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細胞培養(yǎng)密度對MCF7乳腺癌細胞integrin β4水解的影響*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1857.017.html

嚴(yán)莉莎1, 霍建云1， 董宇華2， 潘婭1， 王晉星一1， 陳妮1， 臧貴勇3， 胡曉霞1， 陳騰祥1**

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院 機能學(xué)實驗室， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究細胞培養(yǎng)密度對MCF7乳腺癌細胞integrin β4水解機制。方法: 常規(guī)培養(yǎng)高密度和低密度MCF7乳腺癌細胞，分別給予鈣離子螯合劑和肝素處理，用Western blot檢測不同培養(yǎng)密度MCF7細胞integrin β4的水解情況；用Fluo-3 AM作為鈣離子熒光探針，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣離子的分布。結(jié)果: Western blot檢測結(jié)果顯示，在低密度和高密度培養(yǎng)的MCF7細胞中，integrin β4的水解模式不同；在高濃度培養(yǎng)的細胞中，200 kD integrin β4片段產(chǎn)生增多；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，低密度培養(yǎng)MCF7細胞中，鈣離子的綠色熒光主要成團或顆粒狀分布，而且與紅色熒光有較多的重合，部分鈣離子分布于細胞核內(nèi)；在高密度培養(yǎng)的細胞中，鈣離子在細胞質(zhì)膜和細胞核中的定位較少；鈣離子螯合劑BAPTA-AM處理可使200 kD integrin β4明顯減少；10-6mol/L的肝素能夠減少MCF7細胞200 kD水解片段的增多，隨著肝素濃度的增高，抑制效果有所增強；相對于BAPTA-AM，10-4mol/L 肝素的抑制效應(yīng)減弱。結(jié)論: 高密度培養(yǎng)的MCF7細胞中，鈣離子從鈣庫中釋放，細胞外內(nèi)流增多，激活calpain 2, 導(dǎo)致200 kD integrin β4水解片段增多。

[關(guān)鍵詞]鈣離子； 培養(yǎng)密度； 整合素β4； 鈣激活中性蛋白酶 2； 肝素

The Proteolysis of Integrin β4 in MCF7 Breast Cancer

整合素(integrin)β4既是黏附蛋白，也是重要的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,能通過結(jié)構(gòu)或構(gòu)象的改變，參與細胞形態(tài)的重構(gòu)和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-2]。integrin β4可被鈣激活中性蛋白酶2 (calcium activated neutral protease 2,CANP2, calpain 2)水解，產(chǎn)生200 kD大小的水解片段，進而使其發(fā)生修飾改變[3]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞MCF7在不同培養(yǎng)密度條件下，其integrin β4被水解的程度不一樣，表明在高密度培養(yǎng)時，相應(yīng)的integrin β4的水解機制激活，本實驗擬對其相關(guān)機制進行研究。

1材料與方法

1.1材料和設(shè)備integrin β4 antibody購于美國cell signaling technology公司，DMEM、胎牛血清(FBS)購于美國invitrogen公司，Hoechst 33258染色液、Fluo-3 AM(鈣離子熒光探針)、1,1′-雙十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，BAPTA-AM、肝素鈉(heparin sodium)購于美國Sigma-aldrich公司，其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。電泳儀及微型垂直電泳槽購于美國GE公司，GBOX iChemiXR化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀購于美國Syngene公司，F(xiàn)V-1000激光共聚焦掃描顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購于奧林巴斯公司，高速冷凍離心機購于美國Beckman公司。

1.2細胞培養(yǎng)與分組MCF7細胞株購買于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，于DMEM(高糖)培養(yǎng)液、37 ℃、10%FBS和5% CO2培養(yǎng)。低密度(sparse)培養(yǎng)的細胞檢測時，細胞密度為70%，培養(yǎng)液為中性；高密度(dense)培養(yǎng)的細胞檢測時，細胞密度為100%，培養(yǎng)液為酸性(pH 3~4)。

1.3MCF7細胞integrin β4水解情況用Western blot檢測不同培養(yǎng)密度MCF7細胞integrin β4的水解情況，檢測鈣離子螯合劑BAPTA-AM將MCF7細胞內(nèi)的鈣離子進行螯合后integrin β4的水解情況，以及利用10-6、10-5和10-4mol/L的肝素分別處理MCF7細胞后，integrin β4的水解情況。Western blot檢測：將MCF7細胞鋪于6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)到所需的密度，用37 ℃ PBS快速洗滌，加入預(yù)冷RIPA細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1% NP40，0.5% Na Deoxycholate， 0.1% SDS，10% glycerol，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na Vanadate，1 mmol/L PMSF)冰上裂解10 min，刮取裂解物，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，平衡各組總蛋白濃度后，上樣行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫封閉1 h，4℃ I抗孵育過夜，室溫II抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，GBOX iChemiXR進行化學(xué)發(fā)光檢測。每組Western blot實驗重復(fù)3次。

