楊京，謝楊麗，陳林

遺傳病的發(fā)病率雖然較腫瘤等常見疾病低，但常導(dǎo)致患者死亡或發(fā)生畸、殘，影響正常生活和工作，給患者及家庭、社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)、心理、醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

絕大多數(shù)遺傳病的臨床治療以對(duì)癥處理為主，如針對(duì)骨骼畸形的手術(shù)矯形、針對(duì)凝血因子缺乏的補(bǔ)充治療等，往往只能暫時(shí)緩解機(jī)體的部分異常功能。大部分表型不能被糾正，甚至可能會(huì)危及患者生命。隨著生命醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，更多的遺傳病的致病基因被克隆、鑒定，相關(guān)分子致病機(jī)制得到更深入闡明，在此基礎(chǔ)上RNAi、基因組編輯技術(shù)、融合蛋白、多肽等直接靶向致病基因或其相關(guān)信號(hào)通路、分子的生物學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于遺傳病的治療并取得了一定的療效。雖然這些研究大多局限于細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但已有少數(shù)生物學(xué)治療措施已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，這讓我們看到了成功治愈遺傳病的曙光。

1 遺傳病概述

遺傳病是指由于遺傳物質(zhì)發(fā)生改變所導(dǎo)致的一類疾病，主要有以下幾類。

染色體病：由于整條或部分染色體增加、移位或缺失所致。多表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、智力低下及各種身體異常。大多數(shù)染色體疾病發(fā)生在出生前，幾乎占自然流產(chǎn)的50%。

多基因?。河啥鄠€(gè)基因交互作用所致，可能某一些基因也起主要作用，但多為微效作用。環(huán)境因素也是多基因病的重要影響因素。如糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、唇裂、一些先天性心臟病等。

單基因?。河蓡蝹€(gè)基因突變所致。以常染色體及伴性的X、Y連鎖方式遺傳，有顯性、隱性遺傳之分。多于胚胎發(fā)育期、新生兒和幼兒階段即發(fā)病。這也是本文介紹的主要類型。

線粒體基因?。翰煌谏鲜龊嘶蚪M，是由于線粒體基因組發(fā)生突變所導(dǎo)致的一類疾病，呈母系遺傳。多為神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)病變，如 Leber遺傳性視神經(jīng)病、線粒體心肌病等。

2 遺傳病的診斷

準(zhǔn)確診斷遺傳病是開展遺傳咨詢和防治工作的基礎(chǔ)，主要分為臨床診斷和分子診斷。前者同普通疾病類似，主要通過分析病史、癥狀、體征和輔助檢查結(jié)果確立診斷，也是目前臨床中主要應(yīng)用的方法。此外，通過分析先證者家庭成員發(fā)病情況的系譜分析法有助于明確遺傳病的遺傳方式，如是常染色體遺傳病或性染色體遺傳??；也可區(qū)分表型相似的，或由于遺傳性而表現(xiàn)為不同遺傳方式的遺傳病。

染色體檢查 (核型分析) 和性染色質(zhì)檢查是確診染色體病的主要方法。分子診斷則是從遺傳分子水平確診單基因遺傳病。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，對(duì)人類基因組的認(rèn)識(shí)不斷加深，以及基因檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，目前可利用特異性寡核苷酸探針雜交、PCR相關(guān)技術(shù)、DNA測(cè)序等基因分型技術(shù)檢測(cè)DNA結(jié)構(gòu)變化，實(shí)時(shí)定量PCR法、基因芯片、蛋白芯片檢測(cè)基因表達(dá)變化。對(duì)于已知致病基因者且明確該基因的序列和結(jié)構(gòu)可直接檢測(cè)突變。對(duì)于未知致病基因或未知突變情況者可通過對(duì)先證者及其家系進(jìn)行連鎖分析。

3 遺傳病常規(guī)治療

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷 (Preimplantation genetic diagnosis, PGD)、產(chǎn)前診斷等可預(yù)防遺傳病胎兒出生，也可因此讓患兒在出生前得到手術(shù)、藥物等治療來緩解表型。目前對(duì)于出生后的遺傳病患者臨床治療措施有限，主要是預(yù)防或處理已經(jīng)出現(xiàn)的異常表型以及對(duì)癥治療。

