ激活TF-Ⅶa。

這些存在爭議的實(shí)驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)的原因可能是:在體內(nèi)PDI 家族成員眾多，不排除與PDI 有相似活性的成員在解密TF 中起重要作用。像ERp57 與PDI 具有很高的同源性，在血栓形成和止血過程中具有重要作用［19-20］。而且很多學(xué)者在實(shí)驗中研究工具單一，多以應(yīng)用抑制性抗體為手段，其特異性差，可抑制PDI 家族其他成員，從而影響觀察效果，阻礙了對PDI 作用的真正認(rèn)識。因此制備PDI 家族各個成員特異性的抗體或其他特異性手段有助于得到正確的實(shí)驗結(jié)果，對于PDI 的認(rèn)識也會更加正確，而對于新型抗凝藥的研制也至關(guān)重要。

3.2 PDI 介導(dǎo)的內(nèi)源性凝血

有關(guān)PDI 介導(dǎo)的內(nèi)源性凝血的國內(nèi)外研究結(jié)果并不多。2012年，Giannakopoulos 等［21］發(fā)表文章稱在抗磷脂抗體綜合征患者，血栓形成是由于Ⅺ因子的二硫鍵被氧化還原酶硫氧還蛋白-1 和PDI 還原成自由硫醇而啟動凝血。這對于抗磷脂抗體綜合征的研究是有重要意義的發(fā)現(xiàn)。

3.3 PDI 介導(dǎo)的纖維蛋白生成和血小板的活化

血小板活化的最終途徑都是β3整合素，其在血小板以大量的αⅡbβ3的形式存在，在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)為αⅤβ3而不是αⅡbβ［22］3。2012年Cho 等［23］發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)血栓的形成中血小板PDI 的捕獲取決于β3整合素的存在。他們使用活體顯微鏡證明缺乏β3整合素的老鼠，在激光損傷小動脈壁的部位既無血小板血栓形成也無纖維蛋白生成。他們對野生型和β-/-3老鼠進(jìn)行相互的骨髓移植進(jìn)一步評估內(nèi)皮細(xì)胞αⅤβ3與血小板αⅡbβ3的相對重要性。這些相互移植的老鼠，當(dāng)血管損傷后PDI 積累和血小板血栓形成均顯著降低。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞和血小板β3整合素均促進(jìn)細(xì)胞外PDI 在血管損傷部位相互作用和累積。在此之前，2008年他們應(yīng)用激光誘導(dǎo)提睪肌動脈血栓模型，發(fā)現(xiàn)在小鼠受傷后的血栓中，PDI 在血管損傷部位的出現(xiàn)早于血小板積聚和纖維蛋白沉積［24］。注入PDI抑制劑桿菌肽或?qū)DI 單克隆抗體阻滯劑可抑制血小板血栓形成和纖維蛋白生成，且明顯延長小鼠尾出血時間。這些結(jié)果都表明，在老鼠體內(nèi)纖維蛋白生成和血小板血栓形成中，PDI 是需要的，而且β3整合素在PDI 介導(dǎo)的血小板活化過程中具有關(guān)鍵作用。

然而Kim 等［25］于2013年發(fā)現(xiàn)PDI 在小鼠血栓形成中起作用而不是在止血中起作用。與細(xì)胞外PDI抑制劑不同，血小板特定的缺乏PDI 的老鼠與野生型老鼠相比沒有顯示更長的尾出血時間［其時間分別為(120.0 ±32.8)s 和(117.5 ±28.4)s］。這些結(jié)果表明，在老鼠體內(nèi)血小板PDI 的異構(gòu)酶功能僅限于血栓形成，對于止血并不是必不可少的。

Jasuja 等［26］則認(rèn)為對血小板血栓形成起作用的PDI 不是血小板來源的而是內(nèi)皮細(xì)胞來源的PDI。他們使用活體的顯微鏡體內(nèi)研究顯示激光損傷血管壁后，實(shí)驗表明在纖維蛋白生成中，內(nèi)皮細(xì)胞來源的PDI是必需的，而且獨(dú)立于血小板血栓形成，而血小板PDI有助于增加血栓形成有關(guān)的PDI 的總量，但不是必需的。也許這些實(shí)驗結(jié)果可解釋為:PDI 對于血小板活化、血小板血栓形成以及纖維蛋白生成均有作用，然而PDI 對血小板功能的影響?yīng)毩⒂谒鼘w維蛋白生成的影響:激活血小板進(jìn)而促進(jìn)血小板血栓形成的有內(nèi)皮細(xì)胞和血小板二者來源的PDI，而促使纖維蛋白生成的只有內(nèi)皮細(xì)胞來源的PDI。而且血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的β3整合素對于二者來源的PDI 的捕獲及介導(dǎo)的凝血具有關(guān)鍵作用。

