潘雪梅，房德敏

(天津市天津醫(yī)院，天津 300211)

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制何首烏致肝損傷毒性的研究進展

潘雪梅，房德敏*

(天津市天津醫(yī)院，天津 300211)

目的：探討制何首烏的毒性機制及毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)參考。方法：檢索國內(nèi)外近十年有關(guān)制何首烏致肝損傷的相關(guān)文獻報道，綜述毒性物質(zhì)基礎(chǔ)、毒性機制及炮制減毒等方面的研究進展。結(jié)果：毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面，主要以含量相對較高或易獲得的某些主要成分進行篩選驗證研究；毒性機制研究方面，主要從體內(nèi)代謝、細胞凋亡的某個特定通路層面探討肝損傷的可能機制；炮制減毒研究方面，主要考查不同炮制方法、時間等因素對肝毒性的影響。結(jié)論：制何首烏的肝毒性客觀存在，生熟混用、炮制不充分可能是引發(fā)肝毒性的主要因素。諸多學(xué)者從中毒機制、毒性物質(zhì)基礎(chǔ)方面深入研究，雖已取得了一定成果，但尚無定論。

制何首烏，肝損傷，毒性機制，毒性成分，炮制

何首烏為蓼科植物何首烏(Thunb)的干燥塊根，是一種常用的補益良藥，始載于《開寶本草》，在醫(yī)療和保健中使用廣泛，不但暢銷國內(nèi)市場，還遠銷國際市場。但自20世紀末，何首烏的不良反應(yīng)報道日漸增多，尤其以肝損傷為多[1]，國內(nèi)外高度重視。加拿大、英國和澳大利亞等國家的藥品監(jiān)督管理部門相繼出臺了相關(guān)的監(jiān)管政策。2014年7月，我國食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布第61期《藥品不良反應(yīng)信息通報》，提示關(guān)注口服何首烏及其成方制劑可能有引起肝損傷的風(fēng)險。何首烏生瀉熟補，臨床多以制何首烏入藥。臨床報道的肝損傷病例絕大部分生熟不明，注明的幾例病例中，炮制品的發(fā)生率明顯低于生品。本文檢索相關(guān)文獻，從主要成分的毒性研究、制何首烏的毒理研究及炮制工藝對肝損傷作用的影響等方面，闡述制何首烏致肝損傷毒性的研究進展。

1 制何首烏活性成分的致肝損傷毒性研究

何首烏主要成分為二苯乙烯苷類、蒽醌類、鞣質(zhì)類及聚合原花青素等，此外還含有大量的磷脂類化合物及多種微量元素。目前，毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，主要以含量相對較高或易獲得的某些主要成分進行篩選驗證研究，主要集中在蒽醌類、鞣質(zhì)類及二苯乙烯苷類化合物。

1.1 蒽醌類 蒽醌類成分是何首烏致肝損傷毒性成分研究的熱點。蒽醌類主要包括大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、大黃酸及大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷等。大黃中化學(xué)成分與肝腎性相關(guān)性研究顯示[2]，游離及結(jié)合態(tài)蒽醌類成分都可能具有肝腎毒性，游離蒽醌類的毒性順序為：蘆薈大黃素>大黃素甲醚>大黃酸>大黃素>大黃酚；結(jié)合態(tài)蒽醌的毒性順序為：結(jié)合蘆薈大黃素>結(jié)合大黃素甲醚>結(jié)合大黃酚>結(jié)合大黃素>結(jié)合大黃酸。大黃酸濃度在15、30和60 μmol/L時均會引發(fā)HepG2細胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放率顯著增加，大黃素濃度在15、60和120 μmol/L也會引發(fā)HepG2細胞的LDH釋放率顯著增加，同時大黃素及大黃酸還會導(dǎo)致HepG2細胞空泡化，線粒體膜電位降低，并促進HepG2的細胞凋亡，但對HepG2細胞的細胞周期并無明顯影響。大黃酸對大鼠原代培養(yǎng)肝細胞也表現(xiàn)出了明顯的毒性，約25 μmol/L的大黃酸即可引起半數(shù)原代肝細胞的死亡，這種毒性與其對氧化還原循環(huán)、細胞內(nèi)巰基的氧化及游離鈣的增加相關(guān)[3]。蒽醌類成分對肝HepG2細胞的毒性順序為大黃酸(IC50=67.71 μmol/L)>大黃素(IC50=125.30 μmol/L)>蘆薈大黃素(抑制率未達50%)>大黃酚和大黃素甲醚(均無明顯抑制作用)[4]。在制何首烏不同大黃蒽醌類成分致肝損傷研究[5]中，將制何首烏大黃蒽醌類成分給大鼠連續(xù)灌胃3個月，各給藥組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)均有不同程度的升高，與空白組比較，其中的大黃酚組大鼠血清(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另外研究[6]發(fā)現(xiàn)，大黃酚可顯著提高大鼠肝細胞凋亡指數(shù)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量(P<0.05)，而大黃素、大黃酸無顯著影響。

