羅 濤 綜述，王彤敏，李力燕審校

（昆明醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，昆明650500）

細(xì)胞增殖是細(xì)胞在周期調(diào)控因子的作用下，通過DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等一系列復(fù)雜反應(yīng)而進(jìn)行的分裂過程，是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)［1］。細(xì)胞增殖檢測廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤生物學(xué)、藥理學(xué)等研究領(lǐng)域，是評價細(xì)胞代謝、生理和病理狀況的重要方法［2］。目前，常用的方法包括胸腺嘧啶核苷滲入法、MTT檢測法、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法等。但最直接精確的就是利用胸腺嘧啶核苷酸類似物檢測新合成的DNA，即5－乙炔基－2′脫氧尿嘧啶核苷（5－ethynyl－2′－deoxyuridine，EdU）和5－溴－2′－脫氧尿嘧啶核苷（5－bromo－2′－deoxyuridine，BrdU）標(biāo)記［3］。

1 EdU檢測增殖細(xì)胞的特點(diǎn)及原理

EdU是一種胸腺嘧啶核苷的類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是脫氧胸腺嘧啶環(huán)上與5位C原子相連的甲基被乙炔基取代，在S期細(xì)胞增殖時可作為底物摻入到正在復(fù)制的DNA鏈中，通過與染料的共軛反應(yīng)可以進(jìn)行高效快速的細(xì)胞增殖檢測［4－5］，其中，乙炔基能夠與一種熒光標(biāo)記的小分子疊氮化合物探針反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)是一種被稱作“click”化學(xué)作用的Cu＋催化的環(huán)加成作用［6－7］。EdU 的［3＋2］環(huán)加成作用由Cu＋催化完成，由于Cu＋鹽的低溶解度，Cu＋通常以配基的形式引入到［3＋2］環(huán)加成作用之中［8］。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色比較，EdU反應(yīng)非常快速，能在幾分鐘內(nèi)完成，且不需要進(jìn)行DNA變性處理，只需簡單的幾個步驟，使得組織成像更簡單易行［4］，因此也適用于高通量篩選試驗(yàn)，尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn)［9－10］。

2 EdU標(biāo)記技術(shù)在細(xì)胞增殖檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

近年來，EdU標(biāo)記技術(shù)在檢測細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮了重要作用，使用范圍越來越廣泛。有學(xué)者［11］將EdU作為細(xì)胞增殖的分子探針，應(yīng)用于高含量的siRNA（high－content siRNA，HCS）篩選試驗(yàn)，對細(xì)胞增殖進(jìn)行評估。Ohno等［12］首次并成功利用噬菌體熒光標(biāo)記與EdU來評估噬菌體的宿主范圍，并揭示EdU可能會應(yīng)用于各種類型的噬菌體。Guo等［13］通過腹腔注射EdU，檢測GK及Wistar大鼠導(dǎo)管球囊損傷后新生內(nèi)膜形成的DNA合成情況，驗(yàn)證了EdU摻入和染色是血管內(nèi)膜檢測DNA合成快速、有效的手段。Wiebusch等［14］使用EdU和流式細(xì)胞儀研究人巨細(xì)胞病毒細(xì)胞周期的基因表達(dá)。Sun等［15］發(fā)現(xiàn)，EdU陽性細(xì)胞數(shù)與EdU濃度，孵育時間，以及“click”反應(yīng)溶液的體積相關(guān)，最佳的EdU濃度10～50 μmol／L，最佳孵育時間為8～12h。Hoshi等［16］通過把 EdU摻入到DNA中，產(chǎn)生復(fù)制帶，分析復(fù)制帶染色體結(jié)構(gòu)，對染色體高級結(jié)構(gòu)的功能意義提出了新的見解。Zhao等［17］發(fā)現(xiàn)EdU與DNA的結(jié)合會誘導(dǎo)DNA損傷，并通過細(xì)胞周期擾亂細(xì)胞的進(jìn)展，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此外，在非小細(xì)胞肺腺癌A549細(xì) 胞 上 進(jìn) 行 了 測 試［18－19］。Andersen等［20］的 研 究 發(fā) 現(xiàn) ，EdU在體外和體內(nèi)都對細(xì)胞存活具有很高的沖擊，從體內(nèi)移植到再生肌肉，EDU標(biāo)記的干細(xì)胞難以存活，即使在低EdU濃度下，細(xì)胞存活和表型都大幅受損，肌分化潛能也受到抑制。Kohlmeier等［21］使用EdU標(biāo)記小鼠胚胎干細(xì)胞后得出結(jié)論，EdU的使用對DNA標(biāo)記是有限的，因?yàn)殚L時間的培養(yǎng)將發(fā)生一定程度的EdU依賴性細(xì)胞周期擾動和細(xì)胞死亡，不同細(xì)胞系中細(xì)胞死亡的程度與EdU的摻入量有關(guān)，減少標(biāo)記過程中EdU使用濃度很可能會限制其對細(xì)胞增殖的影響。

3 BrdU檢測增殖細(xì)胞的特點(diǎn)及原理

BrdU是另一種嘧啶類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是溴替代了胸腺嘧啶環(huán)與5位C原子連接的甲基，可競爭性摻入到S期新合成的DNA中，利用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記增殖細(xì)胞［22］，如同時結(jié)合其他細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙重染色，可判斷細(xì)胞種類及增值速度，對研究細(xì)胞動力學(xué)有重要意義。目前，BrdU標(biāo)記新合成DNA的方法在動物細(xì)胞組織的腫瘤生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［23］。

