張 鉑王 兵曹書華王勇強△

（1.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300060；2.天津市第一中心醫(yī)院，天津市急救醫(yī)學(xué)研究所，天津300192）

·研究報告·

Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取大黃鞣質(zhì)的工藝研究*

張 鉑1，2王 兵2曹書華2王勇強2△

（1.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300060；2.天津市第一中心醫(yī)院，天津市急救醫(yī)學(xué)研究所，天津300192）

目的采用Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化大黃鞣質(zhì)的微波提取工藝。方法在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取超聲功率、超聲時間和料液比3個因素進行Box-Benhnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計，對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果由響應(yīng)面預(yù)測模型得出的最優(yōu)提取條件為：超聲功率為480 W，超聲時間為25 min，料液比為1∶17.8（w/v），經(jīng)驗證此條件下平均提取率為（12.72±0.25）%（n=3），與理論值較為接近。結(jié)論采用Box-Benhnken響應(yīng)面法建立的大黃鞣質(zhì)微波提取工藝模型提取率高，并能很好地預(yù)測試驗結(jié)果。

大黃鞣質(zhì) 超聲輔助提取工藝 Box-Benhnken響應(yīng)面法

大黃為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、利濕退黃、逐瘀通經(jīng)等功效。大黃含有多種有效成分，其中鞣質(zhì)含量多達30%［1-2］。近年來研究表明大黃鞣質(zhì)具有多種藥理作用：抑制生物體內(nèi)過剩的自由基，降低血清尿素氮等；另外，鞣質(zhì)還具有收斂作用，內(nèi)服可用于治療胃腸道出血、潰瘍等癥，外用于創(chuàng)傷、灼傷等［3-5］，是大黃治療作用的重要活性成分。鞣質(zhì)作為水提取物中的主要成分，潛在的藥理活性值得探究。本研究選用熱水回流法提取大黃鞣質(zhì)，并對其制備工藝進行優(yōu)化，為大黃鞣質(zhì)的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

KQ3200型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；TU-1800紫外-可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AB-135S電子天平（梅特勒國際股份有限公司）；HH-S恒溫水浴鍋 （江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；TDL-5-A高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科儀器有限公司）；ALPHA2-4冷凍干燥機 （德國Marin Christ公司）。

1.2 試劑

大黃（唐古特大黃）購自青海省果洛地區(qū)，經(jīng)鑒定為Rheum palmatum L.的干燥根；鞣酸（E.Merchk，分析純）；磷鉬鎢酸試液（生化試劑，南京森貝伽生物科技有限公司）；干酪素（生化試劑，上海萬疆生物技術(shù)有限公司）；碳酸鈉（天津天力化學(xué)試劑有限公司）；所有用水均為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.3 提取方法

大黃→洗凈→60℃烘干→粉碎機粉碎 （過80目篩）→超聲波輔助提取→抽濾→濾液定容→除雜→離心→冷凍干燥→測定大黃鞣質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取10.0 g已粉碎大黃粉末，分別在不同的超聲功率、超聲時間和液料比的條件下提取。過濾后冷凍干燥，得粗大黃鞣質(zhì)。

1.4 線性關(guān)系考察

精密稱取恒重（80℃干燥2 h）的鞣酸20.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入30%甲醇水溶液溶解，定容、搖勻，即得鞣酸對照品溶液Ⅰ（400 μg/mL）。精密移取鞣酸對照品溶液Ⅰ0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL分別置于20 mL棕色容量瓶中，依次加入30%甲醇水溶液9.5、9.0、8.0、6.0、2.0 mL，然后加0.1 mol/L HAc-NaAc（pH5.0）緩沖液至刻度，搖勻，即得對照品溶液Ⅱ，分別精密移取對照品溶液Ⅱ1.0 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，依次加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL，再加入29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。以相應(yīng)的試劑為空白，采用分光光度法，在760 nm的波長處測定光密度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=125.29X+0.0216，R= 0.9994。結(jié)果表明：鞣質(zhì)在1.0～16.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.5 大黃鞣質(zhì)含量測定［6］

