范文來,徐 巖,溫永柱

(教育部工業(yè)生物技術重點實驗室,江南大學生物工程學院釀酒微生物與應用酶學研究室,江蘇無錫 214122)

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白酒發(fā)酵與蒸餾過程中5種生物胺變化

范文來,徐 巖*,溫永柱

(教育部工業(yè)生物技術重點實驗室,江南大學生物工程學院釀酒微生物與應用酶學研究室,江蘇無錫 214122)

應用液液微萃取(LLME)結合高效液相色譜(HPLC)檢測,建立了白酒固態(tài)發(fā)酵酒醅中多種生物胺的定量分析方法。以某兼香型酒K廠酒醅為試樣,對酒醅發(fā)酵及蒸餾過程中生物胺的變化進行研究,定量方法包括震蕩提取、離心、液液微萃取、丹磺酰氯柱前衍生、RP-HPLC檢測。結果表明,腐胺和尸胺隨著酒醅發(fā)酵時間延長,含量增加,且只有很少量的被蒸餾進入酒中。吡咯烷是白酒的主要生物胺,在蒸餾過程中大部分被蒸餾出來。與其它飲料酒相比,白酒中的生物胺含量是最低的。

白酒,生物胺,發(fā)酵,蒸餾,衍生化

生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物的總稱[1],可以看作是氨分子中1～3個氫原子被烷基或芳基取代后而生成的物質,是脂肪族、酯環(huán)族或雜環(huán)族的低分子量有機堿,廣泛存在于發(fā)酵食品和飲料酒中[2-4]。

首次研究飲料酒中生物胺是1965年,當時應用色譜對葡萄酒中的慢性有毒物質進行研究,檢測到組胺。目前為止,葡萄酒、啤酒、黃酒中生物胺的研究較多[5-7],檢測到的生物胺種類達到幾十種之多,常見的是單胺類的組胺(histamine,來源于組氨酸)、酪胺(tyramine,來源于酪氨酸)、苯乙胺(2-phenylethylamine,來源于苯丙氨酸)和色胺(tryptamine,來源于色氨酸),二胺類的腐胺(putrescine,來源于鳥氨酸)和尸胺(cadaverine,來源于賴氨酸),聚多胺類的精胺(spermidine)和亞精胺(spermine,這兩個胺來源于腐胺)等[8]。最新的研究結果表明,我國啤酒中生物胺總量4.79mg/L,葡萄酒11.24mg/L,黃酒最高可達78.30mg/L[9]。

白酒中生物胺的研究較少。早期,杜木英等人利用氨基酸自動分析液相色譜法對青稞酒發(fā)酵過程中的生物胺的動態(tài)變化進行過研究[10],但定性的生物胺較少。2013年,范文來等人對白酒中可能含有的生物胺進行了系統(tǒng)的鑒定,共鑒定出9種生物胺,包括甲胺、乙胺、異戊胺、吡咯烷、環(huán)己胺、環(huán)戊胺、環(huán)庚胺、腐胺和尸胺[11]。同年,開發(fā)了白酒中生物胺檢測方法—丹磺酰氯衍生化結合紫外-反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,并對不同香型白酒中的生物胺進行了定量,發(fā)現吡咯烷在白酒中含量最高。濃香型和清香型白酒總生物胺含量較高,而醬香型白酒較低[12]。本文在前期研究的基礎上,進一步開發(fā)固態(tài)基質(酒醅)中生物胺的定量方法,并對酒醅發(fā)酵和蒸餾過程中生物胺的變化進行研究,初步探索白酒中生物胺產生的原因,為后續(xù)研究白酒生物胺產生機理、開發(fā)生物胺的降低措施提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

K酒廠酒醅,由某兼香型白酒廠提供,當天取樣后-15℃冷凍,24h內運至實驗室,并-15℃冷凍待用。使用時,室溫解凍。

乙胺鹽酸鹽、甲胺鹽酸鹽、吡咯烷、腐胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽 購自sigma公司的純凈標準品;丹磺酰氯(Dansyl chloride) 購自美國sigma-Aldrich公司;乙腈(色譜純) 購于上海安普儀器有限公司;三氯乙酸、丁醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、飽和碳酸氫鈉 均為分析純;實驗室專用水:超純水(Milli-Q系統(tǒng))使用前煮沸5min。

冷凍離心機 Bekman公司;高效液相色譜[DIONEX SUMMIT]戴安中國有限公司;DC-12型氮吹儀 上海安普科學儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;渦旋儀 上海琪特分析儀器有限公司;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 酒醅中生物胺定量方法