馬致潔[7]考查何首烏及大黃素、大黃酸、沒食子酸三個單體對體外培養(yǎng)的人正常肝細胞系L02細胞毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥24 h后，何首烏、大黃素、大黃酸、沒食子酸及三個單體聯(lián)合給藥組均出現(xiàn)胱酰肽酶Caspase-3和Bax表達量的提高，與對照組相比，大黃素對Caspase-3和Bax表達量具有顯著的促進作用，沒食子酸作用最?。淮簏S酸組Caspase-9蛋白表達提高，其他實驗組則出現(xiàn)表達下降的結(jié)果，其中大黃素對Caspase-9蛋白表達的下調(diào)作用最大，沒食子酸和何首烏對Caspase-9的作用次之；何首烏組Bcl-2表達量下降，其他各實驗組Bcl-2表達量均提高，大黃酸對Bcl-2的促進表達作用最強，大黃素較弱。表明何首烏及其主要成分與細胞凋亡信號通路Caspase通路有關(guān)，能調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax兩個凋亡相關(guān)蛋白的表達。進一步表明何首烏及其主要成分有可能是通過誘導(dǎo)細胞凋亡對L02細胞產(chǎn)生毒性的，而何首烏中大黃素和大黃酸有可能是引起肝細胞損傷的主要成分。

1.2 二苯乙烯苷類 二苯乙烯苷為制何首烏的主要活性成分，但其致肝損傷作用的研究不多。胡錫琴等[8]分別按150、300、600 mg/kg劑量給大鼠灌胃，連續(xù)90 d后停藥，恢復(fù)15 d，分別于第60、90和105日時，觀察何首烏中2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(二苯乙烯苷)對于大鼠肝臟酶及蛋白等生化指標的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，給藥第60日，各劑量組球蛋白(GLB)顯著升高，白蛋白和球蛋白比(A/G)顯著降低；給藥第90日，中劑量與大劑量組的ALT和AST顯著升高，中劑量組白蛋白(ALB)顯著降低；停藥第15日，LDH顯著降低，其他指標無統(tǒng)計學(xué)意義。表明二苯乙烯苷大劑量長期使用時，會對肝臟造成一定的損傷，停藥后可恢復(fù)肝功正常。

1.3 鞣質(zhì)類 鞣質(zhì)毒性的研究已有50年歷史，早在第二次世界大戰(zhàn)期間已懷疑其肝毒性。鞣酸能引起放牧動物的肝損害，是過去隱源性肝損傷的主要原因。鞣質(zhì)分為縮合鞣質(zhì)和可水解鞣質(zhì)，縮合鞣質(zhì)對肝臟無毒，可水解鞣質(zhì)的毒性較高，對肝臟有嚴重的損害作用。何首烏中的鞣質(zhì)量高達15.7%[9]。研究顯示，何首烏中鞣質(zhì)對大鼠肝臟具有一定損傷作用[10]。胡錫琴等[11]研究何首烏中提取物鞣質(zhì)對大鼠肝臟生化指標的影響。結(jié)果：①與對照組相比，給藥60 d時，大劑量組(相當(dāng)于成人用量的100倍)大鼠血清中ALT顯著升高(P<0.01)，中劑量組(相當(dāng)于成人用量的50倍)升高(P<0.05)；堿性磷酸酶(ALP)中、小劑量組(相當(dāng)于成人用量的25倍)有所降低(P<0.05)；甘油三酯(TG)大劑量組升高(P<0.05)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)大、小劑量組升高(P<0.05)；總膽紅素(TBIL)大、中、小劑量組均顯著性降低(P<0.01)。②給藥90 d后，大劑量組大鼠血清ALT、GGT均升高(P<0.05)。③恢復(fù)15 d后，各項指標與對照組均無顯著差異。表明何首烏提取物鞣質(zhì)長期大劑量灌胃對大鼠肝臟有損害，中劑量短期內(nèi)對肝臟有所損害，小劑量無明顯肝損害，但其對肝臟的損害在停藥后均可以恢復(fù)。