按照“1.3”項下方法提取大黃鞣質(zhì)，精密稱取恒重粗大黃鞣質(zhì)50 mg置于20 mL棕色容量瓶中加入30%甲醇水溶液5 mL溶解，加入0.1 mol/L HAc-NaAc（pH5.0）緩沖液10 mL，再加入29%碳酸鈉溶液稀釋至20 mL，混勻，得溶液Ⅲ。精密移取溶液Ⅲ10 mL，置于含干酪素600 mg的棕色容量瓶中，在電磁攪拌器上攪拌1 h，過濾，搖勻，即得溶液Ⅳ。分別移取溶液Ⅲ和Ⅳ各1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，各加入加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL，再用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。于室溫放置15 min后，用1 cm比色皿，以蒸餾水作空白對照，在波長760 nm處分別測定吸光度，A1和A2。由兩吸光度之差（ΔA）代入回歸方程，計算鞣質(zhì)含量。大黃鞣質(zhì)提取率（%）=［大黃鞣質(zhì)含量（g）/原料重量（g）］×100%。

1.6 單因素實驗

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，超聲提取次數(shù)對大黃鞣質(zhì)提取率沒有影響，因此確定提取次數(shù)為1次。影響大黃鞣質(zhì)提取率的主要因素有超聲功率、超聲時間和液料比和。本研究的超聲功率為300、400、500、600、700 W 5個水平，超聲時間選取10、20、30、40、50 min 5個水平，料液比選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（W/V）5種比例，分別進行單因素實驗考察。

1.7 響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計

本研究根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，選取超聲功率（X1，w）、超聲時間（X2，min）和料液比（X2，W/V）3個影響因素，以大黃鞣質(zhì)提取率（Y，%）為響應(yīng)值。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定超聲功率為400、500、600 W，超聲時間為20、30、40 min，料液比選取1∶10、1∶15、1∶20（w/v），將每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以+1、0、-1進行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達為：

其中Y為響應(yīng)值（大黃鞣質(zhì)提取率），A0、Ai、Aii、Aij為方程系數(shù)，Xi、Xj（I≠j）為自變量編碼值。多項式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達，其統(tǒng)計學(xué)上的顯著性由F值檢驗。試驗因素與水平設(shè)計見表1，分別進行響應(yīng)面實驗。通過Design Expert 7.0軟件對提取工藝進行響應(yīng)面分析，求出數(shù)學(xué)模型，得到最佳工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié) 果

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率對大黃鞣質(zhì)提取率的影響 結(jié)果表明，隨著超聲功率的增加，大黃鞣質(zhì)提取率有所增加，增加到500 W后平均提取率為12.23%，再提高超聲功率，大黃鞣質(zhì)提取率并未增加。為減少能耗，確定提取功率為500 W較為合適。見圖1。

圖1 超聲功率對大黃鞣質(zhì)提取率的影響

2.1.2 超聲時間對大黃鞣質(zhì)提取率的影響 結(jié)果表明，大黃鞣質(zhì)提取率隨超聲時間的增加而升高，超聲30 min時大黃鞣質(zhì)提取率接近最大值，隨后隨時間的延長，提取率出現(xiàn)微弱降低趨勢。提取時間的延長會增加不必要的能耗，導(dǎo)致資源的浪費，因此大黃鞣質(zhì)提取的最佳超聲時間為30 min。見圖2。

圖2 超聲時間對大黃鞣質(zhì)提取率的影響

2.1.3 料液比對大黃鞣質(zhì)提取率的影響 實驗結(jié)果表明，大黃鞣質(zhì)提取率隨料液比的增加而升高，這是因為水溶液的增加可以加大溶劑分子的驅(qū)動力。當(dāng)料液比為1∶15（W/V）后大黃鞣質(zhì)提取率接近最大值，隨后增加幅度減小。為減少能耗，確定大黃鞣質(zhì)提取的料液比為1∶15（W/V）。見圖3。

圖3 料液比對大黃鞣質(zhì)提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)曲面優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，以超聲功率（X1，W）、超聲時間（X2，min）和料液比（X3，W/V）為自變量，以大黃鞣質(zhì)提取率（Y，%）為響應(yīng)值，試驗方案及試驗結(jié)果見表2，試驗重復(fù)3次，用以估計試驗誤差。

