路 靜綜述，伊正君，付玉榮審校

0 引 言

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的人獸共患烈性傳染病，發(fā)病后死亡率幾乎為100%。全世界每年約有5.5萬(wàn)人死于狂犬病 ，狂犬病發(fā)生于世界上的80多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，包括發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家［1-2］。根據(jù)WHO發(fā)布的報(bào)告，2010年全球因狂犬病死亡人數(shù)約為61000人，中國(guó)經(jīng)臨床確診的狂犬病人數(shù)約為3300人［3］。近年來(lái)隨著貓、犬等寵物的增加，該病發(fā)病率逐年上升［4］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于病毒基因組的核酸診斷技術(shù)廣泛應(yīng)用于狂犬病的診斷中［5］。RABV的核酸診斷技術(shù)主要擴(kuò)增N基因，在RABV的進(jìn)化中L基因的部分核苷酸區(qū)域保守性強(qiáng)，也可作為檢測(cè)目標(biāo)。目前應(yīng)用于RABV的核酸診斷技術(shù)主要有基于PCR方法的核酸診斷技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification techniques，LAMP)、基因芯片技術(shù)，現(xiàn)從這些方面為RABV的核酸診斷技術(shù)作一綜述。

1 RABV的基因組結(jié)構(gòu)

RABV屬于單股負(fù)鏈RNA病毒目、彈狀病毒科、狂犬病毒屬，是具有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，在電子顯微鏡下呈彈狀或管狀，長(zhǎng)170～180nm，直徑75～80nm。RABV基因組由11928-11932個(gè)核苷酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為4.6×106，包括3'端的先導(dǎo)區(qū)、5個(gè)連續(xù)的結(jié)構(gòu)基因和5'端的非翻譯區(qū)7個(gè)部分。位于3'端的先導(dǎo)RNA基因即Leader結(jié)構(gòu)由58個(gè)核苷酸構(gòu)成，富含殘基A。5個(gè)結(jié)構(gòu)基因從3'端到5'端的排列順序是 N、P、M、G、L，分別編碼核蛋白、衣殼基質(zhì)蛋白、膜基質(zhì)蛋白、糖蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶。5'端的非翻譯區(qū)即Trailer結(jié)構(gòu)由56個(gè)核苷酸組成，富含T堿基。各結(jié)構(gòu)基因之間含有核苷酸數(shù)目不等的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，N-P、P-M、M-G和G-L之間的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分別含有核苷酸2個(gè)、5個(gè)、5個(gè)和24-29個(gè)，其中G基因和L基因之間是具有423個(gè)核苷酸的偽基因ψ，為RABV的非編碼區(qū)。

N基因由1 424個(gè)核苷酸組成，起始于第58位核苷酸，終止于第1 482位核苷酸，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為1 353個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)。堿基 A、T、G和 C所占比例分別為 28.68%、26.98%、23.80% 和 20.55%。N 基因是RABV中序列最保守、最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基因，其內(nèi)部有2個(gè)高度保守的區(qū)域，分別位于第64-105位氨基酸和第201-329位氨基酸，后者又可分為2個(gè)更為保守的區(qū)域，即第210-242位氨基酸和第271-317位氨基酸。N基因編碼的核蛋白表達(dá)量最高，常用作病毒的分型與診斷。根據(jù)N基因99位-405位和1 080位-1 278位核苷酸間的序列差異，RABV分成7個(gè)基因型，我國(guó)流行的RABV均為基因1型。P基因共有991個(gè)核苷酸，ORF含有核苷酸894個(gè)。M基因共有804或805個(gè)核苷酸，ORF含有核苷酸609個(gè)。G基因共有1675個(gè)核苷酸，ORF含有核苷酸1575個(gè)。L基因共有6475或6476個(gè)核苷酸，ORF含有核苷酸6429個(gè)。

2 RABV的核酸診斷技術(shù)

2.1 基于 PCR方法的核酸診斷技術(shù) 該方法1991年首次用于RABV的實(shí)驗(yàn)室診斷，是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。主要以RABV保守且特異的N基因?yàn)閿U(kuò)增目標(biāo)，包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)，巢式和半巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nested reverse transcription polymerase chain reaction and hemi-nestedreverse transcription polymerase chain reaction，nRT-PCR and hnRT-PCR)，熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)，PCR酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(PCR-enzyme-linked immunosorbentassay，PCRELISA)等［6-8］。

