馬玉梅，馮若飛，2，李　倬*

(1. 甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；

2.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030)

牛皰疹病毒1型檢測技術及疫苗研究進展

馬玉梅1，馮若飛1，2，李倬1*

(1. 甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；

2.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030)

[摘要]牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是由牛皰疹病毒I型( Bovine herpes virus-1, BHV-1)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病.該病毒的危害性在于病毒侵入牛機體后，潛伏在一些特定的部位，致使病毒持續(xù)性感染，病牛長期甚至終身帶毒，給控制和消滅本病帶來很大困難，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了重大經濟損失.文章就BHV-1分子生物學、診斷及各類疫苗進行闡述，旨在為該病的進一步研究提供理論參考.

[關鍵詞]牛皰疹病毒I型；檢測技術；疫苗研究

牛皰疹病毒I型( Bovine herpes virus-1,BHV-1)，又稱牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)，它是全球公認的牛傳染性鼻氣管炎(IBR)的致病因子，它具有典型的泛嗜性，能感染多種器官和組織，并且具有多種臨床癥狀.該病表現(xiàn)為呼吸道黏膜及氣管黏膜發(fā)炎、呼吸困難、結膜炎、腦膜炎，使懷孕母牛流產，還可引起母牛傳染性膿疤性外陰陰道炎(IPV)、公牛傳染性膿疤性龜頭包皮炎(IPB).該病毒也與中樞神經紊亂有關[1,2].美國于1955年首次報導了該病，1956年Madin第一次從病牛中分離到BHV-1.我國是在20世紀80年代初由周泰沖等首次從新西蘭進口奶牛中分離得到該病毒[3].BHV-1主要感染的宿主為牛，其中較為多見的是肉牛，其次是奶牛，又以20~60日齡的犢牛最為易感.據(jù)報道，本病毒能使山羊、豬和鹿感染發(fā)病[4].目前，我國大多數(shù)省市和地區(qū)的各類牛群中也有此病毒感染，且呈現(xiàn)上升趨勢，對牛群育肥率、產奶量和繁殖率產生了嚴重影響，一定程度上阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，也對我國動物和動物產品的國際貿易帶來不良影響.

1BHV-1分子生物學特征

1964年Huck確認BHV-1屬于皰疹病毒，屬a-皰疹病毒亞科，水痘病毒屬,球形有囊膜病毒.該病毒成熟的病毒粒子直徑約為150 nm~220 nm，核衣殼為二十面體，直徑約80 nm~ll0 nm，表面有162個殼粒.牛皰疹病毒1型的抵抗力較強，在pH 4.5~5.0時不穩(wěn)定，pH 6.0~9.0時穩(wěn)定，在pH 7.0的細胞培養(yǎng)液內最穩(wěn)定.BHV-1對溫度十分敏感，37 ℃時，經10 h左右即死亡一半，56 ℃經21 min即可滅活.22 ℃保存5天，BHV-1毒價可下降到1/10；4 ℃以下保存30天，其毒價幾乎不變；-70 ℃可保存數(shù)年.該病毒對胰蛋白酶、酸性和堿性磷脂酶等較敏感，對有機溶劑氯仿、酚類、甲醛亦敏感[5].

BHV-1基因組為雙股線性DNA分子，基因組全長約為137 kb，其中鳥嘌呤和胞嘧啶(G+C)的含量高達72%，由一個長獨特區(qū)(UL)和一個短獨特區(qū)(US)序列構成.US區(qū)一端是內部重復序列(IR)，另一端是外部重復序列(TR).1995年，完成了對BHV-1的基因組測序[6].BHV-1的所有基因可以分成兩大類：非必需基因和必需基因.病毒缺失了某些基因以后仍然可以在體外增殖，這些基因就被稱為非必需基因.反之，若缺失了某些基因后可引起致死性突變的基因，則被稱為必需基因.BHV-1基因組編碼的約70個基因中有30%以上的基因在病毒增殖中是非必需的[5].BHV-1基因編碼很多種蛋白，包括與核酸代謝、DNA合成以及蛋白組裝有關的蛋白[7].BHV-1基因編碼約33種結構蛋白[8]，其中13種為囊膜蛋白[9]，10種為糖蛋白[10].目前已知的糖蛋白有gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK和gL，主要囊膜糖蛋白為gB、gC和gD.其中UL區(qū)編碼了6種糖蛋白分別是：gK (UL53)、gC (UL44)、gB (UL27)、gH (UL22)、gM(UL10)、gL(UL1)；US區(qū)編碼了gG (UL4)、gD (UL6)、gI (US7)和gE (US8)4個糖蛋白.研究表明，gB、gC、gD等糖蛋白與病毒吸附宿主細胞以及病毒在細胞間擴散有關，其中gB、gC、gD是引起宿主免疫應答的主要抗原，gD能誘導最高水平的體液和細胞免疫反應[11,12]，編碼gC, gD, gE, gG, gl, UL49h以及胸腺激酶(TK)的基因與病毒毒力有關[13-20].gE 的存在對病毒有效地感染中樞神經系統(tǒng)方面有重要作用，gE是病毒復制非必需的，這有望成功研制基因缺失疫苗.缺失gE特定部位的編碼區(qū)能降低疫苗的毒力并能抗病毒地入侵.薛飛等[21]研究表明，gE 可用于建立ELI SA 診斷方法.

