張澤棟，劉繼棟，陸海勤，杭方學(xué)，2，李 紅，史昌蓉，李 凱，2，3，*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004; 2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西南寧530004; 3.廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530004)

α-葡聚糖酶又稱右旋糖酐酶，是一種專一性裂解葡萄糖分子中α-1，6糖苷鍵的水解酶，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、化工等領(lǐng)域［1-2］。自然界中能生產(chǎn)α-葡聚糖酶的微生物為細(xì)菌及真菌，如NovoNordisk從青霉屬等微生物中分離得到α-葡聚糖酶［3］。然而，野生菌或野生植物來(lái)源的α-葡聚糖酶產(chǎn)量普遍較低，僅有約31.0U/m L［4］。盡管有研究人員采用物理或化學(xué)誘變方式來(lái)獲取高產(chǎn)α-葡聚糖酶生產(chǎn)菌［5］，但并未見到較為成功的報(bào)道。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，α-葡聚糖酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在工程菌如畢赤酵母(Pichia pastoris)高效表達(dá)［6］。然而，由于工程菌來(lái)源的α-葡聚糖酶的安全性存在較大爭(zhēng)議，使得其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制［6］。因此，開發(fā)一種高效、安全、廉價(jià)的葡聚糖酶成為食品、藥品工業(yè)面臨的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

細(xì)麗毛殼菌為一種絲狀真菌，是美國(guó)及歐盟認(rèn)可的一種食品安全性菌株［7］。在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)麗毛殼菌向發(fā)酵液中分泌葡聚糖酶［8］。然而，由于細(xì)麗毛殼菌有較強(qiáng)的自絮凝性，會(huì)使得菌體以絮凝團(tuán)形態(tài)懸浮于發(fā)酵液中，限制了菌體與培養(yǎng)基、空氣的接觸比表面積，導(dǎo)致葡聚糖酶酶活性較低，較難達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用水平［9］。研究人員嘗試了添加玻璃珠或機(jī)械攪拌等方法以降低菌體絮凝現(xiàn)象，然而這些方法都未能較好的解決菌體絮凝問(wèn)題［10］。

以往的研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲場(chǎng)誘發(fā)的超聲空化作用［11］對(duì)部分微生物的菌體生長(zhǎng)或發(fā)酵產(chǎn)率具有促進(jìn)作用［12］，促進(jìn)了聲學(xué)技術(shù)在發(fā)酵工程領(lǐng)域的應(yīng)用。Matsuura等用43kHz的低頻超聲場(chǎng)處理釀酒酵母發(fā)酵液后證實(shí)，低頻超聲場(chǎng)能促進(jìn)酵母繁殖，縮短發(fā)酵時(shí)間50%～60%［13］。Avhad DN等發(fā)現(xiàn)低頻超聲場(chǎng)可使得以球形芽孢桿菌為來(lái)源的纖維蛋白溶解酶活性提升1倍［14］。Toba將超聲波用于乳制品發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)超聲處理可以將乳酸桿菌的活力提高50%［15］。本研究考察了低頻超聲場(chǎng)對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶的影響。研究證實(shí)，在細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖酶過(guò)程中使用低頻超聲場(chǎng)，酶活提高87.9%，菌體生物量提高25.0%。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細(xì)麗 毛 殼 菌 (Chaetomium Gracile，菌 號(hào)CGMCC3.3783) 購(gòu)自中國(guó)微生物菌種資源庫(kù)(CGMCC);葡聚糖T2000、右旋糖酐粗酐、葡萄糖、酵母浸膏 均為山東金洋藥業(yè)生物有限公司提供;丙三醇、3，5-二硝基水楊酸 天津化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鉀、檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂 均為南寧藍(lán)天實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供;所有試劑均為分析純。

