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雌二醇對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞integrin β4水解作用的影響*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1901.018.html

陳騰祥1， 嚴(yán)莉莎1, 霍建云1， 張金娟2， 潘婭1， 王晉星一1， 陳妮1， 臧貴勇3， 胡曉霞1

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 3.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究三陰乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231細(xì)胞中雌二醇對(duì)整合素(integrin)β4水解的促進(jìn)作用。方法: 常規(guī)培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞至指數(shù)增長(zhǎng)期，分別給予17β-雌二醇、雌激素受體(ER)特異性阻斷劑4-羥基他莫西芬(OHT)和G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)特異性阻斷劑G-15干預(yù)30 min，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鈣激活中性蛋白酶 2(calpain 2)的表達(dá)和integrin β4水解的情況。 結(jié)果: 17β-estradiol在短時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞130 和95kD integrin β4水解片段的產(chǎn)生，促進(jìn)作用呈濃度依賴(lài)方式，而對(duì)calpain 2表達(dá)沒(méi)有明顯影響；4-OHT不能阻斷17β-estradiol對(duì)integrin β4的水解作用，且其本身可促進(jìn)integrin β4水解；G-15能阻斷17β-estradiol對(duì)integrin β4的水解。結(jié)論: 在TNBC MDA-MB-231細(xì)胞中，17β-estradiol可通過(guò)GPR30促進(jìn)130和95kDintegrin β4水解片段的產(chǎn)生。

[關(guān)鍵詞]三陰乳腺癌； 整合素β4; 鈣激活中性蛋白酶 2； 17β-雌二醇； 4-羥基他莫西芬； G蛋白偶聯(lián)受體30

The Proteolysis of Integrin β4 in Triple Negative Breast

整合素(integrin)β4與另外1個(gè)亞家族成員integrin α5形成二聚體，是構(gòu)成半橋粒的重要組成部分，可使細(xì)胞錨定在基質(zhì)膜上[1]。integrin β4不僅有黏附功能，也參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，integrin β4可以被鈣激活中性蛋白酶2(calpain 2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)等蛋白酶水解，不同蛋白酶對(duì)其水解所產(chǎn)生的細(xì)胞行為變化不同[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性的三陰乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)MDA-MB-231細(xì)胞中，17β-雌二醇 (17β-estradiol)可以促進(jìn)integrin β4的水解，本課題對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1試劑與設(shè)備

calpain-2 large subunit (M-type) antibody、integrin β4 antibody購(gòu)于美國(guó)cell signaling technology公司，DMEM、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)invitrogen公司，4-羥基他莫西芬(4-hydroxytamoxifen，OHT)、17β-estradiol、聚丙烯酰胺以及雙甲叉丙烯酰胺購(gòu)于美國(guó)sigma-aldrich公司，G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)特異性阻斷劑G-15購(gòu)于英國(guó)Tocris Bioscience公司，其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。電泳儀及微型垂直電泳槽購(gòu)于美國(guó)GE公司， GBOX iChemiXR化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Syngene公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)于奧林巴斯公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Beckman公司。

1.2MDA-MB-231細(xì)胞的培養(yǎng)

MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，于DMEM(高糖)培養(yǎng)液、37 ℃、10%FBS和5% CO2培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

為了了解17β-estradiol是否可以促進(jìn)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞integrin β4的水解，實(shí)驗(yàn)用17β-estradiol處理MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞；為了解17β-estradiol是否是通過(guò)ER促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞integrin β4的水解，實(shí)驗(yàn)采用了ER的特異性阻斷劑4-OHT進(jìn)行干預(yù)；為了解17β-estradiol是否是通過(guò)GPR30促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞integrin β4的水解，實(shí)驗(yàn)采用GPR30特異性阻斷劑G-15進(jìn)行干預(yù)；上述實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間為30 min。Western blot檢測(cè)步驟如下：將MDA-MB-231細(xì)胞鋪于6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)期；用37℃ PBS快速洗滌后，加入預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl、 pH 7.5，1% NP40，0.5% Na Deoxycholate， 0.1% SDS，10% glycerol，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na Vanadate，1 mmol/L PMSF)，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4℃ 12 000 r/min離心30 min，上樣行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫封閉1 h，4 ℃ I抗孵育過(guò)夜，室溫II抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，GBOX iChemiXR進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。每組Western blot實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.117β-estradiol促進(jìn)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞integrin β4水解

17β-estradiol可以促進(jìn)130和95 kD integrin β4水解片段產(chǎn)生，這種促進(jìn)作用呈濃度依賴(lài)方式，在10-7 mol/L的濃度時(shí)，剪切作用最為明顯；17β-estradiol沒(méi)有使calpain 2的表達(dá)發(fā)生明顯改變。見(jiàn)圖1。

2.2ER阻斷劑4-OHT不能阻斷17β-estradiol對(duì)integrin β4的水解

OHT不能阻斷17β-estradiol對(duì)integrin β4的水解，而且OHT單獨(dú)作用30 min也可以促進(jìn)130和95 kD integrin β4水解片段產(chǎn)生。17β-estradiol和OHT同時(shí)作用時(shí)，促進(jìn)integrin β4水解的效應(yīng)沒(méi)有明顯的疊加。見(jiàn)圖2。