1.2.1 生物胺提取 參照國家標準的方法[13],取粉碎的酒醅10g加入100mL錐形瓶,三氯乙酸(5%)震蕩提取1h,3600r/min離心10min,上清液轉入小燒杯,重復提取兩次,漏斗過濾,定容到50mL。

1.2.2 分離與衍生 參考Dugo等的方法[14]并進行了優(yōu)化,5mL提取液,加入1.5g NaCl飽和,加入3mL正丁醇、氯仿(1∶1),用pH為13的Na2CO3和NaOH緩沖溶液調pH至11.5,渦旋儀旋轉震蕩4min,收集有機相,重復萃取兩次。加入1mL 1mol/L HCl混勻,氮氣吹干,加入2mL 0.1mol/L HCl溶解,加入2mL丹磺酰氯衍生劑(9mg/mL,溶劑為丙酮),調pH為8.6,震蕩混勻后,40℃水浴避光衍生1h。反應結束后,加入3mL乙酸乙酯,重復萃取三次,合并萃取液,氮氣吹干,加入1mL乙腈溶解,0.45μm有機濾膜過濾,進樣。

1.2.3 液相色譜條件 參考Dugo等的方法并進行優(yōu)化[14],Agilent C18色譜柱(4.6×250mm,5μm),檢測波長為254nm,柱溫為20℃,進樣量10μL,利用外標法峰面積定量。梯度洗脫,流速為0.4mL/min,流動相A為乙腈,B為超純水。洗脫程序:0～6min,A為30%;6～12min,A為30%～80%;12～25min,A為80%～85%;25～32min,A為85%～30%。

1.3 白酒中生物胺測定

參照溫永柱等人的方法測定[12]。

2 結果與討論

2.1 固態(tài)基質酒醅中生物胺定量方法

固態(tài)基質酒醅中生物胺的提取采用國標的方法[13],其測定方法依參考文獻的方法[12]優(yōu)化。在酒醅中添加相似濃度的混合標準品,測定固態(tài)基質中生物胺定量方法的相對標準偏差(RSD),并計算回收率。由表1可知,定量方法的精確度和準確度較好,回收率在77%～105%之間,其中甲胺的回收率偏低,推測是甲胺易揮發(fā),在提取、萃取過程中損失比較大。

表1 固態(tài)基質中定量方法的回收率和RSD(n=3)Table1 RSD and recovery ofbiological amines detected in solid matrix(n=3)

2.2 酒醅發(fā)酵過程中5種生物胺變化

根據建立的固態(tài)白酒酒醅中生物胺的定量方法對不同發(fā)酵時間的酒醅進行定量檢測。選取5個時間點,即發(fā)酵0、10、20、30和60d酒醅,圖1是5種生物胺在酒醅發(fā)酵過程中的變化趨勢。

圖1 K酒廠酒醅中5種生物胺含量各自隨著時間的變化Fig.1 Changes of biogenic amines of fermented grain from K distillery in the fermentation

酒醅發(fā)酵過程中生物胺總量先隨發(fā)酵時間上升,到達20d時生物胺總含量最高,達16mg/kg;20d后,腐胺含量先下降,再升高,尸胺含量繼續(xù)增加,但由于甲胺、乙胺、吡咯烷含量開始下降,致使生物胺總量也開始下降;到達60d時總含量達11.78mg/kg。

從單個生物胺變化看,酒醅發(fā)酵過程中,甲胺、乙胺、吡咯烷一般先上升后下降(圖1),在20d時含量達到最高,吡咯烷含量居首,最高含量達到5mg/kg。腐胺是前10d含量變化不大,10～20d含量迅速增加,在20d時達到最大值,高出最初含量的一倍;20～30d會下降,但是依然高出初始值;30～60d,腐胺含量平緩上升。推測酒醅中微生物陸續(xù)死亡,腐胺積累。腐胺的這一變化與早先文獻報道腐胺隨著發(fā)酵進行呈下降趨勢不一樣[10]。尸胺初始值為0,從第10～60d,含量一直處于上升狀態(tài)。在發(fā)酵至60d時,尸胺含量是5種生物胺中最高的,達到3.44mg/kg。

表2 不同餾分酒中生物胺的含量(μg/L)Table2 The concentration of biogenic amines of head,heart,and tail cut(μg/L)