2BHV-1診斷技術

牛傳染性鼻氣管炎IBR可結合臨床癥狀、病理變化和流行病學作出初步診斷，但確診需依靠實驗室檢查.IBR 的實驗室診斷方法主要包括病毒分離鑒定、免疫組織化學檢測以及血清學和分子生物學技術等.

2.1　病毒分離鑒定

牛腎或睪丸的單層細胞、牛腎傳代細胞(MDBK)和牛氣管傳代細胞(BTC)均可用于BHV-1分離.將待檢樣品接種到上述敏感細胞后，每天觀察病變情況，該病毒的細胞致病性來得快，正常情況下接種后3～5天內產生細胞病變效應(CPE).開始呈局灶性細胞變圓、變暗，聚集成葡萄樣群落，在向四周擴散的同時，中心部細胞逐漸脫落，3～4天后細胞單層基本脫光.若7天仍不出現(xiàn)細胞病變，應再盲傳兩次，將培養(yǎng)物經過反復凍融后離心去除細胞碎片，取上清接種于新的單層細胞做進一步病毒分離.

牛傳染性鼻氣管炎病毒只有一個血清型，只要有一個已知標準毒株的免疫血清，然后在敏感細胞培養(yǎng)物上進行中和試驗，就可作出鑒定.

2.2　病毒抗原檢測方法

Terpstra等以直接熒光抗體法檢查病牛的鼻液涂片，結果全部人工感染牛均于接種后2～7天檢出了病毒抗原[22].免疫酶實驗和放射免疫測定等方法[23]也可用于病毒抗原的檢測.這些方法的主要缺點是敏感性低、耗時耗力且受不確定因素的影響.

2.3　病毒特異性抗體檢測方法

中和試驗、瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)均能檢測牛血清中牛傳染性鼻氣管炎抗體.由于BHV-1有潛伏感染的特性，因此，即使牛群血清抗體陰性，仍難以保證牛群就沒有BHV-1感染.ELISA 比中和試驗操作簡單、快速，不需要細胞培養(yǎng)設備，比中和試驗敏感，適合大量樣品檢測等優(yōu)點，適用于一般實驗室，是較常用的血清學方法.Suresh[23]報道了用免疫擴散和對流免疫擴散檢測 BHV-1 的方法.據(jù)陳天祥等(1987)報道[24]，間接血凝試驗(IHA)對本病是一種簡單、快速、準確的血清學診斷方法.

2.4　分子生物學診斷方法

聚合酶鏈式反應(PCR)方法，1993年Engelenburg等[25]用于IBR的檢測.Rocha MA 等[26～28]在1998年建立了高度敏感的巢式聚合酶鏈式反應( Nest-Polymerase chain reaction PCR) 檢測BHV-1 ,能夠檢測10-3TCID50/50 μL的細胞上清液.PCR后，接著進行脫氧核糖核酸雜交(Southern blotting)試驗是檢測BHV -1 DNA 的最敏感的方法[29].陳茹等[30]采用LUX新型熒光PCR建立了快速檢測牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)以及鑒別野毒感染和基因缺失疫苗免疫動物的二重實時熒光PCR方法.本方法全程僅需約2 h，雙基因鑒別檢測的敏感性可達1 TCID50以上，可應用于臨床快速檢測BHV-1病毒.目前，PCR已經是檢測IBR的一種特異性強、快速、準確、常規(guī)的方法且被廣泛應用.

近年來，核酸探針已被廣泛應用于病毒檢測，核酸探針檢測的陽性結果能確定是BHV-1陽性牛的判斷標準，為流行病學調查和臨床診斷提供了依據(jù).吳時友等[31]從純化的BHV-1提取全基因DNA，用32P 標記作為探針，進行點雜交.試驗結果表明，該探針可檢出10 pg的BHV-1 DNA，能明顯區(qū)別BHV-1感染細胞和未感染細胞，具有很高的靈敏度和特異性.隨后用生物素代替32P 制備探針，也取得相同結果.同位素標記的探針可以在-20 ℃保存1年以上，有利于推廣應用，又可彌補放射性同位素探針半衰期短及對人體健康有害的弊端[32].