1.4MCF7細胞細胞鈣離子分布用Fluo-3 AM作為鈣離子熒光探針，對MCF7細胞內(nèi)的鈣離子和細胞質(zhì)膜進行染色，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣離子的分布。將105個(低密度組)和106個(高密度組)MCF7細胞鋪于多聚賴氨酸包被的激光共聚焦專用玻底皿。當(dāng)細胞培養(yǎng)至需要的密度時，加入Hoechst 33258 染色液孵育30 min，然后加入5×10-6mol/L DiI (細胞膜紅色熒光探針)孵育5 min后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1細胞培養(yǎng)密度影響MCF7乳腺癌細胞integrin β4的水解在低密度和高密度培養(yǎng)的MCF7細胞中，integrin β4的水解模式不同。在高濃度培養(yǎng)的細胞中，200 kD分子量大小的integrin β4片段產(chǎn)生增多，而低密度培養(yǎng)的細胞中增多不明顯。見圖1。

圖1　細胞培養(yǎng)密度對MCF7乳腺癌細胞integrin β4水解的影響Fig.1　The cell density of culture involved in the proteolysis of integrin β4 in MCF7 breast cancer cells

2.2高密度與低密度培養(yǎng)的MCF7細胞中鈣離子的分布如圖2所示，藍色熒光示細胞核，綠色熒光示鈣離子，紅色熒光示細胞質(zhì)膜，Merge為三種顏色熒光的重疊圖像。在低密度培養(yǎng)的MCF7細胞中，鈣離子的顯色較為明顯，指示鈣離子的綠色熒光主要成團或顆粒狀分布，而且與紅色熒光有較多的重合，不少鈣離子分布與細胞核內(nèi)。在高密度培養(yǎng)的細胞中，鈣離子顯示不明顯，在細胞質(zhì)膜和細胞核中的定位較少。

2.3BAPTA-AM對高密度培養(yǎng) MCF7細胞integrin β4水解的影響B(tài)APTA-AM處理可使200 kD分子量大小的integrin β4明顯減少。BAPTA-AM的溶劑DMSO(與BAPTA-AM處理的細胞液的終濃度相同)處理后，200 kD大小的integrin β4與未處理細胞沒有差異。見圖3。

圖2　不同培養(yǎng)密度MCF7乳腺癌細胞內(nèi)鈣離子的分布Fig.2　The distribution of Ca2+ in MCF7 breast cancer cells with different dense of culture

圖3　BAPTA-AM對 MCF7乳腺癌細胞integrin β4水解的影響Fig.3　 The role of Ca2+-chelator BAPTA-AM in the proteolysis of integrin β4 in MCF7 breast cancer cells

圖4　肝素對 MCF7乳腺癌細胞integrin β4水解的影響Fig.4　The role of antagonist of IP3R in the proteolysis of integrin β4 in MCF7 breast cancer cells

2.4肝素對高密度培養(yǎng) MCF7細胞integrin β4水解的影響10-6mol/L的肝素能夠減少MCF7細胞200 kD水解片段的增多，而且隨著肝素濃度的增高，抑制效果有所增強。10-5mol/L 和10-4mol/L肝素對200 kD integrin β4 生成的抑制效應(yīng)沒有明顯增強。相對于BAPTA-AM，10-4mol/L肝素的抑制效應(yīng)較弱。見圖4。

3討論

本實驗中，低密度培養(yǎng)的MCF7細胞密度為70%，細胞處于指數(shù)增長期，培養(yǎng)液較為新鮮，pH值為中性；而高密度培養(yǎng)時，MCF7細胞密度達到100%，而且培養(yǎng)液在酚紅的指示下，顯示為黃色，pH值3~4。表明在高密度培養(yǎng)時，腫瘤細胞產(chǎn)酸增多，而且由于細胞競爭性的需求，培養(yǎng)液已經(jīng)陳舊，營養(yǎng)補給不足，這種培養(yǎng)情形有些類似于體內(nèi)腫瘤的生長。當(dāng)腫瘤體積還小時，血液和組織液的供給相對充足；隨著腫瘤體積不斷增大，其無序生長的結(jié)構(gòu)使得血供和組織液的滲透不夠，腫瘤組織內(nèi)部的細胞處于缺氧和缺營養(yǎng)的狀態(tài)，從而發(fā)生應(yīng)激變化[4]。

