李　云，王　煒，尹登科，高向東

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012；2.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京　210009)

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黃連多糖不同組分抗氧化活性比較研究

李云1，王煒1，尹登科1，高向東2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；2.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210009)

[摘要]目的研究黃連粗多糖和帶電量不同的黃連多糖組分的抗氧化活性。方法用二乙氨乙基纖維素(陰離子交換柱層析)分離純化除蛋白后的黃連粗多糖，用Fenton法、鄰苯三酚自氧化法和2，2-二苯基-1-苦味肼基(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)分析法測定黃連粗多糖及純化后帶電量不同的多糖組分體外抗氧化作用。結(jié)果經(jīng)陰離子交換柱層析，可獲得4種帶電量不同的黃連多糖組分，且這4種組分和黃連粗多糖對羥自由基、超氧陰離子和DPPH都有一定的清除作用，其中帶電量高的組分對不同抗氧化模型均具有較高的清除作用。結(jié)論黃連多糖有一定的抗氧化活性，其抗氧化活性和其帶電量具有正相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]黃連多糖；抗氧化活性；羥自由基；超氧陰離子；DPPH

自由基是外層軌道含有未配對電子的基團(tuán)，其化學(xué)性質(zhì)活潑，且種類多，破壞性極強[1]。

自由基誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致生物衰老和人體多種疾病的主要起因之一[2]。人體內(nèi)以氧形成的自由基最為重要，包括羥自由基、超氧陰離子和H2O2等，統(tǒng)稱為活性氧自由基。盡管機體存在氧化防御和修復(fù)機制，但并不能完全有效地阻止過量自由基造成的機體損傷，因此補充外源抗氧化劑就顯得十分必要。然而許多合成抗氧化劑存在諸多的安全問題，所以天然抗氧化劑的研究與開發(fā)引起人們的廣泛關(guān)注。

多糖是由單糖連接而成的多聚物，廣泛存在于動物細(xì)胞和植物、微生物的細(xì)胞壁中，對多糖的研究可追溯到1936年Shear對多糖抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)，至1950年代，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些真菌多糖和高等植物多糖具有明顯抑瘤活性[3]。除此之外，近年來發(fā)現(xiàn)許多植物多糖還具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖等生物活性[4]，而且對機體幾乎無毒性及不良反應(yīng)，這些作用與多糖的抗氧化活性密不可分，而抗氧化是多糖最重要的生物活性之一。因此，對多糖的研究日益受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。近年來，國內(nèi)外學(xué)者就多糖抗氧化活性作了大量的研究工作[5-6]。

黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.，三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y. Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用，最早記載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，并列于上品[7]。隨著對黃連研究越來越深入，研究表明多糖成分可能是黃連發(fā)揮藥效的成分之一。相關(guān)文獻(xiàn)報道黃連多糖(Coptischinensispolysaccharide，CCP)具有較好的降糖活性[8]和清除自由基的作用[9]，還可能是黃連治療糖尿病的有效成分之一。因此，為了更好地開發(fā)黃連，探討帶電量不同CCP的生物活性，本實驗將對CCP提取分離純化，并研究黃連粗多糖和帶電量不同的CCP抗氧化活性。

1材料

1.1藥物與試劑黃連采于四川省峨眉山，經(jīng)鑒定為毛茛科黃連屬植物味連CoptischinensisFranch.的干燥根莖。二乙氨乙基(diethylaminoethyl，DEAE)-纖維素和番紅花紅：安徽省合肥博美生物科技有限公司；抗壞血酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，2-二苯基-1-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)：上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2)：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；FeSO4：江蘇徐州試劑二廠；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器BSZ-100自動部分收集器：上海青浦滬西儀器廠；紫外可見分光光度計UV757CRT：上海精科科學(xué)有限公司；HL-2恒流泵：上海嘉鵬科技有限公司；AB135-S型電子分析天平：德國METTLER TOLEDO公司；DZF-200型真空干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

2方法

2.1CCP不同組分的制備黃連粗粉(20目)100 g，加入7 000 mL水，80 ℃提取3次，每次1.5 h，合并3次濾液，減壓濃縮至相當(dāng)于生藥0.5 g/mL，加入無水乙醇使醇沉濃度為80%沉淀多糖，4 ℃放置過夜，抽濾，用無水乙醇反復(fù)洗滌沉淀，揮至無醇味[10]。真空干燥后即得黃連粗多糖。按Sevage法[11]配制比例(提取液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1)得到混合液。振動20 min后，于6 000 r/min離心5 min，靜置分層，棄去有機層。依此法除5次蛋白。加無水乙醇沉淀得CCP。用DEAE-纖維素色譜柱[12]將再次溶解的多糖進(jìn)行分離純化，經(jīng)透析凍干后，獲得帶電量不同的4種CCP組分，分別命名為CCP-Ⅰ、CCP-Ⅱ、CCP-Ⅲ、CCP-Ⅳ。