3疫苗研究

3.1　常規(guī)疫苗

常用的常規(guī)疫苗有滅活苗和減毒或無毒活苗兩類.有些學者認為滅活苗在滅活前的病毒的滴度必須達到106.5PFU，低于此抗原濃度容易引起免疫失敗，而且不能保護強毒的攻擊.1956 年BHV- 1首次被分離后，同年就報道了第1株減毒疫苗，至今，已有十多種代表不同毒株的IBR弱毒疫苗用于牛的預防接種.弱毒苗的優(yōu)點是產生免疫效應快，接種2～3天后由于鼻分泌物中干擾素的作用即可防止感染.另外，其安全性好，不引起流產.弱毒苗的廣泛使用的確降低了本病的發(fā)病率，減少了經濟損失.但已有不少報道接種疫苗后并沒有保護牛免于IBR病毒引起的呼吸道疾病以及與BHV-1有關的結膜炎.另外，給自然帶毒牛進行疫苗接種也不能阻止其排毒，其潛伏感染可能引起接種動物的免疫抑制，導致對其他感染的易感性增加或對其他疫苗的反應性降低，且疫苗株在牛群之間傳播時能引起毒力返強，從而使免疫牛群成為該病潛在的傳染源，因此，有些國家已不再使用.傳統(tǒng)疫苗最大缺點是由于疫苗株和野毒株之間的交叉反應性，接種后無法鑒別接種牛和野毒感染牛.由此可見，長期使用常規(guī)疫苗(包括滅活苗和弱毒苗)不利于聯(lián)合接種和本病的根除[32].

3.2　亞單位疫苗

BHV- 1的糖蛋白gB、gC、gD都能誘發(fā)中和抗體，該抗體能阻礙病毒的體外感染和體內復制.尤其根據(jù)gD在病毒早期感染階段所產生的作用及作為產生中和抗體的主要靶蛋白而被認為是潛在的亞單位疫苗的候選蛋白.由于不含病毒的核酸物質而安全有效且不存在潛伏感染的危險，但因其不能在體內復制，所需接種量大，成本也高，因而至今未得到廣泛使用.

3.3　基因工程缺失苗

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BHV-1基因組中包含TK、gC、gE等病毒復制非必需基因，成為構建基因缺失疫苗的缺失對象.目前已有多個單基因、雙基因乃至三基因缺失苗問世.BHV-1 TK基因缺失苗采用各種免疫接種方式均無致病性，標記疫苗接種后能有效地保護牛，再用其鑒別診斷試劑盒檢驗能使自然感染牛和接種牛區(qū)別開來，其缺點是疫苗病毒具有潛伏性.gE基因缺失苗免疫牛可產生早期的免疫應答，在IBR爆發(fā)早期使用可有效地預防BHV-1流行，gE基因缺失疫苗十分適合BHV-1的防治和根除[33].

3.4　病毒活載體重組疫苗

隨著第一代基因缺失疫苗的開發(fā)使用，第二代基因缺失活載體疫苗正在研制和開發(fā)之中[34].此疫苗能同時啟動機體細胞免疫和體液免疫，避免了滅活苗的缺陷，又無常規(guī)活苗毒力反祖之虞，更重要的是活載體苗可同時構成多價和多聯(lián)苗.關于BHV-1的活載體疫苗國外學者早有報道，但是絕大多數(shù)還處于實驗室研究階段，國內學者李繼昌已經成功構建表達牛流行熱病毒( Bovine ephemeral fever virus ,BEFV) G 基因的牛傳染性鼻氣管炎病毒轉移載體[35,36]，為開發(fā)BEFV/BHV- 1二聯(lián)基因工程疫苗奠定了基礎[37].

4展望

隨著我國規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，盡快啟動牛的重大疾病的根除或控制計劃勢在必行.科學技術的進步，對該病的診斷方法在不斷的完善，快速、有效、敏感的診斷方法在臨床上得到了廣泛的應用.相信不久的將來，隨著多基因缺失苗和病毒活載體重組苗的成功研制，根除牛傳染性鼻氣管炎的計劃將成為現(xiàn)實.

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Progress on Detection Technology and Vaccines Preparation of Bovine Herpes Virus-1

MA Yu-mei1, FENG Ruo-fei1,2，LI Zhuo1*

(1. Animal cell Engineering&Technology Research Center of Gansu, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China; 2. Key Bio-engineering and Technology Laboratory of SEAC, Northwest University For Nationalities, Lanzhou 730030, China)

[Abstract]Infectious bovine rhinotracheitis( IBR), caused by Bovine herpes virus-1, was an acute, thermal and contagious infectious diseases. The dangers of the viruses lurked in the certain special locations, resulted in persistent infection for a long-term or even a lifelong infection in cows after the virus invaded the body of cattle. The control and eradication of the disease had many difficulties, which caused the significant economic losses in the cattle industry over world. This article reviewed the BHV-1 molecular biology, diagnosis and various vaccines. It aimed at providing the theoretical reference of further research diseases.

[Key words]Bovine herpes virus-1; Detection technology; Vaccines

[作者簡介]馬玉梅(1988—)，女，甘肅臨夏人，碩士研究生，主要從事人獸共患病預防診斷技術方面的研究.

[通訊作者]*

[基金項目]教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT13091)，西北民族大學橫向合作項目(XBMU-2014-BC-18).

[收稿日期]2015-08-02

[中圖分類號]Q342+.4；S852.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1009-2102(2015)03-0042-05