ZHJH1115型超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;DELTA-320型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2501PC紫外分光光度計(jì)日本島津公司;JM-B2003電子天平 南京東邁科技儀器有限公司;LSQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;HHS型恒溫水浴鍋 上海雷韻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZHWY-211C型恒溫培養(yǎng)搖床器 上海智城分析儀器制造有限公司; SB-400DTY型超聲波掃頻清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備、發(fā)酵條件以及酶活的測(cè)定 取馬鈴薯浸取液1.0L、葡萄糖20.0g制成種子液體培養(yǎng)基，用接種環(huán)在無(wú)菌條件下至少挑取2環(huán)細(xì)麗毛殼菌并接種到種子液體培養(yǎng)基中，用250m L的三角瓶裝液，裝液量為25m L，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的28℃恒溫培養(yǎng)搖床器中培養(yǎng)32h［8］。

將1.0%葡聚糖，0.5%酵母浸膏，0.1%磷酸氫二鉀，0.02%硫酸鎂制成發(fā)酵培養(yǎng)基并用0.1mol/L的檸檬酸-0.2mol/L的磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.0。用250m L的三角瓶裝液，裝液量為25m L，在無(wú)菌條件下用移液槍從種子液體培養(yǎng)基中吸取0.5m L即2%的培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在200r/min轉(zhuǎn)速條件下的28℃恒溫培養(yǎng)搖床器中培養(yǎng)72h［8］。

細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵液在4700 r/m in、4℃條件下離心15min，得到的上清液即為α-葡聚糖酶粗酶液［8］。取900μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的葡聚糖溶液，置于50℃恒溫水浴中保溫5m in，隨即加入100μL酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，立即加入2m L的DNS以終止反應(yīng)，于沸水浴5min，迅速將其冷卻，用蒸餾水定容至25m L，于波長(zhǎng)540nm處測(cè)定吸光值。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得相對(duì)應(yīng)的葡萄糖的量，并折算出酶活。酶活定義為:在上述條件下，每分鐘從葡聚糖底物中釋放出1μmoL還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，以U/m L表示［16］。

1.2.2 超聲處理?yè)u床組與普通搖床組培養(yǎng)條件 最初超聲處理?xiàng)l件為超聲頻率24kHz、超聲時(shí)間1min/ 20m in、超聲功率50W，每次超聲處理后將三角瓶放入搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵周期72h，溫度28℃。普通搖床培養(yǎng)組在溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r/m in條件下恒溫培養(yǎng)72h，與超聲處理組形成對(duì)照。

1.2.3 最適超聲條件的確定 采用單因素實(shí)驗(yàn)方法，在超聲時(shí)間1m in/20m in，超聲頻率24kHz的條件下，分別選擇超聲功率為0、50、300和500W進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵72h后測(cè)發(fā)酵液酶活，確定最適超聲功率。

在已確定的超聲功率以及超聲頻率24kHz的條件下，分別選擇0、10s/20min、20s/20min、30s/20min、40s/20min、50s/20m in以及1m in/20m in為超聲作用時(shí)間，發(fā)酵72h后測(cè)發(fā)酵液酶活，確定最適超聲時(shí)間。

在已確定的超聲功率、時(shí)間的條件下分別選擇0、20、25、33、53及80kHz為超聲頻率，發(fā)酵72h后測(cè)發(fā)酵液酶活，從而確定最適超聲條件。

1.2.4 恒重法測(cè)量菌體干重以及菌體曲線的繪制

從發(fā)酵開始每隔8h在無(wú)菌操作臺(tái)將發(fā)酵液完全倒入50m L離心管中，在4700 r/m in條件下離心15m in，將菌體分離出來(lái)，然后將菌體移入已稱量過(guò)重量的坩堝中，置于100～105℃的鼓風(fēng)干燥箱干燥6～8h，烘干至恒重［17］。將干燥的樣品用分析天平進(jìn)行稱重，記錄菌體的干重。然后以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)得的菌體干重為縱坐標(biāo)，繪制菌體曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)表示，用Origin8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖，對(duì)部分?jǐn)?shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲場(chǎng)對(duì)α-葡聚糖酶活性的影響的初步探索