3.1 手術(shù)治療

對(duì)于局限于某一器官的病灶可以手術(shù)切除。如家族性結(jié)腸腺瘤樣息肉 (Familial adenomatous polyposis, FAP) 結(jié)合家族史，早期行全結(jié)腸切除術(shù)可提高患者預(yù)后。脾切除可緩解球形紅細(xì)胞增多癥的溶血性貧血。

手術(shù)矯形可修復(fù)/改善病變器官畸形、恢復(fù)器官功能、提高患者的生活質(zhì)量。如肢體延長(zhǎng)術(shù)用于矯正軟骨發(fā)育不全 (Achondroplasia，Ach) 患者的侏儒表型；顱縫松解術(shù)可增加囟門早閉患者腦腔容積，在一定程度上改善大腦發(fā)育及顱面畸形。

器官移植術(shù)加以抗免疫排斥反應(yīng)治療對(duì)于少數(shù)遺傳病有較好的臨床療效，如腎移植治療家族性多囊腎、角膜移植治療遺傳性角膜萎縮癥等。

3.2 藥物治療

3.2.1 去除多余物質(zhì)

利用藥物可通過排泄堆積的代謝產(chǎn)物或抑制其生成治療酶促反應(yīng)異常的遺傳病。如青酶胺螯合銅離子可防止 Wilson病患者銅代謝障礙、銅離子沉積所致的肝硬化、腎功能損害等多種癥狀。

3.2.2 替代、補(bǔ)充療法

對(duì)一些遺傳病，主要是酶相關(guān)遺傳病，給予缺乏物質(zhì)可以顯著緩解表型或防止表型發(fā)生。如低磷酸酯酶癥 (Hypophosphatasia)，其多為功能缺失型組織非特異性堿性磷酸酶 (Tissuenonspecific isozyme of alkaline phosphatase,TNAP) 基因突變，血清ALP活性降低，患者骨礦化受損，出現(xiàn)骨軟化或佝僂病。骨靶向性的人重組組織非特異性ALP酶ENB-0040替代治療可明顯緩解患者的上述異常骨表型，并改善胸廓變形所致的呼吸功能障礙[1]。需要注意的是替代、補(bǔ)充治療通常需要終生服藥。

3.2.3 對(duì)癥治療

針對(duì)遺傳病出現(xiàn)的表型或并發(fā)癥進(jìn)行藥物治療，通常療效有限。但也有一些對(duì)癥治療可以在一定程度上緩解部分遺傳病表型。成骨不全(Osteogenesis imperfecta, OI) 是一組臨床脆性骨折和牙本質(zhì)發(fā)育不全的結(jié)締組織病，是兒童脆性骨折發(fā)生的主要病因。90%存在 COL1A1、COL1A2基因突變所致的Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)及功能異常。傳統(tǒng)臨床干預(yù)手段主要是手術(shù)處理骨折，但其療效不佳。近年來，有部分臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用雙膦酸鹽 (如帕米膦酸、奈利膦酸等) 糾正其高骨轉(zhuǎn)換 (Bone turnover) 可增加患兒骨密度并降低骨折風(fēng)險(xiǎn)[2]。

3.3 飲食療法

限制特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入或吸收以減少代謝產(chǎn)物生成可治療部分代謝性遺傳病。如低苯丙氨酸飲食可防止苯丙酮尿癥患兒出現(xiàn)智力低下等癥狀。

4 遺傳病的生物學(xué)治療

4.1 針對(duì)致病基因

糾正突變的致病基因是治療遺傳病的根本。目前已有多種靶向致病基因或其相關(guān)信號(hào)通路、分子的生物學(xué)措施可應(yīng)用于遺傳病的治療。

4.1.1 靶向致病基因DNA

基因組定向編輯技術(shù)是近年來的研究熱點(diǎn)，目前已可在幾乎所有物種中實(shí)現(xiàn)精確到核苷酸水平的定向修飾。通過引入正常的等位基因來糾正突變的基因缺失、敲低突變等位基因mRNA，基因組編輯為完全治愈遺傳病帶來了更大的可能性。