2.1.1 RT-PCR 該方法用時(shí)短，整個(gè)過(guò)程約為6～8 h?？蓹z測(cè)的樣本范圍十分廣泛，除普通標(biāo)本外，病毒載量低的樣本如疑似狂犬病患者死亡前的唾液、腦脊液、皮膚活檢樣本均可用RT-PCR，尤其是不適宜病毒分離和組織學(xué)檢測(cè)的腐敗樣本均能用該方法檢測(cè)，而且結(jié)果直觀，易于觀察，因此廣泛應(yīng)用于狂犬病的診斷［6-9］。該方法可以擴(kuò)增N基因和分析核苷酸序列，所以也可用于狂犬病的分子流行病學(xué)調(diào)查。

目前WHO和OIE尚未推出RT-PCR法診斷狂犬病的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程［9］。由于操作程序缺乏規(guī)范性，實(shí)驗(yàn)室容易出現(xiàn)交叉污染或假陰性問(wèn)題，檢測(cè)缺乏可靠性，因此限制了其在人和動(dòng)物狂犬病日常診斷中的應(yīng)用［10］。但是 Aravindh Babu RP 等［9］用RT-PCR方法擴(kuò)增部分N基因，檢測(cè)了患有狂犬病的貓、牛、犬、鼠和人等動(dòng)物的死后腦組織樣本。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，其中第1對(duì)引物針對(duì)N基因的第154-174位和第660-641位核苷酸，擴(kuò)增片段為506 bp，第2對(duì)針對(duì)N基因第410-429位和第942-923位核苷酸，擴(kuò)增片段為533bp，第3對(duì)針對(duì)N基因第55-73位和第660-641位核苷酸，擴(kuò)增片段為600 bp。將3種不同的引物組合，評(píng)價(jià)RTPCR快速檢測(cè)感染狂犬病的動(dòng)物腦組織的特異性和敏感性，檢測(cè)結(jié)果與FAT的相符度為100%。該試驗(yàn)證實(shí)當(dāng)標(biāo)本不適宜FAT法檢測(cè)或FAT檢測(cè)結(jié)果不可靠時(shí)，RT-PCR可作為確認(rèn)試驗(yàn)。在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)技術(shù)人員的操作下，通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制，RT-PCR方法同F(xiàn)AT聯(lián)合使用可用于日常診斷。RT-PCR方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)高通量樣品的快速檢測(cè)，因此該方法依然能夠得到廣泛應(yīng)用。

Biswal等［8］針對(duì) N基因的第 319-337位和第823-842位核苷酸設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為523 bp，用RT-PCR方法分析了臨床疑似狂犬病感染者的樣本，具體包括死前患者的皮膚活組織樣本、角膜印片和唾液以及死后患者的腦組織和腦脊液樣本，并與傳統(tǒng)的直接免疫熒光試驗(yàn)(direct immunofluorescence，DIF)、內(nèi)基小體檢查法、小鼠顱內(nèi)接種分離法(mouse inoculation test，MIT)做比較，結(jié)果表明同MIT法相比，RT-PCR法檢測(cè)RABV的靈敏度和特異性為100%。DIF法為83.3%，內(nèi)基小體檢查法為66.7%，證實(shí)RT-PCR法有較高的靈敏度和特異性，而且檢測(cè)用時(shí)短，可用于死前診斷。RT-PCR法也可作為MIT確診狂犬病的替代試驗(yàn)。