另外胡錫琴等[12]研究發(fā)現(xiàn)，何首烏提取物鞣質(zhì)與二苯乙烯苷不同配比可致不同程度的大鼠肝臟損傷。結(jié)果顯示，二苯乙烯苷對鞣質(zhì)的肝臟損傷作用有一定的協(xié)同作用。在肝損傷方面，二苯乙烯苷能夠使鞣質(zhì)的作用不可逆，但可以減輕鞣質(zhì)造成的肝臟內(nèi)三酰甘油聚集。鞣質(zhì)與二苯乙烯苷1∶1配比組，對肝臟的損傷作用在恢復(fù)期后仍然存在。實驗顯示，AST、ALT、膽堿酯酶(CHE)、LDH、總蛋白(TP)、ALB、ALP在不同給藥時間均呈不同程度變化，與空白對照組比較或者組間比較，給藥60 d時達到高峰期，給藥90 d和恢復(fù)期CHE、LDH則呈顯著性降低，說明肝損害沒有完全恢復(fù)。鞣質(zhì)與二苯乙烯苷2∶1配比組有一定的肝臟損傷作用。實驗結(jié)果顯示，ALT和AST在給藥60 d達到高峰，90 d和恢復(fù)期均下降至正常，但是CHE、LDH、ALP直至恢復(fù)期多繼續(xù)下降(LDH、ALP下降的原因有待研究)，說明該配比組較其他給藥組肝損傷略明顯。可見，鞣質(zhì)與二苯乙烯苷配比可損傷到肝實質(zhì)細胞，而且這種損傷不可逆。

1.4 未知成分 呂旸[13]應(yīng)用中藥活性/毒性作用與化學(xué)成分的相關(guān)性研究方法，將不同提取方法何首烏的UPLC指紋圖譜與何首烏對人肝細胞的毒性進行PLS回歸分析，發(fā)現(xiàn)了2個與肝細胞毒性相關(guān)性較大的成分，但其結(jié)構(gòu)還需進一步研究。

2 制何首烏致肝損傷機制研究

2.1 對血液生化酶的影響及肝臟病理研究 胡錫琴等[14,15]研究不同劑量制何首烏濃縮水煎液對大鼠肝臟的損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量組在不同階段對血清中ALT、ALP、AST呈現(xiàn)不同程度的影響。與對照組比較，大(40 g/kg·d-1)、中(20 g/kg·d-1)劑量組大鼠灌胃12周以上ALP、AST顯著升高(P<0.05)，灌胃時間少于12周和停藥2周后ALT、AST、ALP各指標與對照組比較無顯著性差異；小劑量組(10 g/kg·d-1)不同階段均無顯著性差異。同時，肝臟病理檢查結(jié)果顯示[16]，各劑量組肝臟病理切片光鏡下見，不同劑量組肝細胞內(nèi)有不同程度的脂肪變性，少數(shù)大鼠肝細胞萎縮、肝血竇擴張充血，偶見炎細胞浸潤；大劑量組脂肪變性例數(shù)多于中、小劑量組，飼喂時間長的大鼠病理切片顯示重于飼喂時間短的大鼠，雌性鼠出現(xiàn)肝臟脂肪變性多而重于雄性鼠。表明，制何首烏水煎濃縮液長時間較大劑量灌胃時對大鼠肝臟有一定程度的毒副作用，并且這種肝毒性呈現(xiàn)“量-時-毒”相關(guān)性，且為可逆性損傷，隨著停藥可以逐漸恢復(fù)正常。

通常胞內(nèi)酶ALT、AST在急性肝損傷、重度損傷時從肝細胞內(nèi)釋放入血，血清中ALT、AST能明顯升高，而在慢性輕度損傷時，血清中ALT、AST升高不明顯。李玥等[17]觀察制何首烏醇提物不同劑量長期(60 d)給藥對小鼠肝臟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量組血液生化指標及病理組織學(xué)的檢測與空白組相比均無顯著性差異。提示制何首烏醇提物長期給藥產(chǎn)生的肝臟損傷可能是非急性肝損傷，生化指標表現(xiàn)不顯著。

2.2 致肝損傷的化學(xué)機制研究 自由基和脂質(zhì)過氧化在肝損傷中起著十分重要的作用。肌體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并由此形成脂質(zhì)過氧化物，使組織細胞受損傷。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物，其含量的變化可反映組織細胞的損傷程度。谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)存在肌體各種組織中，以肝臟為最多，其具有消除體內(nèi)自由基和解毒雙重功能，此酶活力的大小，可反映肌體抗氧化能力的高低，并對肝臟的早期損傷及肝癌的早期診斷具有一定價值。單胺氧化酶(MAO)是診斷肝硬化的一項重要指標，肝硬化時MAO活性常明顯增高。