以往的研究證實(shí)，增加機(jī)械攪拌強(qiáng)度并未能有效提高自絮凝絲狀菌的發(fā)酵產(chǎn)酶效率［18］，這可能與機(jī)械攪拌形成的剪切力對(duì)菌體造成損傷有關(guān)。因此，傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌促進(jìn)傳質(zhì)方式并不適合于自絮凝性較強(qiáng)的絲狀真菌的發(fā)酵過(guò)程。

在現(xiàn)代發(fā)酵過(guò)程中引入聲學(xué)技術(shù)正逐步得到學(xué)者的認(rèn)可［18］，研究表明適宜的低頻超聲場(chǎng)不僅能夠起到促進(jìn)菌體分散，而且能夠產(chǎn)生胞內(nèi)微流，改變菌體細(xì)胞膜的滲透性，加強(qiáng)物質(zhì)的運(yùn)輸，進(jìn)而增強(qiáng)微生物菌體的代謝活性［19］。

為研究超聲場(chǎng)對(duì)α-葡聚糖酶活性的影響，以超聲技術(shù)處理后的搖床培養(yǎng)和普通搖床培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)照。研究表明，在初始超聲條件下，超聲處理后發(fā)酵液酶活為116.9U/m L，比普通的搖床培養(yǎng)提高了14.8%，可有效地促進(jìn)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶，提高菌體分泌酶量(圖1A)。用恒重法對(duì)2種不同處理?xiàng)l件下的發(fā)酵液菌體量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵48h時(shí)兩種發(fā)酵液菌體干重均達(dá)到最大值，超聲處理后的發(fā)酵液菌體干重為6.405g而空白組僅為6.008g，利用超聲技術(shù)處理發(fā)酵液比起搖床組可以將菌體量提高9.4%(圖1B)。說(shuō)明超聲技術(shù)可顯著提高細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵液酶活以及菌體生物量。

圖1 超聲處理與搖床培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵液酶活(A)及菌體量(B)的影響Fig.1 Influence of ultrasonic treatment and shaking table on fermentation liquid enzyme activity(A) and cell dry weight(B)

2.2 最適超聲功率的確定

本研究通過(guò)設(shè)置不同的功率參數(shù)來(lái)考察超聲功率對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵過(guò)程的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲功率為50W與300W時(shí)發(fā)酵液酶活均高于空白組，酶活與超聲功率呈正相關(guān)關(guān)系，尤其當(dāng)超聲功率為300W時(shí)酶活為127.4U/m L比空白組酶活提高15.6%。而當(dāng)超聲功率為 500W 時(shí)，酶活僅為91.0U/m L，反而對(duì)酶產(chǎn)量起抑制作用(圖2A)。同時(shí)用300W超聲功率與空白組進(jìn)行對(duì)照，用恒重法對(duì)2種不同功率條件下的發(fā)酵液菌體量進(jìn)行測(cè)定。研究表明，當(dāng)超聲功率為300W時(shí)可以有效地提高菌體生物量，在48h時(shí)菌體干重達(dá)到最大值7.050g，在40h時(shí)菌體干重為6.910g比起空白組提高了17.0%(圖2B)。由于微生物種類不同，其最適超聲強(qiáng)度的需求也不盡相同［20］。在前期的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們證實(shí)了低頻超聲對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶具有促進(jìn)作用，而較高頻率下的超聲場(chǎng)的空化作用容易抑制細(xì)麗毛殼菌的發(fā)酵進(jìn)程［20］。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇超聲功率為300W。

圖2 超聲功率對(duì)酶活(A)以及菌體量(B)的影響Fig.2 Influence of ultrasonic power on enzyme activity(A)and cell dry weight(B)