2.1.2 巢式和半巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)Heaton等［11］于1997年首次用hnRT-PCR檢測(cè)了6種RABV和狂犬病相關(guān)病毒。目前幾種nRT-PCR和hnRT-PCR已被應(yīng)用于臨床樣本RABV的RNA的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果可進(jìn)一步用于序列鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析［8，12］。研究證實(shí)應(yīng)用二次 PCR可提高檢測(cè)狂犬病毒的能力［13］。Araújo 等［14］用 hnRT-PCR和RT-PCR分別檢測(cè)了50例來(lái)自不同動(dòng)物的解凍后腦組織標(biāo)本，標(biāo)本保存于-20℃，動(dòng)物經(jīng)DFA和MIT診斷為狂犬病感染。RT-PCR擴(kuò)增片段為455 bp，hnRT-PCR擴(kuò)增片段為299 bp。結(jié)果顯示hnRTPCR的敏感性為90%，RT-PCR的敏感性為52%，從而證實(shí)前者敏感性顯著高于后者。同傳統(tǒng)的病毒分離方法RABV組織培養(yǎng)(rabies tissue culture infection test，RTCIT)和MIT相比，hnRT-PCR的敏感性顯著提高，接近于 qRT-PCR［15］。Coertse 等［12］用hnRT-PCR法檢測(cè)印度幾種不同臨床樣本中RABV的RNA。他們首先分別針對(duì)N基因的第541-561位和第647-666位核苷酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第一步反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后利用針對(duì)N基因的第1-15位和第647-666位核苷酸設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。該試驗(yàn)證實(shí)hnRT-PCR的準(zhǔn)確性和敏感性均較高，可用于敏感性要求高但又不具備qRTPCR條件的實(shí)驗(yàn)室。

2.1.3qRT-PCR qRT-PCR 是 WHO 和 OIE 推薦的檢測(cè)RABV的標(biāo)準(zhǔn)方法，它可以對(duì)病毒進(jìn)行定量測(cè)定，用以分析病毒載量、疾病進(jìn)程、實(shí)驗(yàn)性治療的有效性，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中活毒的滴定、實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)疫苗效價(jià)的測(cè)定、病毒致病機(jī)理研究以及病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)分布的分析中發(fā)揮著重要作用［16］。

qRT-PCR可檢測(cè)的標(biāo)本范圍十分廣泛，目前qRT-PCR已廣泛應(yīng)用于狂犬病的診斷［17］。封閉式的反應(yīng)管減少了交叉污染，敏感度比傳統(tǒng)nRT-PCR高出10 ～1000 倍［18］。Mani RS 等［19］近期研究證實(shí)TaqMan qRT-PCR利用Taq Man熒光探針，通過(guò)內(nèi)在的雜交反應(yīng)，保證了其高度特異性。他們分別針對(duì)N基因正義鏈的第55-73位核苷酸和反義鏈的第(-165)位-(-146)位核苷酸設(shè)計(jì)引物，針對(duì)N基因第78-111位核苷酸設(shè)計(jì)探針，用其檢測(cè)死后患者和死前患者的狂犬病毒RNA，前者為印度地區(qū)1997-2011年18例已死亡患者，患者經(jīng)熒光抗體試驗(yàn)、內(nèi)基小體試驗(yàn)、免疫組化試驗(yàn)確認(rèn)為狂犬病患者，后者為在2011-2012年13例由生前實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的死前狂犬病患者。這些患者的CSF樣本陽(yáng)性率為45.4%，頸部皮膚活檢樣本陽(yáng)性率為60%，唾液樣本陽(yáng)性率為85.7%。CSF標(biāo)本結(jié)合中和抗體檢查，死前樣本的陽(yáng)性率為100%。Wacharapluesadee等［20］利用Taq Man qRT-PCR檢測(cè)非神經(jīng)樣本中的狂犬病病毒RNA，特異性為100% 。Hayman等［17］在PCR反應(yīng)體系中加入SYBR Green染料，用qRT-PCR的通用引物［針對(duì)N基因正義鏈第55-73位和反義鏈第(-165)位-(-146)位核苷酸設(shè)計(jì)］檢測(cè)出了歐洲蝙蝠狂犬病病毒1型、2型和RABV，單一的通用引物即可以極高的敏感度檢測(cè)出不同的RABV，從而使檢測(cè)7種型別的RABV的RNA成為可能。Wang等［21］將 SYBR Green I染料加入 RTPCR反應(yīng)體中，建立了SYBR Green I定量實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。該方法利用了3條引物，其中1條針對(duì)RABV的Leader序列設(shè)計(jì)，用以擴(kuò)增整個(gè)病毒的基因組。其他2條是針對(duì)N基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，用以擴(kuò)增N基因。這種實(shí)時(shí)熒光RTPCR方法可對(duì)犬腦組織標(biāo)本進(jìn)行快速定量分析，提高了檢測(cè)的特異性。高志強(qiáng)等［22］利用TaqMan方法，針對(duì)古典RABV非編碼區(qū)及N基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)合成多對(duì)引物和多條探針，建立了古典RABV熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。與病毒分離鑒定、常規(guī)RT-PCR試驗(yàn)比較表明，該方法特異、敏感、快速，適用于感染動(dòng)物不同組織中病毒的相對(duì)定量及疫苗中活病毒或滅活病毒的檢測(cè)。應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)寵物醫(yī)院提供的犬唾液樣品，結(jié)果顯示為陰性，同病毒分離檢測(cè)結(jié)果一致。