胡錫琴等[15]從化學(xué)機制角度研究制何首烏致肝損傷的毒性機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量制何首烏水煎濃縮液大鼠灌胃90d，肝組織勻漿檢測，大劑量組(40 g/kg·d-1)MDA與對照組比較有顯著升高(P<0.05)；其他劑量組無顯著性差異。MAO、GSH-ST各劑量組均無顯著性差異。提示，制何首烏肝損傷可能與脂質(zhì)過氧化相關(guān)。在病理情況下，氧自由基過多產(chǎn)生，引發(fā)肝細胞膜、線粒體膜及溶酶體膜的脂質(zhì)過氧化，使肝細胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致肝細胞壞死，而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物及降解產(chǎn)物(如MDA)可進一步加重生物膜損傷，加快肝細胞壞死進程，最終使肝細胞受損。

馬致潔[7]以何首烏致肝損傷患者的血清為研究對象，采用LC-MS/MS Q-TOF技術(shù)，表征臨床何首烏肝毒性患者血清與正常人血清的代謝圖譜差異，結(jié)合代謝組學(xué)分析手段，篩選了能準確評估何首烏致肝毒性引發(fā)代謝紊亂的特征標志物40個，代謝通路分析推測何首烏肝毒性可引發(fā)肝臟損傷和肝膽淤積，其機制可能與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)1個與患者治療轉(zhuǎn)歸過程相關(guān)的標志物四氫皮質(zhì)酮，可望用于何首烏肝損傷患者的預(yù)后，且在典型患者和何首烏致肝損傷的大鼠中被驗證。

2.3 致肝損傷的免疫機制研究 細胞凋亡是指生物肌體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過自身基因調(diào)控，使生理上不需要的細胞進行自動有序消亡的過程，其不同于細胞壞死的細胞死亡方式[18,19]。細胞凋亡除了維持正常生理平衡外，還與許多疾病的形成密切相關(guān)。在肝臟疾病或肝損傷中，往往伴有肝細胞凋亡。肝細胞的凋亡機制很復(fù)雜，目前認為，肝細胞以死亡受體介導(dǎo)的凋亡和線粒體誘導(dǎo)的凋亡為主要的凋亡形式[20]。

衛(wèi)培峰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏(6.67 g/kg·d-1)大鼠灌胃連續(xù)3個月，可誘導(dǎo)大鼠肝細胞凋亡，并使血清TNF-α含量明顯升高。提示制何首烏導(dǎo)致的肝臟損害可能是由TNF-α作為刺激肝細胞凋亡的正性觸發(fā)因子誘導(dǎo)肝細胞凋亡而發(fā)生的。

胡錫琴等[21]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)灌胃制何首烏水煎濃縮液(30 g/kg·d-1)90 d，給藥60 d時與對照組比較，大鼠血清中免疫球蛋白M(IgM)含量顯著性升高(P<0.05)，給藥90d時大鼠胸腺質(zhì)量顯著性升高(P<0.05)，免疫球蛋白G(IgG)的含量無顯著性差異；未檢測到免疫球蛋白A(IgA)的含量。同時，實驗中還發(fā)現(xiàn)，血清IgM升高的大鼠，多數(shù)伴有ALP、ALT或AST的升高?？偨Y(jié)實驗結(jié)果認為，何首烏大劑量長期飼喂大鼠，引起實驗動物體液免疫調(diào)節(jié)增強，亦是大鼠肝臟損傷的表現(xiàn)。其機制可能是長期給予大鼠何首烏后，何首烏或其代謝產(chǎn)物進入肝細胞，使肝細胞膜的抗原性發(fā)生改變，在肝細胞表面形成小分子蛋白質(zhì)抗原，并與細胞表面的受體結(jié)合成復(fù)合物，使肌體產(chǎn)生抗體，再通過體液免疫將其清除。而肝臟為藥物轉(zhuǎn)化、代謝的主要器官，該實驗較長時間內(nèi)給予大劑量何首烏，引起動物體液免疫增強，從而導(dǎo)致血清IgM升高，最終引起肝臟損傷。