生理條件下，血小板上的αⅡbβ3整合素處于低親和力狀態(tài)，不能結(jié)合纖維蛋白原，只有其空間構(gòu)象發(fā)生改變轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)才能結(jié)合纖維蛋白原，促使血栓形成［27］。如前所述，許多與血小板激活有關(guān)的膜糖蛋白受體(包括αⅡbβ3整合素)含有豐富的半胱氨酸亞單位，而血小板活化的最終途徑是αⅡbβ3整合素，αⅡbβ3整合素含有56 個半胱氨酸殘基，每個半胱氨酸均參與二硫鍵的形成，這樣的結(jié)構(gòu)特征可能允許PDI 調(diào)節(jié)αⅡbβ3整合素的氧化還原狀態(tài)及異構(gòu)化，促使其構(gòu)象發(fā)生改變。αⅡbβ3整合素游離巰基的產(chǎn)生是與配體高親和力結(jié)合的必需條件，而PDI 與αⅡbβ3整合素結(jié)合后催化二硫鍵的還原，增加游離巰基產(chǎn)生，空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而活化αⅡbβ3整合素轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)，提高其與纖維蛋白原結(jié)合的能力，促進(jìn)血栓形成［28］。

基于國內(nèi)外幾十年的對PDI 不斷深入的研究，對于PDI 促進(jìn)凝血的機(jī)制雖然尚不完全清楚，但是血栓形成過程需要PDI 的參與，而且PDI 在血栓形成過程的各個階段均發(fā)揮作用是肯定的，而且大量研究證實(shí)PDI 的抑制劑可阻滯血栓形成的最初階段，抑制兩條凝血途徑。已有的抗凝劑雖然能抑制血小板聚集或纖維蛋白生成，如抗血小板藥物阿司匹林，抗凝藥物肝素、華法林等，作用于GPⅡb/Ⅲa 受體的阿昔單抗等，但其預(yù)防、治療效果不理想。諸多學(xué)者致力于研究PDI 抑制劑作為抗凝治療的替代目標(biāo)。

4 PDI 抑制劑

目前使用最廣泛的PDI 的小分子抑制劑是桿菌肽，桿菌肽是PDI 和PDI 的家族其他硫醇異構(gòu)酶的抑制劑，桿菌肽濃度增加導(dǎo)致在血管壁損傷后纖維蛋白沉積和血小板聚集減少［24］?？筆DI 單克隆抗體RL90的功能與桿菌肽相似［29］。最有效的抑制劑是五羥黃酮-3-蕓香糖甙，也稱為蘆丁，是一類黃酮類化合物，常見于果實(shí)和蔬菜。對于硫醇異構(gòu)酶家族而言，這是PDI 的選擇性抑制劑，不抑制ERp5、ERp57、ERp72、硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶［8］。在激光損傷血管后五羥黃酮-3-蕓香糖甙抑制血小板聚集和纖維蛋白形成［30］。當(dāng)小鼠被注入重組PDI 后，五羥黃酮-3-蕓香糖甙的抗血栓形成的效果就可完全被逆轉(zhuǎn)。這個實(shí)驗證實(shí)，五羥黃酮-3-蕓香糖甙通過阻斷PDI 抑制血栓形成。這些臨床前研究表明，抑制PDI 是一個阻止血栓形成比較容易實(shí)現(xiàn)的方法。但是在無PDI 的血小板，五羥黃酮-3-蕓香糖甙明顯阻礙血小板聚合和三磷酸腺苷分泌，表明其具有抑制PDI 以外的額外效果［25］。在以后的研究中這一點(diǎn)應(yīng)當(dāng)加以注意。不過五羥黃酮-3-蕓香糖甙及其衍生物或更為特異性的單克隆抗體有望成為新型抗凝藥。

5 展望

血栓形成是血小板、多種蛋白、凝血因子協(xié)同作用的結(jié)果。參與調(diào)節(jié)的蛋白活化時都需要變構(gòu)二硫鍵發(fā)生氧化還原與變構(gòu)，而二硫鍵異構(gòu)酶負(fù)責(zé)催化二硫鍵氧化還原與變構(gòu)。這對進(jìn)一步探討血栓形成的具體機(jī)制提供了新思路。將為血栓性疾病的預(yù)防、評估和干預(yù)提供新的啟示和方向。進(jìn)一步明確PDI 家族調(diào)控血小板活化和凝血系統(tǒng)激活的調(diào)控機(jī)制，有助于開發(fā)以二硫鍵異構(gòu)酶為靶向，同時具有阻斷血小板活化和凝血系統(tǒng)激活的雙重作用的抗血栓藥物的研發(fā)。同時由于目前無有效而特異的工具來進(jìn)行研究，對PDI 在血栓形成中的認(rèn)識仍存在不少缺陷，而其也將成為新的熱點(diǎn)。

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