注:*:q.l.,小于檢測限。

2.3 酒醅配料、蒸餾前后生物胺的變化

兼香型K廠酒醅在配料前至蒸餾后的整個過程中,5種生物胺的變化趨勢基本一致(圖2)。配料時,由于加入新料,原來酒醅中的生物胺得到稀釋,從而使生物胺含量都得到了大幅度的降低。配料前,酒醅生物胺總量是10.46mg/kg,配料后下降到6.93mg/kg,下降了33.74%。其中尸胺的含量降低最大,但乙胺含量幾乎未變。

蒸餾后,酒醅中總生物胺含量下降至5.01mg/kg,蒸餾過程下降了27.71%。單個生物胺下降趨勢差異較大,其中吡咯烷和乙胺含量降低最大,而尸胺、腐胺含量降低幅度較小,甲胺下降趨勢居中。推測由于腐胺和尸胺沸點較高(分別為158℃和178℃),高于白酒蒸餾時的溫度,大部分殘留在酒醅中。

圖2 K酒酒醅蒸餾前后5種生物胺含量的變化Fig.2 The concentration of biogenic amines before and after distillation of fermented grains from K distillery

2.4 白酒蒸餾過程中5種生物胺含量變化規(guī)律

酒頭、中段酒、尾酒中,甲胺和乙胺含量都是在中段酒時含量最大(表2),結合蒸餾過程酒醅中甲胺和乙胺含量的變化,說明酒醅中大部分的甲胺和乙胺都隨著蒸餾過程到達餾分中,并且主要在前中期蒸餾出來。蒸餾過程中,吡咯烷從酒醅進入餾分的量最大,中段酒中吡咯烷的含量達到750μg/L。在整個蒸餾過程中,尤其是中段酒和尾酒中,吡咯烷的含量一直保持一個很高的含量。對腐胺而言,在尾酒中含量達到最高,可能是因為腐胺沸點較高(158℃)。尸胺在各餾分中均低于檢測限。從白酒中段酒與酒頭的生物胺含量可知,白酒中生物胺的含量要低于瑞士、德國、法國葡萄酒限量標準(分別為10、2、8mg/L)[15-16]。

3 結論

建立了白酒固態(tài)基質中多種生物胺的HPLC定量方法,并對酒醅發(fā)酵過程中5種生物胺甲胺、乙胺、吡咯烷、腐胺、尸胺的變化進行了研究。酒醅發(fā)酵過程中生物胺總量前20d隨發(fā)酵時間上升,然后逐漸下降,至發(fā)酵60d(出窖時)達11.78mg/kg。除尸胺是隨著發(fā)酵時間一直上升外,其它4個生物胺在發(fā)酵前20d上升,然后緩慢下降。

酒醅配料降低生物胺效果好于酒醅蒸餾,二者共同作用,生物胺總量下降61.45%。

蒸餾過程中,低沸點的生物胺進入酒中,且以酒頭中為主;高沸點的生物胺如腐胺和尸胺大部分存在于中段酒和尾酒中。這一研究結果將對在酒醅發(fā)酵和蒸餾過程中進行生物胺的控制起到指導作用。

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Quantification for 5 selected biogenic amines in fermentation and distillation of Chinese liquor by HPLC

FAN Wen-lai,XU Yan*,WEN Yong-zhu

(Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A liquid-liquid microextraction(LLME)and reverse-phase high performance liquid chromatogramphy(HPLC)method was developed for the quantification for 5 selected biogenic amines in fermented grain and Chinese raw liquor. Quantification method generally includes:oscillation extraction,centrifugation,liquid-liquid microextraction,precolumn derivatization with Dansyl chloride,and RP-HPLC detection. The results showed that the content of putrescine and cadaverine was increased with fermentation time prolong of fermented grains,but few of them could be distilled into raw liquor. Pyrrolidine was the major biogenic amines in Chinese liquors and most could be distilled into raw liquor. Methylamine and ethylamine were detemined in fermented grains,but low concentration of them could exist in raw liquor because of their high volatility. Compared with other alcoholic beverages,Chinese liquor has the lowest content of biogenic amines.

Chinese liquor;biogenic amines;fermentation process;distillation process;derivativation

2014-06-27

范文來(1966-),男,碩士,研究員,研究方向：釀酒工程與食品安全。

*通訊作者:徐巖(1962-)，男，博士，教授，研究方向：微生物釀酒科學與酶技術。

國家863計劃項目(2013AA102108)；“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAK17B11)。

TS201.6

A

:1002-0306(2015)09-0144-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.023