在肝臟的生物轉(zhuǎn)化過程中，細胞色素P450酶(CYP450)是Ⅰ相催化反應(yīng)中主要酶，是催化多種藥物、前毒物、前致癌物等外源性物質(zhì)的氧化和還原代謝的主要酶類。胡錫琴等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)灌胃制何首烏水煎濃縮液(30 g/kg·d-1)90 d，對大鼠肝臟微粒體CYP450無顯著影響。王文靜等[23]進一步研究生何首烏、制何首烏對SD大鼠肝微粒體CYP450以及血液生化酶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，予SD大鼠兩種相同劑量何首烏連續(xù)灌胃90 d，生何首烏組肝微粒體蛋白顯著性下降，CYP450含量顯著增高(P<0.01)，制何首烏組無明顯變化；血液生化酶中生何首烏組的血清ALT、AST顯著性降低，制何首烏血清ALP顯著性升高；生何首烏和制何首烏的血清TP、TG均顯著性降低；血清尿素氮(BUN)中二者均呈下降趨勢，但生何首烏具有顯著性；肌酐(CREA)二者均呈顯著性下降趨勢，表明生何首烏致肝損傷并有CYP450的明顯升高，制何首烏對CYP450無影響。生何首烏和制何首烏能夠影響血液生化酶，生何首烏降低ALT、AST，制何首烏升高ALP，二者同時降低TG、BUN和CREA。提示生何首烏、制何首烏致大鼠肝物質(zhì)代謝途徑的作用機制有所不同。

細胞色素P4502E1(CYP2E1)是一種受乙醇誘導(dǎo)的CYP450亞族，能夠代謝約50%的臨床用藥，在肝臟中占肝細胞色素酶總量的7%，是肝細胞色素酶的重要成分。有研究表明，CYP2E1僅在肝中表達，是肝的特異性功能酶。目前，通過CYP2E1代謝的物種已經(jīng)被確定的近100種，其中大部分是前致癌物和前毒物，少部分為藥物，多為親脂性小分子化合物，尤其在一些肝毒性物質(zhì)(如乙醇、脂肪酸、亞硝胺、酮體、四氯化碳等)氧化代謝，CYP2E1起著重要作用。若CYP2E1活性受到抑制，則增加了該亞型代謝的藥物的濃度，延長藥理作用時間，從而可增加藥物的不良反應(yīng)。同時，CYP2E1 mRNA表達水平往往與代謝活性相關(guān)，但是受體內(nèi)外諸多因素的影響，如在饑餓、禁食及糖尿病等。張敏[5]研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏可顯著抑制大鼠肝組織CYP2E1 mRNA的表達，對CYP2E1酶活性有一定的誘導(dǎo)作用。由于酶活性測定結(jié)果與mRNA表達水平不一致，說明CYP2E1酶活性的升高可能不是通過影響基因轉(zhuǎn)錄水平而影響其蛋白水平來實現(xiàn)。推測，CYP2E1酶活性的誘導(dǎo)不是通過核受體介導(dǎo)，而是通過穩(wěn)定CYP2E1酶蛋白，從而減少CYP2E1的降解及延長其代謝作用而起的誘導(dǎo)作用。

3 炮制與肝損傷相關(guān)性研究

3.1 炮制方法與時間對肝損傷的影響 中藥炮制乃是祖國醫(yī)學(xué)中的重要組成部分。清代《修事指南》載有“炮制不明，藥性不確，則湯方無準，而病證不驗也?！焙问诪跎飚愔?，《本草匯言》指出何首烏“生用氣寒，性斂，有毒；制熟氣溫，無毒”。腹腔給藥時，生何首烏的LD50為2.7 g/kg，制何首烏LD50為169.4 g/kg[24]。一項比較何首烏生品和炮制品對大鼠肝臟損傷作用差異的研究顯示，以生何首烏、制何首烏75%乙醇提取物按可比生藥量(50 g/kg)，連續(xù)予大鼠灌胃6周后，生何首烏組大鼠血清ALT、AST、ALP、結(jié)合膽紅素(DBIL)、TBIL顯著性升高(P<0.05或0.01)；間接膽紅素(IBIL)、總膽汁酸(TBA)顯著性降低(P<0.05或0.01)；制何首烏組血清各項指標變化不明顯。病理組織顯示，生何首烏組肝組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，局部可見肝細胞壞死；制何首烏組肝臟組織基本正常，未見明顯病變現(xiàn)象[25]。在內(nèi)毒素特異質(zhì)模型上，接近臨床用藥劑量的生首烏即可表現(xiàn)出肝損傷作用，而制首烏表現(xiàn)出同樣肝損傷其劑量須擴大4倍，提示炮制可降低何首烏的特異質(zhì)肝毒性[26]。

何首烏炮制不及或太過會影響成品質(zhì)量。目前，各地現(xiàn)行炮制規(guī)范多沿用歷史的習(xí)慣與經(jīng)驗，認識不一，差別較大。而且現(xiàn)行控制標準主要是基于指標性成分的含量測定，與安全性關(guān)聯(lián)不夠緊密。研究顯示[27,28]，市售制何首烏質(zhì)量參差不齊，二苯乙烯苷和游離蒽醌的含量及粉末顏色均存在較大差異；網(wǎng)購的26批制何首烏相當(dāng)部分炮制減毒不充分，對肝細胞毒性(IC50)差異較大，其中4批樣品的毒性甚至大于生何首烏對照藥材。

