黃敏聰，潘偉，盧覓佳，張馬娟，夏麗娟，宣堯仙

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州310013）

脂多糖對(duì)B R L大鼠肝細(xì)胞的損傷研究

黃敏聰，潘偉，盧覓佳，張馬娟，夏麗娟，宣堯仙

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州310013）

目的研究脂多糖（LPS）對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞的損傷作用。方法體外培養(yǎng)BRL大鼠肝細(xì)胞，經(jīng)不同濃度LPS處理細(xì)胞后，檢測(cè)BRL大鼠肝細(xì)胞的增殖能力和凋亡率，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素10（IL-10）細(xì)胞因子含量。結(jié)果脂多糖在一定程度上能抑制BRL大鼠肝細(xì)胞增殖，并且呈濃度依賴(lài)性，高濃度脂多糖（200mg/L）能夠升高細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT活性，提高TNF-α含量及降低IL-10含量。結(jié)論高濃度脂多糖（200mg/L）能造成BRL大鼠肝細(xì)胞的損傷，損傷作用可能與打破促壞死因子與保肝因子之間的平衡有關(guān)。

脂多糖；BRL大鼠肝細(xì)胞；增殖；凋亡；細(xì)胞因子

脂多糖（LPS）是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，又稱(chēng)內(nèi)毒素，常被用來(lái)制備免疫型肝損傷模型[1]，郭竹英等[2]報(bào)道LPS能夠升高大鼠原代肝細(xì)胞細(xì)胞上清TNF-α等含量并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。而周鈞等[3]報(bào)道LPS在80mg/L濃度下對(duì)人正常肝細(xì)胞L02體外培養(yǎng)并無(wú)明顯的TNF-α含量變化和毒性作用，故不宜選用人肝細(xì)胞L02細(xì)胞株來(lái)研究LPS對(duì)肝臟的損傷作用。原代大鼠肝細(xì)胞一般采用灌注法分離獲得，分離成本和技術(shù)要求較高，細(xì)胞活性與穩(wěn)定性差異較大，難以保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可操作性。BRL大鼠肝細(xì)胞相對(duì)于大鼠原代肝細(xì)胞更容易獲取和培養(yǎng)，并且活性和穩(wěn)定性更佳，能保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此本研究選擇BRL大鼠肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并設(shè)置不同濃度梯度的LPS，觀察其對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響和對(duì)肝細(xì)胞損傷的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基（吉諾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)14032004）；胎牛血清（BBI生命科學(xué)有限公司，批號(hào)WD0213B10014J）；凋亡試劑盒 （生工生物工程股份有限公司，批號(hào)DY0404B14L）；AST、ALT檢測(cè)試劑（杭州德格醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)00001133）；CCK-8試劑盒（DOJINDO，批號(hào)FJ799）；DMSO（BIOSHARP，批號(hào)D-5879）；大鼠TNF-α、IL-10檢測(cè)試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20140801A）。二氧化碳培養(yǎng)箱 （美國(guó)熱電）、全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI 7020）、IX51倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS）、SIGMA2-6離心機(jī)（德國(guó)SIGMA）、FACS Calibur流式細(xì)胞儀 （美國(guó)BD）、BioTek Synergy HT酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。脂多糖（Sigma，批號(hào)043M4089V），用DMEM培養(yǎng)基將其溶解制成2g/L母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2細(xì)胞株 BRL大鼠肝細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%二氧化碳，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1BRL大鼠肝細(xì)胞增殖試驗(yàn) BRL大鼠肝細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞種于96孔板內(nèi)，加入梯度濃度的脂多糖（2、10、20、50、100mg/L）處理細(xì)胞20小時(shí)后，加入CCK-8試劑，再培養(yǎng)4小時(shí)，酶標(biāo)儀450nm測(cè)定吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。存活率（%）=藥物組平均吸光度/對(duì)照組平均吸光度×100%。

1.2.2BRL大鼠肝細(xì)胞損傷試驗(yàn) BRL大鼠肝細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞種于12孔板內(nèi)，設(shè)置正常對(duì)照組（溶劑培養(yǎng)液對(duì)照）和脂多糖高劑量組（200mg/L）和低劑量組（10mg/L）處理細(xì)胞24小時(shí)。完全吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，1500r/min離心5分鐘，吸取上清液用于ALT、AST、TNF-α、IL-10等指標(biāo)的檢測(cè)。用0.25%無(wú)EDTA胰酶消化BRL大鼠肝細(xì)胞，收集細(xì)胞置離心管，PBS洗滌后加入結(jié)合緩沖液，先加入Annexin V-FITC避光孵育15分鐘后離心棄上清液，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞再加入PI染色液，1小時(shí)內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用 （）表示，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1脂多糖對(duì)大鼠肝細(xì)胞增殖的影響 脂多糖2、10、20、50、100 mg/L組的BRL大鼠肝細(xì)胞增殖率分別為正常對(duì)照組的98%、97%、95%、90%、89%，提示脂多糖對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)增殖具有一定的抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度LPS對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞增殖的影響