qRT-PCR應(yīng)用于RABV診斷的同時(shí)不斷被改進(jìn)。在nPCR的基礎(chǔ)上，Suin等［23］建立了兩步法 qRTPCR。在連續(xù)的反應(yīng)中，引物以17%到30%的速度衰減，可將RABV 7種型別全部檢測(cè)出。最低檢測(cè)量為組織培養(yǎng)的2/3，得到的RNA曲線與非特異性的qRT-PCR、FAT、病毒滴定法有良好的相關(guān)性。敏感性高于FAT，特異性為100%。在TaqMan qRTPCR檢查古典RABV中應(yīng)用“Double Check”策略，能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)過(guò)程的安全性和結(jié)果的敏感性、可靠性，可檢測(cè)出目前已知的人和動(dòng)物所有的RABV類型以及蝙蝠中未知的RABV，也可用于參考實(shí)驗(yàn)室 qRT-PCR 方法的分析［10，24］。

2.1.4 基于PCR方法的其他核酸診斷技術(shù) PCR可與Southern blot hybridisation、ELISA方法結(jié)合用于RABV的診斷。Aravindhbabu等［25］將RT-PCR和ELISA聯(lián)合建立了RT-PCR-ELISA，該研究檢測(cè)了前期證實(shí)狂犬病毒為陽(yáng)性的43個(gè)樣本的狂犬病毒基因組，該研究證實(shí)RT-PCR-ELISA在診斷不同種類死后動(dòng)物腦組織的狂犬病毒基因組中的敏感性和特異性均為100%，可作為FAT法檢測(cè)狂犬病毒的替代試驗(yàn)和補(bǔ)充試驗(yàn)。有研究證實(shí)將PCR-ELISA與RT-PCR相結(jié)合，可區(qū)分歐洲蝙蝠狂犬病病毒和經(jīng)典狂犬病病毒，該法敏感性是PCR-Southern blot hybridisation法的100倍，具有簡(jiǎn)便、快速和敏感等優(yōu)點(diǎn)。

2.2 依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù) 與基于PCR方法的核酸診斷技術(shù)不同之處在于NASBA的產(chǎn)物是RNA，而前者為cDNA。這一反應(yīng)依賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA第一鏈后，RnaseH降解模板RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈，T7RNA多聚酶以此cDNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣本RNA序列相同的RNA。所用引物中一條包含T7噬菌體啟動(dòng)子序列，能識(shí)別T7RAN聚合酶，另一部分針對(duì)目的基因中的一段序列。由于所用工具酶的工作適宜溫度是37℃，所以只要在第一步變性、復(fù)性后，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不再需要溫度循環(huán)。NASBA方法快速、簡(jiǎn)便，檢測(cè)死前標(biāo)本的唾液和腦脊液中RABV的RNA，敏感性高于傳統(tǒng)的PCR。依賴核酸序列的擴(kuò)增-電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(NASBA-ECL assay)已被用于死前疑似狂犬病患者的日常診斷中，其敏感性比傳統(tǒng)的nPCR高100倍，而且用時(shí)短，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)4 h［6］。但是 Wacharapluesadee等［7］對(duì) NASBA、qRT-PCR 和傳統(tǒng)的RT-PCR進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)real-time NASBA試驗(yàn)在2例唾液標(biāo)本的檢測(cè)中出現(xiàn)了假陰性，從而提示NASBA-ECL可能不適用于RABV的診斷。

2.3 環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 基于PCR方法的核酸診斷技術(shù)所用聚合酶一般為 TaqDNA聚合酶，而LAMP技術(shù)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶和能特異識(shí)別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4條引物，恒溫條件(60℃ ～65℃)下1 h內(nèi)，擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個(gè)數(shù)量級(jí)。