炮制的時間和工藝均對其肝毒性有影響，適當(dāng)?shù)呐谥瓶梢詼p少甚至消除對肝臟的損害。呂旸[29]從生物檢定的角度，應(yīng)用肝細胞毒價檢測方法評價22批生、制何首烏質(zhì)量。結(jié)果18種制何首烏毒性均低于生品，并隨著炮制時間的增加而降低，最終趨于穩(wěn)定。李衛(wèi)先等[30-32]以ALP、AST、ALT為指標，考查籠屜蒸不同時間的制何首烏肝損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，72 h組、24 h組、12 h組及生品組的ALP、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)，而48 h組和恢復(fù)期無顯著性差異。同法考查高壓鍋蒸不同時間的制何首烏肝損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，9 h組、5 h組、3 h組及生品組的ALP、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)，而7 h組和恢復(fù)期無顯著性差異。同法考查傳統(tǒng)蒸曬重復(fù)不同次數(shù)的制何首烏肝損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，九蒸九曬組、五蒸五曬組、三蒸三曬組及生品組的ALP、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)，而七蒸七曬組和恢復(fù)期無顯著性差異。因此，何首烏炮制時，采取籠屜蒸48 h、高壓鍋蒸7 h或七蒸七曬工藝較好。另有研究[28,33]發(fā)現(xiàn)，何首烏常壓清蒸法減毒速度較慢，蒸制12 h毒性僅下降13.6%；高壓清蒸法和高壓黑豆汁蒸法減毒速度相對較快，蒸制5～6 h毒性下降22.1%左右，且趨于穩(wěn)定，且高壓清蒸3h減毒效果較佳。

3.2 不同炮制品肝損傷比較研究 根據(jù)歷代炮制方法記載，何首烏有20多種炮制方法，常見的方法有清蒸，黑豆制，酒制，黑豆、黃酒制等。炮制方法不同，其內(nèi)在成分含量或結(jié)構(gòu)變化不同，對肝臟的毒性也存在不同程度的差別。

張敏[5]考查清蒸和黑豆汁蒸制不同時間的何首烏炮制品對大鼠肝臟的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同炮制品水煎濃縮液(用藥量相當(dāng)于成人用藥量的10倍)大鼠連續(xù)灌胃90 d，與空白組比較，各給藥組大鼠血清ALT無顯著性差異，AST均顯著升高，其中清蒸組升高非常顯著(P<0.01)；大鼠肝組織CYP2E1相對表達量(V值)與CYP2E1的基因mRNA水平顯著降低，其中清蒸組結(jié)果與空白組最為接近，黑豆汁制首烏各組隨炮制時間的延長CYP2E1 mRNA表達似有增強的趨勢；各給藥組均對大鼠肝微粒體CYP2E1酶活性有誘導(dǎo)作用，且黑豆汁制16h、32h誘導(dǎo)作用顯著(P<0.05)，清蒸與黑豆汁制8h無顯著性差異；肝組織病理檢查，各給藥組大鼠肝組織細胞均有不同程度的病變，多數(shù)表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性和炎細胞浸潤?？芍?，不同炮制品對大鼠肝細胞存在不同程度的損傷，炮制方法和炮制時間可能對這種肝毒性存在一定的影響。