2.2脂多糖對(duì)ALT、AST、IL-10和TNF-α含量的影響 對(duì)照組與脂多糖低濃度組比較，ALT、AST、IL-10和TNF-α四個(gè)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而脂多糖高濃度組較低濃度組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。提示脂多糖10mg/L濃度對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞的損傷作用不明顯，而20 0mg/L濃度時(shí)損傷較顯著，并且對(duì)細(xì)胞的損傷作用可能與細(xì)胞因子水平具有一定的關(guān)系。詳見(jiàn)表1。

表1 三組ALT、AST、IL-10和TNF-α含量的比較（）

表1 三組ALT、AST、IL-10和TNF-α含量的比較（）

與脂多糖低濃度組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 濃度（m g / L） A L T（U / L） A S T（U / L） I L -1 0（n g / L） T N F -α（n g / L）對(duì)照組 6 - 0 . 7 1 ± 0 . 2 9 3 . 9 9 ± 1 . 1 1 5 6 . 5 5 ± 4 . 3 3 2 5 1 . 7 6 ± 1 1 . 2 5脂多糖低濃度組 6 1 0 1 . 1 3 ± 0 . 3 7 5 . 4 2 ± 1 . 5 6 5 4 . 4 9 ± 6 . 2 7 2 4 3 . 0 3 ± 3 1 . 1 8脂多糖高濃度組 6 2 0 0 1 . 7 8 ± 0 . 6 2*7 . 9 2 ± 2 . 1 5*4 3 . 3 1 ± 1 . 9 9**2 9 3 . 6 3 ± 1 5 . 0 8*

2.3脂多糖對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組與脂多糖低濃度組的細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；脂多糖高濃度組較低濃度組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P＜0.01），提示脂多糖200mg/L濃度能夠誘導(dǎo)BRL細(xì)胞凋亡或壞死。詳見(jiàn)表2。

表2 三組BRL大鼠肝細(xì)胞凋亡率比較（，%）

表2 三組BRL大鼠肝細(xì)胞凋亡率比較（，%）

與脂多糖低濃度組比較**P＜0.01

組別 n 濃度（mg/L） 凋亡率對(duì)照組 4 - 11.98±4.31脂多糖低濃度組 4 10 12.39±3.08脂多糖高濃度組 4 200 45.13±9.98**

3 討論

本文采用BRL大鼠肝細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象，觀察脂多糖對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞的損傷作用。增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖能夠一定程度上抑制BRL大鼠肝細(xì)胞增殖作用，且呈濃度依賴(lài)性，脂多糖2、10、20、50、100 mg/L濃度對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞增殖的抑制率分別為2%、3%、5%、10%、11%。損傷實(shí)驗(yàn)顯示脂多糖10mg/L組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT有上升趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明脂多糖低濃度組對(duì)細(xì)胞凋亡壞死影響不明顯，而脂多糖200mg/L能明顯升高細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT活性，并明顯升高細(xì)胞凋亡率，提示高濃度脂多糖能明顯損傷BRL大鼠肝細(xì)胞，證實(shí)脂多糖有一定肝毒性。

TNF-α作為肝炎早期的改變指標(biāo)而被廣泛地研究，也是內(nèi)毒素血癥中造成肝細(xì)胞凋亡的終末介質(zhì)，脂多糖能夠刺激機(jī)體或細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。在脂多糖和藥物共同給予的實(shí)驗(yàn)中，采用各種TNF-α抑制劑來(lái)減少或阻斷TNF-α的產(chǎn)量或降低TNF-α的活性均能起到減少肝損傷的作用[4]。IL-10主要由活化的枯否氏細(xì)胞、T細(xì)胞、肝索內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞分泌[5]。IL-10一方面可以通過(guò)降低促壞死因子（TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-γ等）的表達(dá)分泌[6-8]，另一方面可以促進(jìn)肝細(xì)胞的再生[9-10]。IL-10的抗炎癥作用在許多肝損傷模型中 （如伴刀豆蛋白、四氯化碳、酒精致肝損傷等）多有所體現(xiàn)[11]。本組脂多糖高濃度組 TNF-α水平遠(yuǎn)高于低濃度組（P＜0.01），而IL-10水平遠(yuǎn)低于脂多糖低濃度組（P＜0.01），也提示肝損傷的發(fā)生與促壞死因子與保肝因子之間的平衡有一定的關(guān)系。肝臟促壞死因子如TNF-α可以通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)、干擾肝臟再生或直接損傷肝細(xì)胞而增加肝損傷的敏感性，肝保護(hù)因子如IL-10可以通過(guò)抑制炎癥因子而起到一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，脂多糖高濃度組在明顯地降低細(xì)胞上清中的IL-10含量的同時(shí)明顯地升高了TNF-α的含量，從而導(dǎo)致了BRL大鼠肝細(xì)胞的損傷，提示脂多糖致肝損傷作用可能與打破促壞死因子與保肝因子之間的平衡有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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