LAMP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀易判讀，缺點(diǎn)是容易污染，試劑成本較高。由于LAMP沒(méi)有特殊的技術(shù)要求，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高于nRT-PCR 10倍以上，因此特別適用于基層單位。Muleya等［26］分別針對(duì)N基因保守區(qū)域的第363-382位、第528-545位、第383-460位和第461-524位核苷酸設(shè)計(jì)4條引物，用RT-LAMP法檢測(cè)贊比亞地區(qū)的RABV，證明其靈敏性和重復(fù)性均較好，可用于日常診斷。Saitou等［27］和 Hayman等［28］證實(shí)使用 RT-LAMP法檢測(cè)RABV十分有效，但若在RABV診斷中推廣該技術(shù)還需進(jìn)一步改進(jìn)。黃元等［29］針對(duì)狂犬病病毒的N基因中靠近上游的高度保守區(qū)段和L基因中的高度保守區(qū)段分別設(shè)計(jì)了一套引物，建立了檢測(cè)狂犬病病毒的快速一步式反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介恒溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)方法。許丹等［30］針對(duì)N基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)出LAMP法檢測(cè)RABV的通用引物，包括2條外引物和2條內(nèi)引物，其中前者分別針對(duì)N基因第24-48位和265-286位核苷酸，后者分別針對(duì)N基因第50-71位、第91-112位、第234-255位和第199-223位核苷酸。通過(guò)檢測(cè)17份臨床樣本，證實(shí)LAMP的陽(yáng)性檢出率與傳統(tǒng)PCR一致。

2.4 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。它是利用雜交測(cè)序方法原理，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，具有自動(dòng)化、微型化、高通量、高度平行性的特點(diǎn)。芯片技術(shù)在每份樣本中都設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，通過(guò)分子雜交予以確認(rèn)，避免了交叉污染，而且可對(duì)多種病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，有利于大規(guī)模推廣使用。王振全等［31］針對(duì)N基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，并將生物素標(biāo)記在靶基因的上游引物5'端，提高了雜交的靈敏度和特異性。原位多聚酶鏈反應(yīng)將原位雜交法ISH與PCR結(jié)合，用地高辛標(biāo)記針對(duì)RABV N基因核苷酸保守區(qū)域的核酸探針，與神經(jīng)纖維和神經(jīng)組織細(xì)胞中的病毒核酸雜交，出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)為陽(yáng)性結(jié)果，本法的敏感性和特異性均較高。低密度基因芯片技術(shù)融合了基因芯片的基本原理、酶聯(lián)顯色技術(shù)的基本原理和核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，與ELISA和RT-PCR相比，靈敏度高，特異性強(qiáng)。Xi等［32］根據(jù)N基因第62-442位核苷酸設(shè)計(jì)探針，建立了檢測(cè)RABV的寡核苷酸芯片，可檢測(cè)RABV的7種基因型，敏感性為100%，并與金標(biāo)準(zhǔn)方法FAT有高度的相關(guān)性，尤其適用于不適于FAT檢測(cè)的高度腐敗的腦組織標(biāo)本。該方法快速、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，是狂犬病和狂犬病相關(guān)疾病診斷的良好選擇。

3 結(jié) 語(yǔ)

狂犬病是一種呈世界分布的自然疫源性疾病，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷是控制狂犬病流行的有效方式。核酸診斷技術(shù)在RABV的檢測(cè)中發(fā)揮著巨大作用，其檢測(cè)樣本范圍十分廣泛，可以是感染個(gè)體的唾液、腦脊液、淚液、尿液、皮膚、毛囊提取物、感染病毒后的細(xì)胞培養(yǎng)物、死前或死后的狂犬病患者腦組織標(biāo)本等，也可以是不適宜病毒分離和組織學(xué)檢測(cè)的腐敗樣本，保存時(shí)間較長(zhǎng)的腦組織樣本等［18］。器官捐獻(xiàn)可致RABV的傳播，核酸診斷技術(shù)可檢測(cè)捐獻(xiàn)者是否感染RABV。核酸診斷技術(shù)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，因此不被推薦作為RABV死后診斷的常規(guī)方法。但是在具備實(shí)驗(yàn)條件和專業(yè)技術(shù)人員的操作下，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制，可用于RABV死前患者的診斷和流行病學(xué)調(diào)查中［33］。檢測(cè)病毒RNA的RT-PCR等方法以其高度的特異性和敏感性以及快速的檢測(cè)速度使其廣泛應(yīng)用于臨床診斷中，成為臨床診斷的參考方法［34］。

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