鋅指核酸酶 (Zinc-finger nucleases, ZFNs)是最早研發(fā)出來的基因組定向編輯方法。其原理是利用鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ融合，不同的鋅指DNA結(jié)合域集成DNA剪切區(qū)可定向特定DNA鋅指結(jié)構(gòu)域并激活內(nèi)源性DNA修復(fù)。2005年 Urnov等首次在體外人體細(xì)胞中利用ZFNs糾正了 X連鎖重度聯(lián)合免疫缺陷病(X-linked severe combined immune deficiency,SCID) 突變的IL2Rγ基因[3]。隨后ZFNs也成功應(yīng)用于動(dòng)物模型，如有效糾正血友病 B模型小鼠凝血時(shí)間延長(zhǎng)[4]。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases,TALENs) 同樣利用核酸內(nèi)切酶 FokⅠ剪切DNA，靶向DNA的 (Repeat variable diresidue,RVD) 重復(fù)序列[5]。CRISPR/Cas9 利用 Cas9靶向 CRISPR RNA (crRNA) 或?qū)?RNA (guide RNA, gRNA)[6]。與 ZFNs相比較，TALENs和CRISPR的靶向位點(diǎn)選擇范圍更廣，效率更高。但TALENTs有一定的細(xì)胞毒性，且構(gòu)建復(fù)雜[7]。

上述3種基因組編輯技術(shù)均可激活細(xì)胞的兩種 DNA 修復(fù)方式：非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ) 和同源重組 (Homology-directed recombination, HDR)，通過4種方式糾正DNA突變：破壞 (Disruption) 內(nèi)源性序列、移碼 (Frameshift) 恢復(fù)DNA讀碼框、敲入 (Knock-in) 外源性序列和置換(Substitution) 突變序列[7]。目前上述基因組編輯技術(shù)絕大多數(shù)只是在人體細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有效[8-9]，如何應(yīng)用于臨床還存在較多實(shí)際問題，如可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng) (Off-target) 誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生等。

4.1.2 靶向致病基因RNA

對(duì)于功能增強(qiáng)型突變所致遺傳病還可利用RNAi技術(shù)干預(yù)致病基因的RNA轉(zhuǎn)錄、降解。RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。成纖維生長(zhǎng)因子 2 (Fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2) 功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變是Apert綜合征的主要病因。Shukla等發(fā)現(xiàn)利用 RNAi降低FGFR2表達(dá)水平可完全防止Apert小鼠出現(xiàn)囟門早閉表型[10]。

根據(jù)Clinical Trial數(shù)據(jù)庫(kù)，目前有23項(xiàng)注冊(cè)臨床研究使用RNAi方法治療腫瘤、HIV、肝炎等疾病，尚無應(yīng)用于遺傳病治療的臨床試驗(yàn)。限制RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床治療的因素主要包括穩(wěn)定性、off-target效應(yīng)、免疫刺激以及導(dǎo)入機(jī)體方法。以往多使用膽固醇或脂質(zhì)體使 SiRNA非選擇性導(dǎo)入體內(nèi)，僅對(duì)于靶器官是肝臟或空腸者有較好的效果，且需要的藥物劑量較大，存在明顯脫靶效應(yīng)[11]。隨著RNAi導(dǎo)入技術(shù)的改良，首項(xiàng) RNAiⅠ期臨床試驗(yàn)采用納米粒釋放系統(tǒng)(Nanoparticle-delivery system) 遞送RNAi來治療實(shí)體瘤。近來脂質(zhì)納米體 (Lipid Nanoparticles,LNPs) 實(shí)現(xiàn)了RNAi的多種細(xì)胞靶向性。以上技術(shù)的發(fā)展為RNAi應(yīng)用于遺傳病臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

4.1.3 靶向致病基因編碼蛋白

這些問題的出現(xiàn)恰恰表明，員工缺乏內(nèi)部控制觀念，缺乏對(duì)理念的理解，只停留在內(nèi)部監(jiān)督的層面，而不能深入理解內(nèi)部控制的本質(zhì)和內(nèi)容[1]，導(dǎo)致執(zhí)行力和約束力低。