吳婷[10]通過長期(90 d)灌服大鼠何首烏生品及不同炮制品水煎濃縮液，探求何首烏生品及不同炮制品是否具有致肝臟損傷作用，以及這種作用隨著炮制方法的不同是否有解除或降低的趨勢；何首烏生品及不同炮制品導(dǎo)致肝臟損傷的發(fā)生是否與肝細胞凋亡有關(guān)；同時分析何首烏中致肝細胞損傷的物質(zhì)化學(xué)成分。結(jié)果顯示：①何首烏生品及不同炮制品水提物較醇提物均含有少量大黃素，微量大黃素甲醚(除九蒸九曬何首烏未檢測出)。何首烏生品及不同炮制品水提物中均含有鞣質(zhì)，其中清蒸組(清蒸32h)含量最高，九蒸九曬組其次。②各給藥組雄性大鼠體重與空白對照組比較，無顯著差異。雌性大鼠體重黑豆汁制首烏組(用藥量相當(dāng)于成人10倍量)與何首烏九蒸九曬組給藥第3周與空白對照組比較，有明顯差異(P<0.05)；給藥第4周，何首烏生品組、清蒸高劑量組(用藥量相當(dāng)于成人50倍量)、清蒸低劑量組(用藥量相當(dāng)于成人10倍量)、何首烏九蒸九曬組(用藥量相當(dāng)于成人10倍量)與空白對照組比較，有明顯差異(P<0.05)。③與空白對照組比較，何首烏生品組TBIL、IBIL明顯升高(P<0.05)；黑豆汁制首烏組TBIL、IBIL顯著升高(P<0.01)；清蒸低劑量組IBIL明顯升高(P<0.05)，GLO明顯降低(P<0.05)；清蒸高劑量組IBIL顯著升高(P<0.01)；何首烏九蒸九曬DBIL顯著降低(P<0.01)、IBIL顯著升高(P<0.01)，GLO明顯降低(P<0.05)，ALT、AST明顯升高(P<0.05)。④肝臟組織病理切片顯示，光鏡下何首烏生品組、清蒸低劑量組病變以肝竇充血為主，黑豆汁制首烏組、清蒸高劑量組、何首烏九蒸九曬組除可見肝竇充血，肝細胞萎縮偶見點狀壞死，何首烏九蒸九曬組還可見肝細胞脂肪變性。⑤何首烏生品組、清蒸低劑量組、黑豆汁制首烏組未見明顯細胞核凋亡，可見肝竇中散在血紅細胞。清蒸高劑量組、何首烏九蒸九曬組可見細胞核凋亡。與空白對照組比較，何首烏清蒸高劑量組大鼠肝組織凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)；何首烏九蒸九曬組大鼠肝組織凋亡指數(shù)顯著性增高(P<0.01)。表明：①何首烏中鞣質(zhì)對大鼠肝臟具有一定損傷作用，大黃素對肝損傷作用有待進一步研究。②何首烏生品及不同炮制品對大鼠生長發(fā)育有一定毒性影響，尤其是雌性體重方面，但不能排除人為因素(如灌胃)對大鼠生長發(fā)育影響。③大鼠給藥3個月，何首烏生品及炮制品均不同程度對大鼠肝臟造成損傷，以何首烏九蒸九曬組顯著。何首烏清蒸高劑量組、何首烏九蒸九曬組通過誘導(dǎo)肝細胞凋亡造成肝損害，其中清蒸何首烏對肝的損害程度與給藥劑量成正相關(guān)性。

4 結(jié)語

制何首烏作為臨床常用滋補中藥，具有廣泛的藥理活性和藥用價值。何首烏炮生為熟內(nèi)在成分明顯改變，致肝物質(zhì)代謝途徑的作用機制發(fā)生變化。但其肝損傷不良反應(yīng)臨床仍時有報道，其肝毒性不容忽視。諸多學(xué)者從毒性物質(zhì)基礎(chǔ)、毒性體內(nèi)過程、炮制減毒等多方面深入研究，雖已取得了一定研究成果，但對于其中毒機制和物質(zhì)基礎(chǔ)仍眾說紛紜、尚無定論。因此，仍需從體內(nèi)代謝或細胞凋亡的諸多通路層面，進一步探討中毒可能機制，為臨床不良反應(yīng)提供更充分的解釋，為臨床合理用藥提供有效參考。此外，目前市售制何首烏質(zhì)量參差不齊，質(zhì)量不佳是引發(fā)肝毒性的可能因素之一。嚴格制定炮制標準，尋求能夠兼顧療效與安全的檢測方法，杜絕生熟混用，合理用藥，是減少其不良反應(yīng)發(fā)生的有效手段。

1 Xiang Lei,Jing Chen,Jingtian Ren,etal. Liver Damage Associated with Polygonum ultiflorum Thunb.: A Systematic Review of Case Reports and Case Series[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2015,2015:1-9

2 王伽伯,馬永剛,張萍,等.炮制對大黃化學(xué)成分和肝腎毒性的影響及其典型相關(guān)分析[J].藥學(xué)學(xué)報,2009, 44(8):885-890

3 Bironaite D,Ollinger K.The hepatotoxicity of rhein involves impairment of mitochondrial functions[J].Chem-Biol Inter-act,1997,103(1):35-50

4 王青秀.大黃及其主要成分的毒性毒理研究[D].北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2007：51-65

5 張敏.何首烏對肝臟損害的物質(zhì)基礎(chǔ)及其機制研究[D].陜西:陜西中醫(yī)學(xué)院,2011:11-34

6 衛(wèi)培峰,胡錫琴,苗彥霞.制首烏不同成分誘導(dǎo)肝細胞凋亡與腫瘤壞死因子α的相關(guān)性研究[J].四川中醫(yī),2009,27(10):47-48