2.2體外抗氧化活性分析

2.2.1清除羥自由基作用測定采用Fenton法[13]檢測CCP對羥自由基的清除作用。將不同的多糖組分和除蛋白后的粗多糖配制成100 μg/mL的溶液，作為供試液；并配制相同濃度的維生素C(Vitamin C，Vit C)，作為陽性對照。試管中依次加入100 μg/mL番紅花紅1 mL；0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)1 mL；100 μg/mL供試液1 mL；0.3% H2O21 mL；0.15 mol/L EDTA-Fe2+1 mL；混勻后，37 ℃水浴反應(yīng)30 min。以蒸餾水為陰性空白，并測定554 nm吸光度，計算清除率(ability of eliminating，E)。

式中Emin為以水代替供試液，Emax為以水代替供試液和EDTA-Fe2+。

2.2.2清除超氧陰離子作用測定采用改良的鄰苯三酚自氧化法[14]。將不同的多糖組分和除蛋白后的粗多糖配制成100 μg/mL的溶液，作為供試液；并配制相同濃度的VitC，作為陽性對照。試管中依次加入100 μg/mL供試液4 mL和pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl 4 mL，37 ℃水浴反應(yīng)10 min后，加入40 mmol/L鄰苯三酚-鹽酸溶液1 mL，混勻后，37 ℃水浴反應(yīng)4 min，立即用1 mL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。以蒸餾水為陰性空白，并測定318 nm吸光度，計算清除率。

式中Emin為以水代替供試液和Tris-HCl，Emax為以水代替供試液。

2.2.3清除DPPH能力測定根據(jù)Kao TH等[15]的方法檢測CCP對DPPH的清除能力。將不同的多糖組分和除蛋白后的粗多糖配制成100 μg/mL的溶液，作為供試液；并配制相同濃度的Vit C，作為陽性對照。在棕色容量瓶中加入100 μg/mL供試液3 mL，60 μg/mL DPPH醇溶液2 mL，混勻后，避光，室溫下反應(yīng)30 min。以蒸餾水為陰性空白，并測定527 nm吸光度，計算清除率。

式中Emax為以水代替供試液。

3結(jié)果

3.1CCP的分離純化采用水提醇沉法提取黃連粗多糖，按Sevage法除去粗多糖中蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。經(jīng)DEAE纖維素離子交換柱層析，依次以0.02～0.64 mol/L NaCl洗脫，分離得到帶電量不同的4個洗脫峰(見圖1)。組分峰CCP-Ⅰ、CCP-Ⅱ、CCP-Ⅲ、CCP-Ⅳ分別由0.04、0.08、0.16、0.32 mol/L NaCl溶液洗脫獲得，樣品經(jīng)透析袋透析后凍干。

3.2CCP不同組分對羥自由基的清除作用CCP-Ⅰ、CCP-Ⅱ、CCP-Ⅲ和CCP-Ⅳ對羥自由基均有一定的清除作用。同濃度下純化后的4個組分清除率相比，CCP-Ⅱ?qū)αu自由基的清除作用最強，其次是CCP-Ⅰ、CCP-Ⅳ。見表1。

3.3CCP不同組分對超氧陰離子的清除作用CCP-Ⅰ、CCP-Ⅱ、CCP-Ⅲ和CCP-Ⅳ對超氧陰離子均有較強的清除作用。同濃度下純化后的4個組分清除率相比，CCP-Ⅰ和CCP-Ⅳ對超氧陰離子的清除作用最強。見表1。

3.4CCP不同組分對DPPH的清除作用CCP-Ⅰ、CCP-Ⅱ、CCP-Ⅲ和CCP-Ⅳ對DPPH均有一定的清除作用。同濃度下純化后的4個組分清除率相比，CCP-Ⅳ對DPPH的清除作用最強。見表1。

表1　各組羥自由基、超氧陰離子、DPPH清除率比較

注:同列含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P>0.05；同列不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P<0.05。

4討論

陰離子交換層析是以陰離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中組分所含的負(fù)電基團(tuán)與交換劑上平衡離子進(jìn)行可逆交換時結(jié)合力差異而進(jìn)行分離的一種層析方法。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動相流出而被去除。含有少量負(fù)電基團(tuán)因與離子交換劑的結(jié)合力小，先被置換出來，而帶負(fù)電量多的基團(tuán)因與離子交換劑結(jié)合力強，需要較高的離子強度才能被置換出來，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。本實驗根據(jù)這個原理，分離得到帶電量不同的4種CCP組分。