本實驗對MCF7細胞integrin β4水解情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)高密度培養(yǎng)情況下，200 kD integrin β4水解片段產(chǎn)生增多，而200 kD integrin β4水解片段的產(chǎn)生與calpain 2有關(guān)[3]。表明在高密度培養(yǎng)條件下，calpain 2的活性有所增強，導(dǎo)致200 kD integrin β4水解片段增多。毫摩爾級的鈣離子是calpain 2的激活劑[5]，提示在高密度培養(yǎng)的條件下，腫瘤細胞胞漿的鈣離子濃度是增高的。鈣離子在細胞內(nèi)的分布多數(shù)集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細胞核等鈣庫中，在細胞受到刺激時，鈣離子可以從鈣庫中釋放出來，進入胞漿，影響胞漿內(nèi)鈣離子調(diào)控的蛋白質(zhì)或酶的功能；另外，也可以導(dǎo)致細胞外的鈣離子內(nèi)流，使胞漿鈣離子濃度增高[6]。本課題組用激光共聚焦掃描對細胞內(nèi)的鈣離子濃度進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)密度的MCF7細胞中，鈣離子分布不一樣，在低密度培養(yǎng)的細胞中，指示鈣離子的探針的綠色熒光呈顆粒狀聚集，聚集的位置與指示質(zhì)膜的探針的紅色熒光有重疊，除此之外，鈣離子還大量聚集于細胞核中。相反，在高密度培養(yǎng)的細胞中，鈣離子的聚集現(xiàn)象不明顯，所以細胞內(nèi)鈣離子的顯示不夠突出，說明高密度培養(yǎng)的細胞中，鈣離子散在分布于細胞質(zhì)中；而低密度培養(yǎng)的細胞中，鈣離子大多數(shù)聚集于鈣庫，胞漿反而分布少。

本實驗進一步用鈣離子的螯合劑BAPTA-AM處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的MCF7細胞200 kD的integrin β4減少到幾乎看不出。BAPTA是鈣離子的螯合劑，BAPTA-AM是BAPTA的乙酰甲酯衍生物，通過AM法，使其容易進入細胞內(nèi)，螯合胞漿內(nèi)的鈣離子，使得游離的鈣離子減少[7]；而且，BAPTA-AM還可以進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣庫中螯合鈣離子，使得鈣離子很難釋放，胞漿內(nèi)游離的鈣離子減少，從而導(dǎo)致calpain 2酶活性降低，200 kD的integrin β4減少。1,4,5-三磷酸肌醇受體(1,4,5-triphosphate receptor,)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子流出到胞漿的通道，受1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)激活打開。肝素是IP3R的抑制劑，可有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣庫的鈣離子釋放[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)肝素可抑制MCF7細胞200 kD integrin β4水解片段的產(chǎn)生，而且呈濃度依賴方式。但是，肝素的處理濃度達到一定的量后，抑制效應(yīng)達到飽和，不再增強，說明細胞還通過胞外鈣離子內(nèi)流來激活calpain 。這些結(jié)果說明，高密度培養(yǎng)的MCF7細胞中，鈣離子從鈣庫中釋放，從細胞外內(nèi)流增多，激活了calpain 2, 導(dǎo)致integrin β4相應(yīng)水解片段增多。

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(2014-12-01收稿，2015-01-05修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Cell is Affected by Cell Density in Culture

YAN Lisha1, HE Jianyun1, DONG Yuhua2, PAN Ya1,WANG Jingxingyi1, CHEN Ni1,

ZANG Guiyong3, HU Xiaoxia1, CHEN Tengxiang1

(1.DepartmentofPhysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.FunctionalLaboratory,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofAnatomy,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the role and it's mechanism of cell density in culture on the proteolysis of integrin β4. Methods: MCF7 was cultured to reach 70% (sparse) and 100% (dense) and then treated with calcium ion chelator and heparin. Western blot was utilized to detected the proteolysis of integrin β4, and Fluo-3 AM was used as fluorescence probe for calcium ion to observe its localization inside cell. Results: As Western blot results showing, the proteolysis profile of integrin β4 was different between cells cultured as sparse and dense. In dense, 200 kD integrin β4 fragment was increased, which could be attenuated by BAPTA-AM (calcium ion chelator) and heparin. However, the inhibitor effects of heparin was dose-dependent, but reached to its platform as 10-5mol/L, which was less than BAPTA-AM even if heparin reached to10-4mol/L. Conclusions: In MCF7 cells with high density, calcium ion release from ion bank inside and inflow from outside of cells, leading to activation of calpain 2 and increase of product of integrin β4 fragment with 200 kD.

[Key words]calcium ion; density of cell culture; integrein β4；calcium-activated neutral proteases 2; heparin

[中圖分類號]R737.9； R73-37

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0006-04

通信作者**E-mail:gzctxin@qq.com網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-01-13

[基金項目]*國家自然科學(xué)基金資助項目(NO. 81060176);貴陽醫(yī)學(xué)院院基金(院基金合同字第2012005號);貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(TZJF-2009年38號)