對(duì)于功能增強(qiáng)型突變所致遺傳病，尤其是受體蛋白突變疾病，可利用可溶性蛋白、模擬多肽等阻斷突變蛋白發(fā)揮效應(yīng)。以 FGFRs功能增強(qiáng)突變所致骨骼遺傳疾病為例，可通過阻斷跨膜受體 (FGFRs) 與配體 (FGFs) 結(jié)合來抑制致病蛋白發(fā)揮作用。Ach和致死性侏儒 (Thanatophoric dysplasia, TD) 均主要由FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變所致[12]。我們利用酵母雜交篩選到結(jié)合FGFR3胞外域的12多肽 (P3)，可緩解致死性侏儒小鼠(TD II) 的異常表型[13]。FGFR3可溶性受體、FGFR2融合蛋白可分別緩解Ach[14]和Apert小鼠表型[15]。

4.1.4 靶向相關(guān)信號(hào)通路/分子

根據(jù)遺傳病的發(fā)病機(jī)制，利用阻斷劑直接阻斷功能增強(qiáng)型遺傳病中調(diào)高的信號(hào)通路有一定療效。MAPK磷酸化增加是FGFR2點(diǎn)突變導(dǎo)致Apert發(fā)生的主要機(jī)制，Shukla等發(fā)現(xiàn)注射U0126阻斷MEK磷酸化[10]可部分緩解Apert小鼠顱縫早閉表型。除了直接阻斷相關(guān)信號(hào)通路，利用其他分子來間接調(diào)節(jié)疾病發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路是另外一個(gè)策略。Lorget等在軟骨細(xì)胞中過表達(dá)C型利鈉肽 (CNP) 及給予CNP注射可緩解Ach小鼠表型，其機(jī)制是CNP通過抑制MAPK通路促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)生成。由于 CNP半衰期過短，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了其多肽類似物BMN111以治療Ach，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[16]。

另外，還可通過調(diào)節(jié)疾病發(fā)生中非致病基因直接調(diào)控的信號(hào)通路治療遺傳病。如Grafe在OI基因工程小鼠模型中發(fā)現(xiàn) TGF-β信號(hào)通路過度激活是其發(fā)病的重要原因，利用TGF-β的中和抗體1D11可部分糾正OI小鼠的異常骨骼表型并改善其肺臟病理形態(tài)。該抗體將于 2015年開始進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)[17]。

4.2 針對(duì)表型

盡管靶向致病基因的研究給臨床治愈遺傳病帶來了曙光，但也必須認(rèn)識(shí)到基因型并不能始終如一地預(yù)測(cè)表型[18]。因此，對(duì)于這部分遺傳病最直接的治療策略就是針對(duì)患者及其表型進(jìn)行干預(yù)。如COLI基因突變是 OI患者頻發(fā)骨折的根本原因，但目前尚缺乏直接靶向COLI基因的治療手段，因此可直接通過改善骨質(zhì)量以預(yù)防骨折。以往發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 (LDL receptor-related protein 5, LRP5) 介導(dǎo)經(jīng)典 Wnt通路促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化并增加骨密度[19]。Jacobsen等在OI轉(zhuǎn)基因模型小鼠中過表達(dá)LRP5可不依賴于影響COLI mRNA表達(dá)或蛋白分泌來增加小鼠骨量和骨強(qiáng)度[20]。此外，給予OI小鼠LRP5的抑制分子——clerostin的單克隆抗體可增加小鼠骨密度及骨力學(xué)強(qiáng)度，達(dá)到治療目的[20]。