2.3 最適超聲場(chǎng)作用時(shí)間的確定

通過(guò)設(shè)置不同的時(shí)間參數(shù)來(lái)考察了超聲作用時(shí)間對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵過(guò)程的影響。研究表明，隨著超聲作用時(shí)間的增加，發(fā)酵液酶活呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)?？瞻捉M酶活為 100.9U/m L，在 20s/ 20m in時(shí)酶活最高達(dá)到175.8U/m L，提高了74.2%，隨后酶活逐漸下降，而當(dāng)超聲時(shí)間為1m in/20m in時(shí)酶活僅為127.8U/m L(圖3A)。同時(shí)用20s/20m in的超聲時(shí)間與空白組進(jìn)行對(duì)照，用恒重法在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)2種不同超聲時(shí)間條件下的菌體量進(jìn)行測(cè)定，研究表明，當(dāng)超聲時(shí)間為20s/20min時(shí)菌體干重在56h時(shí)為6.800g比起空白組可顯著提高菌體量，提高了19.3%(圖3B)，而過(guò)長(zhǎng)的超聲作用時(shí)間容易對(duì)菌體造成較大的傷害。故選擇20s/20m in為最適超聲場(chǎng)作用時(shí)間。

2.4 最適超聲頻率的確定

雖然上述結(jié)果證實(shí)超聲場(chǎng)有利于發(fā)酵生產(chǎn)，然而并非所有頻率的超聲對(duì)菌體生長(zhǎng)都起著促進(jìn)作用，其促進(jìn)效果也不盡相同。比如，高頻超聲場(chǎng)的穩(wěn)態(tài)空化作用較強(qiáng)，空化作用產(chǎn)生的微射流都能造成細(xì)胞的損傷甚至死亡，對(duì)菌體細(xì)胞造成的損傷較大［19］。因此，學(xué)者在一般選擇使用較低頻率的超聲場(chǎng)，如Schl?fer等發(fā)現(xiàn)低頻超聲場(chǎng)可以明顯改善生物活性，提高生物量2.3倍［21］。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)酶活(A)以及菌體量(B)的影響Fig.3 Influence of ultrasonic time on enzyme activity(A)and cell dry weight(B)

本研究通過(guò)設(shè)置不同的頻率參數(shù)來(lái)考察超聲頻率對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵過(guò)程的影響，并考察最適超聲處理?xiàng)l件。數(shù)據(jù)表明，空白組酶活為102.9U/m L，當(dāng)超聲頻率為 20kHz時(shí)發(fā)酵液酶活最高達(dá)到193.4U/m L，提高了87.9%，提升效果較為明顯。之后發(fā)酵液酶活與超聲頻率呈反比例關(guān)系，在80kHz時(shí)酶活僅為93.5U/m L。由此可見，20kHz為最適超聲頻率，隨著頻率的繼續(xù)增強(qiáng)，超聲對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵過(guò)程并未起到更大的促進(jìn)作用，而過(guò)高的超聲頻率對(duì)細(xì)麗毛殼菌分泌α-葡聚糖酶起到抑制的作用(圖4)。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定超聲功率300W，超聲時(shí)間20s/20m in，超聲頻率 20kHz為最適超聲處理?xiàng)l件。

2.5 最適低頻超聲場(chǎng)對(duì)菌體自絮凝現(xiàn)象以及菌體生物量的影響

菌體形態(tài)是影響絲狀真菌生長(zhǎng)代謝的重要因素，發(fā)酵液中較好的菌絲體形態(tài)可以為菌體生長(zhǎng)、繁殖及代謝提供良好的基礎(chǔ)［22］。在自絮凝菌株內(nèi)，由于菌體在發(fā)酵過(guò)程中聚集成球團(tuán)導(dǎo)致菌體不能呈現(xiàn)最適菌體形態(tài)，從而影響了其與培養(yǎng)基的傳質(zhì)過(guò)程，造成菌體生長(zhǎng)代謝緩慢［23］。因此，對(duì)于存在自絮凝性狀的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程，應(yīng)該考慮的關(guān)鍵問(wèn)題之一就是在不損傷菌體的情況下提高菌體的分散性，從而使菌體在發(fā)酵液中呈現(xiàn)較好的菌體形態(tài)，增加與培養(yǎng)基接觸的比表面積，從而提高菌體酶的分泌量與菌體生物量［24］。