2.3GPR30阻斷劑G15可阻斷17β-estradiol對(duì)integrin β4的水解

G-15可阻斷17β-estradiol對(duì)integrin β4的水解，G-15單獨(dú)作用不能促進(jìn)integrin β4的水解。見(jiàn)圖3。

圖2　ER阻斷劑4-OHT對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞integrin β4水解的影響Fig.2　The role of estrogen receptor (ER) blocker in the proteolysis of integrin β4 in MDA-MB-231 breast cancer cells

圖3　G15對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞integrin β4水解的影響Fig.3　The role of GPR30 blocker in the proteolysis of integrin β4 in MDA-MB-231 breast cancer cells

3討論

ER、妊激素受體(progesterone receptor，PR)和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)等3種受體陰性的乳腺癌細(xì)胞稱(chēng)為三陰乳腺癌(TNBC)。此型乳腺癌好發(fā)于年輕女性，腫瘤的侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后效果差，5年生存率不到5%[5]。由于ER、PR和HER2為陰性，所以針對(duì)這3種受體的阻斷治療無(wú)效，臨床還缺乏相應(yīng)的治療指南，因此成為乳腺癌研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。MDA-MB-231屬于三陰乳腺癌細(xì)胞，是研究三陰乳腺癌的重要工具細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞integrin β4的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)為陽(yáng)性，而且在未受到其它因素干預(yù)的情況下，integrin β4的水解不明顯。本實(shí)驗(yàn)給予雌激素(17β-estradiol)短時(shí)間處理，integrin β4的130 和95kD的水解片段明顯增多。常見(jiàn)的integrin β4水解片段的分子量大小有200、130和95 kD。本課題組在ER和PR陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，200 kD的 integrin β4水解片段的產(chǎn)生與calpain 2的水解作用有關(guān)[6]；有研究報(bào)道，分子量大小約為95 kD的水解片段的產(chǎn)生可能與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)有關(guān)[3]。這些結(jié)果和數(shù)據(jù)提示，17β-estradiol可能通過(guò)影響MMP和其它的水解酶導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞integrin β4的水解增加，而calpain 2可能不參與其中的作用。MDA-MB-231中ER陰性，因此17β-estradiol不太可能通過(guò)ER發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)采用ER受體阻斷劑4-hydroxytamoxifen進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-hydroxytamoxifen不但不能阻斷17β-estradiol促integrin β4水解的作用，其自身單獨(dú)作用也可以促進(jìn)integrin β4的水解。研究報(bào)道，雌激素的受體除了ERα和ERβ以外，還有GPR30，GPR30與ERα和ERβ沒(méi)有同源型，主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，在MDA-MB-231細(xì)胞中，GPR30定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[7]。在ERα和ERβ陰性的組織細(xì)胞中，雌激素可通過(guò)GPR30發(fā)揮生物效應(yīng)。4-hydroxytamoxifen對(duì)于ERα和ERβ是阻斷劑，而對(duì)于GPR30則是激動(dòng)劑。這些提示，17β-estradiol和4-hydroxytamoxifen都是通過(guò)GPR30促進(jìn)integrin β4的水解。為了進(jìn)一步確認(rèn)，本實(shí)驗(yàn)采用GPR30特異性抑制劑G-15[8]進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G-15能有效地阻斷17β-estradiol對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞integrin β4的水解促進(jìn)作用，表明17β-estradiol是通過(guò)GPR30促進(jìn)integrin β4的130 kD和95kD的水解片段產(chǎn)生，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

參考文獻(xiàn)4

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(2014-12-01收稿，2014-12-25修回)

Cancer Cell is Enhanced by Estradiol via GPR30

CHEN Tengxiang1, YAN Lisha1, HE Jianyun1，ZHANG Jinjuan2, PAN Ya1,

WANG Jingxingyi1, CHEN Ni1, ZANG Guiyang3, HU Xiaoxia1

(1.DepartmentofPhysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Functional

Laboratory,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofAnatomy,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the way of estrogen to enhance the proteolysis of integrin β4 in triple negative breast cancer (TNBC) cell, MDA-MB-231. Methods: MDA-MB-231 was treated with 17β-estradiol , 4-hydroxytamoxifen(OHT) and G-15 for 30 min respectively or jointly when the cell reached to exponential growth stage. Then, Western blot was used to detect the proteolysis of integrin β4 and the expression of calpain 2. Results: As Western blot results showing, not the expression of calpain 2, but the hydrolysis products of integrin β4 with molecular weight of 130 kD and 95kD were raised by 17β-estradiol in a short time with dose-dependent way. However, an estrogen receptor (ER) specific inhibitor could enhance, instead of block, the proteolysis function of 17β-estradiol to integrin β4, which could be blocked by the specific inhibitor of G-coupled protein receptor (GPR) 30, G-15. Conclusion: In TNBC cell, MDA-MB-231, the hydrolysis products of integrin β4 with 130 and 95 kD are enhanced by 17β-estradiol via GPR30.

[Key words]triple negative breast cancer; integrein β4；calcium-activated neutral proteases 2; 17β-estradiol; 4-hydroxytamoxifen; G-coupled protein receptor 30

[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.9； R73-37

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)01-0010-03

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO. 81060176);貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院院基金(院基金合同字第2012005號(hào));貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)(TZJF-2009年38號(hào))網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13