4 BrdU標(biāo)記技術(shù)在細(xì)胞增殖檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

80年代以來，國外對BrdU標(biāo)記方法進(jìn)行了大量研究，其作為DNA前體類似物替代摻入S期細(xì)胞，陽性結(jié)果表達(dá)了S期細(xì)胞新合成DNA的水平。研究發(fā)現(xiàn)，BrdU用于神經(jīng)前體細(xì)胞的研究，克服了以往實(shí)驗(yàn)方法無法對原位標(biāo)記新生細(xì)胞的增殖及分化進(jìn)行觀察的缺點(diǎn)，用于原位標(biāo)記齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞可以準(zhǔn)確地反映成年腦組織神經(jīng)發(fā)生水平［24－26］。Tanaka等［27］用BrdU和Ki67抗體通過熒光雙標(biāo)染色和過氧化物酶免疫組化，準(zhǔn)確測定增殖細(xì)胞中S期分?jǐn)?shù)。Ogawa等［28］則通過對孕鼠進(jìn)行腹腔注射BrdU，清楚地觀察到新生鼠嗅覺系統(tǒng)相關(guān)的大腦區(qū)域c－Fos蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。Schmuck等［29］通過用BrdU摻入標(biāo)記新生成的神經(jīng)干細(xì)胞，快速地追蹤到其最終位置，并量化BrdU陽性細(xì)胞的密度。Bonvicini等［30］利用BrdU標(biāo)記準(zhǔn)確定位微小病毒B19感染的細(xì)胞，并在增殖細(xì)胞體外感染的過程中測定DNA含量，發(fā)現(xiàn)BrdU劑量不受細(xì)胞和病毒復(fù)制的干擾，是研究病毒－宿主之間相互作用及不同疾病病因作用的有價值的工具。Vermeulen等［31］用BrdU標(biāo)記技術(shù)檢測和鑒定特異性貓T淋巴細(xì)胞病毒抗原體外增殖反應(yīng)。Ivashkina等［32］通過BrdU標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在訓(xùn)練的影響下，小鼠大腦中各種結(jié)構(gòu)的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)增加，表明DNA合成增加。Portugal等［33］利用BrdU和綠色熒光蛋白表達(dá)，隔離了非洲豬瘟病毒重組體，進(jìn)一步為野生型病毒基因組的處理提供了有效方法。然而，細(xì)胞的生長特性也會受到BrdU的影響，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)分化異常、毒性反應(yīng)、增殖抑制、DNA突變及細(xì)胞周期延長等變化［34－35］。值得注意的是，BrdU的標(biāo)記率不高且對標(biāo)記細(xì)胞具有一定的毒性，毒性作用將隨著標(biāo)記時間的延長而增強(qiáng)，在體外應(yīng)用時毒性較大，而應(yīng)用于體內(nèi)時，毒性明顯減輕［34－36］。

5 EdU標(biāo)記與BrdU標(biāo)記方法的比較

首先，相比于BrdU檢測方法，EdU在DNA合成的過程中引入快速“click”化學(xué)反應(yīng)，并且不需要苛刻的、化學(xué)性的或DNA結(jié)構(gòu)酶的破壞［37］。而BrdU抗體分子大，摻入雙鏈DNA內(nèi)的BrdU，以氫鏈與腺嘌呤結(jié)合，不能直接與BrdU抗體反應(yīng)，需經(jīng)解鏈暴露出DNA雙鏈中的BrdU方能被染色。DNA內(nèi)部較難變性，如需在測定細(xì)胞增殖能力的同時檢測細(xì)胞的總DNA含量，變性條件下的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，其他核酸標(biāo)記探針就不容易識別DNA，因而也無法準(zhǔn)確統(tǒng)計新合成DNA總量。DNA變性可能破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗原識別位點(diǎn)，限制了BrdU檢測法中同時檢測其他蛋白的應(yīng)用［38－39］。其次，EdU只有BrdU抗體大小的1／500，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，不需要嚴(yán)格的樣品變性處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細(xì)胞增殖的真實(shí)情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度［40］。但是，與BrdU一樣，EdU也有毒性，EdU的摻入會對裂殖的DNA產(chǎn)生損傷，影響細(xì)胞的連續(xù)繁殖［41］。同樣類似的毒害效應(yīng)也發(fā)生在EdU標(biāo)記動物細(xì)胞基因組DNA時，表明EdU只能用于短時期和單細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)標(biāo)記，而BrdU則適用于連續(xù)標(biāo)記多個細(xì)胞周期［5］。

6 結(jié) 語

EdU與BrdU標(biāo)記作為兩種胸苷類似物摻入到新合成的DNA鏈中來檢測細(xì)胞增殖，是一種新型的非放射性同位素細(xì)胞增殖檢測方法，在細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)體組織及臨床研究均得到了廣泛的應(yīng)用。但兩種方法都各有長短，所以，在具體的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c實(shí)驗(yàn)要求，使用多種檢測手段，以便更加簡單、快速、準(zhǔn)確地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雙重或多重標(biāo)記往往會達(dá)到事半功倍的效果。在未來的科研進(jìn)程中，EdU和BrdU標(biāo)記肯定會繼續(xù)發(fā)揮其突出的作用，當(dāng)然，新的細(xì)胞增殖檢測手段也必然會隨之產(chǎn)生。

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