圖4 超聲頻率對(duì)酶活的影響Fig.4 Influence of ultrasonic frequency on enzyme activity

為考察最適超聲處理?xiàng)l件對(duì)菌體自絮凝現(xiàn)象的影響，本研究利用最適超聲處理?xiàng)l件超聲技術(shù)處理發(fā)酵液，與搖床培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液進(jìn)行對(duì)比。相比與單純搖床培養(yǎng)，低頻超聲輔助搖床培養(yǎng)呈現(xiàn)出更好的菌體分散性(圖5)。

圖5 搖床處理(A)與超聲處理(B)對(duì)菌體自絮凝現(xiàn)象的影響Fig.5 Influence of shaking table(A)and ultrasonic treatment(B)on phenomenon of cell flocculation

按照恒重法測(cè)量菌體干重并繪制菌體生長(zhǎng)曲線，在發(fā)酵0～16h內(nèi)，菌體較少，超聲處理后發(fā)酵液菌體與搖床培養(yǎng)菌體干重?zé)o明顯區(qū)別，在發(fā)酵32h后，超聲處理后的細(xì)麗毛殼菌菌體干重明顯大于超聲培養(yǎng)條件下的菌體干重，在40h時(shí)超聲處理后發(fā)酵液干重為7.622g，而空白組為6.370g在發(fā)酵48h時(shí)菌體干重達(dá)到最大值7.871g，比起空白組6.299g提高了25%。之后菌體的生長(zhǎng)情況逐漸減緩，但在發(fā)酵后期超聲處理后菌體量的減少的速度小于搖床培養(yǎng)。事實(shí)證明，低頻超聲處理可以有效提高發(fā)酵液的酶活，這是由于低頻超聲場(chǎng)可以有效地解決菌體絮凝問(wèn)題，使得菌體從球團(tuán)狀分散開來(lái)，增加菌體酶的分泌量，提高細(xì)麗毛殼菌生物量(圖6)以及產(chǎn)酶效率(圖4)。其中，在發(fā)酵前期，菌體數(shù)量較少，并未出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，超聲處理組與搖床組菌體量無(wú)顯著差異。隨著菌體的增多，菌體絮凝現(xiàn)象的加劇，低頻超聲處理的發(fā)酵液中呈現(xiàn)了較高的菌體分散性、生物量及酶活性，恰好也證明了低頻超聲場(chǎng)對(duì)降低細(xì)麗毛殼菌絮凝現(xiàn)象及提高酶產(chǎn)量所起的促進(jìn)作用。

通過(guò)菌體生長(zhǎng)曲線可以看出當(dāng)菌體干重達(dá)最大值7.871g時(shí)，超聲處理組比起搖床組干重增加25.0%，證明低頻超聲場(chǎng)有利于提高菌體生物量(圖6)。

圖6 最適超聲條件對(duì)菌體量的影響Fig.6 Influence of optimum ultrasonic treatment on cell dry weight

3 結(jié)論

本研究通過(guò)超聲時(shí)間、超聲頻率、超聲功率這些因素考察了超聲場(chǎng)對(duì)細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵過(guò)程的影響。研究發(fā)現(xiàn)，利用低頻超聲技術(shù)處理細(xì)麗毛殼菌發(fā)酵液可以提高發(fā)酵液中α-葡聚糖酶產(chǎn)量以及酶活。最佳超聲場(chǎng)條件為超聲時(shí)間20s/20min，超聲頻率20kHz，超聲功率300W，此時(shí)酶活最高為193.4U/m L，同比空白對(duì)照組提高87.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于超聲技術(shù)應(yīng)用于毛殼菌發(fā)酵過(guò)程有一定的意義，同時(shí)可為類似的絮凝性真菌的發(fā)酵過(guò)程提供借鑒。

［1］Zohra RR，Aman A，Ansari A，et al.Dextranase:Hyper production of dextran degradinenzyme fromnewly isolated strain of Bacillus licheniformis［J］.Carbohydrate polymers，2013，92(2): 2149-2153.

［2］蔣丹，仇元新，胡濤，等.口腔鏈球菌右旋糖酐酶分子結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，35(3): 249-251.