羥自由基是新陳代謝過程中產(chǎn)生的，對生物體毒性強、危害大的一種自由基，能與活細(xì)胞生物膜發(fā)生反應(yīng)，引起氧化性損傷和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變，衰老、腫瘤等疾病均與羥自由基密切相關(guān)。所以，篩選清除羥自由基的天然抗氧化劑具有重要的實際意義[16]。羥自由基可由EDTA-Fe-H2O2產(chǎn)生，且羥自由基可特異性地使番紅花紅T褪色，褪色程度可以衡量羥自由基生成量，據(jù)此原理可評價CCP不同組分對羥自由基的清除作用。實驗結(jié)果表明黃連粗多糖和純化后4組帶電量不同的CCP對羥自由基均有一定的抑制作用，其中CCP-Ⅱ清除率較強。

超氧陰離子自由基活性強，不僅可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，而且還是很多活性游離基的前體。在體外它可通過鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化產(chǎn)生、釋放出超氧陰離子，并生成有色中間產(chǎn)物，生成的中間產(chǎn)物在紫外區(qū)有吸收[17]。而CCP可以和超氧陰離子結(jié)合形成穩(wěn)態(tài)自由基，終止自由基鏈反應(yīng)，抑制超氧陰離子的形成，通過檢測有色中間物的生成量，判定多糖的清除能力，而發(fā)揮抗氧化作用[18]。本研究結(jié)果表明黃連粗多糖和純化后4組帶電量不同的CCP對超氧陰離子均有較強的抑制作用。CCP-Ⅰ和CCP-Ⅳ對超氧陰離子自由基的清除作用最強。

DPPH分析方法是目前廣泛使用的評價和篩選抗氧化劑的常用方法。DPPH是一種帶有不配對電子的比較穩(wěn)定的自由基，其N原子上有一個游離電子。由于DPPH的40%乙醇-水溶液在527 nm處有最大吸收峰。加入抗氧化劑后，DPPH捕捉一個電子與游離電子配對，使反應(yīng)體系在527 nm處的吸收減弱[19]。本研究評價了相同質(zhì)量濃度CCP對DPPH的清除作用。結(jié)果表明黃連粗多糖和純化后4組帶電量不同的CCP對DPPH均有一定的清除作用，CCP-Ⅳ對DPPH的清除作用最強。

本實驗采用水提醇沉法提取黃連粗多糖，經(jīng)陰離子層析柱分離得到帶電量不同的4種水溶性多糖組分。通過體外分析法證實黃連粗多糖及純化后多糖組分對羥自由基、超氧陰離子和DPPH均有一定的清除作用。綜合考慮各因素，CCP的抗氧化活性隨著帶電量增多而增強。本實驗結(jié)果為CCP在抗氧化和抗衰老功能性食品中的應(yīng)用開發(fā)提供了參考。

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Antioxidant Activities of DifferentCoptischinensisPolysaccharides: A Comparative Study

LIYun1,WANGWei1,YINDeng-ke1,GAOXiang-dong2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,JiangsuNanjing210009,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the antioxidant activities of crude Coptis chinensis polysaccharides and Coptis chinensis polysaccharides with different charges. MethodsAfter removal of proteins by Sevage method, the crude polysaccharides were further purified by diethylaminoethyl cellulose column chromatography. The antioxidant activities of crude Coptis chinensis polysaccharides and purified Coptis chinensis polysaccharides with different charges were measured by Fenton method, pyrogallol autoxidation method, and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) method. ResultsFour polysaccharides with different charges were obtained after the crude Coptis chinensis polysaccharides were isolated and purified by anion-exchange column chromatography. All components could eliminate some hydroxyl free radicals, superoxide anions, and DPPH. The component with a higher charge had a relatively high antioxidant activity in all test methods. ConclusionCoptis chinensis polysaccharides show certain antioxidant activities, which are positively correlated with their charges.

[Key words]Coptis chinensis polysaccharide; antioxidant activity; hydroxyl free radical; superoxide anion; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

收稿日期：(2014-07-28；編輯：曹健)

通信作者：尹登科，yindengke@sina.com

作者簡介：李云(1987-)，女，碩士研究生

基金項目：天然藥物活性組分與功效國家重點實驗室(中國藥科大學(xué))項目(SKLNMKF201218)；安徽省高校優(yōu)秀人才基金項目(2011SQRL091)

[中圖分類號]R932[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.01.021