4.3 其他

除了上述基因相關(guān)的生物學(xué)治療措施外，干細(xì)胞一直是各種疾病治療措施研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，也已經(jīng)在遺傳病治療方面開始啟動(dòng)研究。尤其是多能干細(xì)胞 (iPS)，從成體分離的具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，可解決異體移植干細(xì)胞的倫理和安全性問題。已有研究利用TALENs在iPS中修飾凝血因子Ⅷ基因 (Blood coagulation factor , F8Ⅷ)制備了模擬血友病 A的細(xì)胞系，同時(shí)再利用TALENs成功地在該細(xì)胞系中恢復(fù) F8正常表達(dá)[21]。Sasai團(tuán)隊(duì)利用三維培養(yǎng)系統(tǒng)成功地將人ES細(xì)胞誘導(dǎo)成大腦皮層組織和包含視網(wǎng)膜和感光細(xì)胞的胚胎眼睛[22]。以上研究都為干細(xì)胞應(yīng)用于遺傳病的治療提供了可行性。

5 展望

5.1 致病機(jī)制的研究是治療遺傳病的基礎(chǔ)

5.2 生物治療的時(shí)空靶向性和安全性是保證臨床應(yīng)用的關(guān)鍵

時(shí)間靶向性：治療療程需要根據(jù)表型出現(xiàn)的時(shí)間進(jìn)行確定。對(duì)機(jī)體生理功能存在持續(xù)影響的疾病應(yīng)長(zhǎng)期干預(yù)，如低磷酸酯酶癥患者需終生補(bǔ)充缺乏的堿性磷酸酶，長(zhǎng)期用藥的安全性尤其重要。胎兒期或兒童期發(fā)病者應(yīng)在個(gè)體發(fā)育的相應(yīng)階段進(jìn)行干預(yù)，如ACH患者主要是骨骼發(fā)育的異常，成年期無更多的表型出現(xiàn)，應(yīng)在骨骼發(fā)育的早期干預(yù)。

空間靶向性：遺傳病發(fā)生病變的組織/器官由致病基因的表達(dá)部位決定，靶向特定的病變細(xì)胞、糾正其異常功能，而不影響其他正常組織/器官功能可提高生物學(xué)治療措施的有效性及安全性。如既往RNAi導(dǎo)入機(jī)體主要利用腺病毒或慢病毒載體，缺乏特異性和靶向性。脂質(zhì)納米體解決了RNAi的細(xì)胞靶向性，目前已實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞靶向，如實(shí)質(zhì)腫瘤、呼吸道上皮細(xì)胞、部分吞噬細(xì)胞。靶向成骨細(xì)胞的 antagomir-214 (靶向ATF RNAi) 可促進(jìn)小鼠骨形成[24]。這也為其他生物治療措施如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向性提供了借鑒。此外，在干預(yù)手段的選擇方面，直接靶向致病基因/蛋白的治療措施，其理論上比通過靶向致病基因相關(guān)信號(hào)通路/靶基因來間接調(diào)節(jié)致病基因/蛋白的副作用更小。

安全性：基因組編輯技術(shù)的off-target現(xiàn)象是其最主要的安全問題，其使用的核酸酶可能激活原癌基因或破壞腫瘤抑制基因、最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。另外，導(dǎo)入蛋白的免疫反應(yīng)也是臨床應(yīng)用生物技術(shù)需要注意的副作用，必要時(shí)應(yīng)考慮同時(shí)使用免疫抑制劑。

5.3 強(qiáng)調(diào)綜合治療

雖然一些遺傳病的生物學(xué)治療措施得到了較大的發(fā)展，但必須清醒地認(rèn)識(shí)到目前這些生物學(xué)治療方法仍不能完全治愈遺傳病，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生的異常表型、并發(fā)癥，仍需要結(jié)合臨床進(jìn)行相應(yīng)的藥物、手術(shù)或康復(fù)治療。

綜上所述，基因組編輯、RNAi、融合蛋白、可溶性受體、模擬短肽等生物學(xué)方法，以靶向遺傳病致病基因DNA、RNA、編碼蛋白及相關(guān)信號(hào)通路/分子等為策略，給遺傳病的臨床治療提供了新的選擇。雖然這些治療措施大多數(shù)仍局限于體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，存在時(shí)空靶向性、安全性等需要進(jìn)一步完善的缺陷，但隨著生命醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，不久的將來生物學(xué)治療措施必將成功應(yīng)用于臨床上，治愈遺傳病成為可以預(yù)想的現(xiàn)實(shí)。

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