［3］Novo Nordisk A/S.A dextran decomposing enzyme for the sugar industry［P］.Denmark:product data information 112-GB.1977:3-5.

［4］Sarkar D，Day DF.Dextran analysis::Amodifiedmethod［J］.JASSCT，1986(6):102-107.

［5］楊月芬.產(chǎn)β-葡聚糖酶菌株的誘變育種、發(fā)酵產(chǎn)酶及其性質(zhì)研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2008.

［6］梁達(dá)奉.α-葡聚糖酶的基因工程菌構(gòu)建、發(fā)酵及其應(yīng)用研究［D］.廣州:廣東工業(yè)大學(xué)，2011.

［7］孫彩霞，董國(guó)堃，章強(qiáng)華.歐盟、美國(guó)、日本食品中豁免物質(zhì)的比較研究［S］.農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2009，1:49-51.

［8］麻少瑩，陸海勤，杭方學(xué)，等.α-葡聚糖酶發(fā)酵工藝與酶活影響因素研究［J］.食品科學(xué)，201，34(7):171-174.

［9］Akira I，Kazoo N，Seizi I，et al.A bacteriolytic enzyme fromchaetomium globosum，a marine isolate［J］.Archivfur Mikrobiologie，1973，91(1):41-54.

［10］Kelly S，Grimm LH，Bendig C，et al.Effects of fluid dynamic induced shear stress on fungal growth andmorphology［J］.Process Biochemistry，2006，41(10):2113-2117.

［11］Belova V，Gorin DA，Shchukin DG.Selective ultrasonic cavitation on patterned hydrophobic surfaces［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2010，49(39):7129-7133.

［12］Feng Wu.The effect of ultrasonic treatment on biological hydrogen production from anaerobic fermentation of sludge［J］.Journal of Biotechnology，2008，136:646.

［13］Matsuura K，Hirotsune M，Nunokawa Y，et al.Acceleration of cell growth and ester formation by ultrasonic wave irradiation［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1994，77(1): 36-40.

［14］Avhad DN，Rathod VK.Ultrasound stimulated production ofa fibrinolytic enzyme［J］.Ultrasonics Sonochemistry，1994，21 (1):182-188.

［15］Barati A，Mokhtari-DizajiM.Ultrasound dose fractionation in sonodynamic therapy［J］.Ultrasound Med Biol，2010，36(6): 880-887.

［16］王俊麗，聶國(guó)興，曹香林，等.不同DNS試劑測(cè)定木糖含量的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(7):1-4.

［17］李瑞洲，鄭元生.鍍銀纖維抗菌性實(shí)驗(yàn)研究［J］.棉紡織技術(shù)，2009，37(5):31-33.

［18］Sinisterra JV.Applicalication of ultrasound to biotechnology: an overview［J］.Ultrasonics.1992，30(3):180-185.

［19］Wu H，Hulbert G，Mount J.Effects of ultrasound on milk homogenization and fermentation with yogurt starter［J］.Innovative Food Science＆Emerging Technologies，2000，1(3):211-218.

［20］Chuanyun D，Bochu W，Chuanren D，et al.Low ultrasonic stimulates fermentation of riboflavin producing strain Ecemothecium ashbyii［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2003，30(1-2):37-41.

［21］Schl?fer O，Sievera M，Klotzbucher H，et al.Improvement of biological activity by low energy ultrasound assisted bioreactors［J］.Ultrasonics，2000，38(1-8):711-716.

［22］Papagianni M.Fungalmorphology and metabolite production in submerged mycelial processes［J］.Biotechnology Advances，2004，22(3):189-259.

［23］Papagianni M，Joshi N，Moo-Young M.Comparative studies on extracellular protease secretion and glucoamylase production by free and immobilized Aspergillus niger cultures［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2002，29(5): 259-263.

［24］Cui YQVR，Luyben KCAM.Effect of agitation intensities on fungal morphology of submerged fermentation［J］.Biotechnology and Bioengineering，1997，55(2):715-725.