7 馬致潔.何首烏肝毒性客觀性、臨床標志物及損傷機制的初步研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2013:70-91

8 胡錫琴，禚君，李婭琳，等.何首烏中二苯乙烯苷對大鼠肝酶及蛋白的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(5):988-990

9 劉振麗,宋志前,張玲.不同炮制工藝對何首烏中成分含量的影響[J].中國中藥雜志,2005,30(5):336-340

10 吳婷.何首烏不同炮制品成分差異及其與肝細胞凋亡的相關(guān)性研究[D].陜西:陜西中醫(yī)學(xué)院,2012:10-30

11 胡錫琴,李婭琳,王磊.何首烏中鞣質(zhì)對大鼠肝臟生化指標的影響[J].藥物評價研究,2010,33(1):63-65

12 胡錫琴,李敏,楊紅蓮,等.何首烏中鞣質(zhì)與二苯乙烯苷不同配比對大鼠肝功能指標的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2011,45(4):56-59

13 呂旸,王伽伯,嵇揚,等.提取溶劑對何首烏肝細胞毒性的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(20):268-272

14 胡錫琴,楊曉青,刑玉瑞,等.制何首烏致肝損害的實驗研究[J].陜西中醫(yī),2006,27(5):625-626

15 胡錫琴,方歡樂,權(quán)志博,等.制何首烏對肝臟生化物質(zhì)影響的實驗研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,30(6):63-64

16 胡錫琴,楊紅蓮,張曉琴,等.制何首烏對大鼠肝臟毒理的實驗研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,29(3):40-41

17 李玥,徐立,劉若囡,等.生、制首烏醇提物對小鼠肝臟的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,17(4):452-455

18 Hansson M.Induction of apoptosis in NK cells by monocyte-derived reactive oxygen metabolites [J].Immunol,1996,156(1):42

19 Kerr J F,Wyllie A H,Currie A R.Apoptosis：a basicbiological phenomenon with wide-raging implications in tissue kinetics[J].Br Cancer,1972,26(4):239

20 肖經(jīng)緯,李斌,鐘才高.肝細胞凋亡機制及其檢測方法的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊,2006,33(2):93-96

21 胡錫琴,李婭琳,林飛.何首烏、制何首烏對大鼠免疫球蛋白影響的實驗研究[J].天津中醫(yī)藥,2009,26(2):139-141

22 胡錫琴,林飛,李婭琳,等.何首烏、制何首烏與茯苓配伍對大鼠肝微粒體細胞色素P450的影響[J].陜西中醫(yī),2009,30(2):240-241

23 王文靜，莉亞琳.生何首烏、制何首烏對大鼠肝微粒體CYP450的影響[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2014,34(2):76-79

24 葉定江，張世臣.中藥炮制學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999：358-362

25 涂燦,蔣冰倩,趙艷玲,等.何首烏炮制前后對大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標篩選[J].中國中藥雜志,2015,40(4):654-660

26 李曉菲,李娜,涂燦,等.基于內(nèi)毒素特異質(zhì)模型的生首烏與制首烏肝毒性比較研究[J].中草藥,2015,46(10):1481-1486

27 莫志敏,黃海波,陳明權(quán).中藥制首烏市售商品質(zhì)量評價研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2014,7(S1):44-45

28 龐晶瑤,王伽伯,馬致潔,等.基于化學(xué)指紋圖譜和生物毒性檢測的何首烏質(zhì)量評控[J].中草藥,2014,45(23):3392-3396

29 呂旸.基于肝細胞毒價檢測的何首烏質(zhì)量控制方法研究[D].北京:北京化工大學(xué),2013:9-56

30 李衛(wèi)先,張琦,王國仁,等.不同炮制品種制何首烏致肝損害的研究[J].光明中醫(yī),2012,27(3):595-597

31 李衛(wèi)先,張琦,王國仁,等.何首烏不同炮制品致肝損害的研究[J].湖南中醫(yī)雜志,2011,27(5):129-130

32 李衛(wèi)先,張琦,王國仁,等.不同炮制品種的何首烏致肝損害的對比研究[J].中外健康文摘,2012,9(5):396-397

33 馬致潔,李曉菲,呂旸,等.基于肝細胞毒價檢測的何首烏炮制工藝比較研究[J].中國中藥雜志,2015,40(12):2325-2329

2014-11-06

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*通訊作者：房德敏，E-mail：fangdeminwx@163.com。