利用Design-Expert 7.0軟件對大黃鞣質(zhì)的提取率試驗數(shù)據(jù)進行多元擬合，表3為回歸分析結(jié)果。從表3的分析結(jié)果可知，整體模型的p-Value＜0.05，表明該二次方程模型比較顯著，模型的失擬項的P值為0.5217，大于0.05，說明模型選擇合適，該模型的R2= 0.9954，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于大黃鞣質(zhì)提取試驗的理論預(yù)測?；貧w方程的各項方差分析結(jié)果還表明模型的一次項超聲功率，超聲時間和料液比都是極顯著的（P＜0.01），按照提取率的影響從大到小排序為：超聲功率＞料液比＞超聲時間；交叉項中的影響都是高度顯著的（P＜0.05）。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計表與效應(yīng)值

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗

圖4、圖5、圖6分別顯示了不同交叉因素對大黃鞣質(zhì)提取率的交互影響趨勢圖。等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度：圓形表示兩因素交互作用不明顯，而曲率半徑較大的橢圓則表示兩因素交互作用顯著，并且曲率半徑越大，交互作用越顯著，即橢圓越扁平，交互作用越顯著。在等高線圖上，最大的橢圓即最外圍的橢圓代表在該圓上取值時，提取率最低，而最小的橢圓則表示在其上面取值時，提取率最高，它們之間的等高線代表提取率逐漸變化。

圖4 超聲功率與超聲時間對大黃鞣質(zhì)提取率影響的等高線圖（A）和響應(yīng)面圖（B）

圖5 超聲功率與料液比對大黃鞣質(zhì)提取率影響的等高線圖（A）和響應(yīng)面圖（B）

圖6 超聲時間和料液比對大黃鞣質(zhì)提取率影響的等高線圖（A）和響應(yīng)面圖（B）

圖4為料液比為1∶15（W/V）時，超聲功率和超聲時間對大黃鞣質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面三維圖。由圖可知，超聲功率和超聲時間存在顯著性交互，固定料液比時，隨著超聲功率和超聲時間的增加，大黃鞣質(zhì)的提取率先增加后降低。圖5和圖6結(jié)果與圖4類似。

2.2.2 優(yōu)化提取工藝參數(shù)及驗證 經(jīng)過以上對回歸模型響應(yīng)面的三維立體圖分析，以大黃鞣質(zhì)提取率最大值為目標(biāo)，由響應(yīng)面預(yù)測模型得出的最優(yōu)提取條件為：超聲功率480 W，超聲時間25 min，料液比1∶17.8（W/ V）。按照“1.3”項下以優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取3批大黃鞣質(zhì)，并按照“1.5”項下測定大黃鞣質(zhì)含量，平均提取率為（12.72±0.25）%（n=3），實驗觀測值與模型預(yù)測值偏差為2.58%，可知，實驗觀察值和模型預(yù)測值比較接近，說明模型預(yù)測性良好。

3 討 論

筆者在單因素實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化大黃鞣質(zhì)的提取工藝。實驗結(jié)果表明：超聲功率、超聲時間和料液比對大黃鞣質(zhì)提取率的影響極顯著；超聲功率和超聲時間、超聲功率和料液比、超聲時間和料液比之間的交互作用對大黃鞣質(zhì)提取率的影響極顯著，說明超聲功率、超聲時間和料液比對大黃鞣質(zhì)的提取率影響不是簡單的線性關(guān)系，而是存在交互作用。

鞣質(zhì)為多元酚類化合物，高溫條件下會加速鞣質(zhì)降解［7］，所以本研究在優(yōu)化工藝過程中嚴(yán)格控制溫度。實驗表明提取大黃鞣質(zhì)過程中溫度控制在50℃以下不會對鞣質(zhì)穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。本試驗為了較全面地考察鞣質(zhì)的提取工藝，同時考察了超聲功率、超聲時間和料液比多個因素對大黃鞣質(zhì)提取效果的影響。通過Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計實驗，優(yōu)化得到大黃鞣質(zhì)最優(yōu)提取工藝，經(jīng)驗證穩(wěn)定可行，該工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)，為大黃中鞣質(zhì)的提取提供了依據(jù)。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technique of Tannins from Rhubarb by Box-Benhnken Response Surface Methodology

ZHANG Bo，WANG Bing，CAO Shuhua，et al. Tianjin Huanhu Hospital ICU，Tianjin 300060，China

Objective：To optimize the tannins from rhubarb ultrasonic-assisted extraction technique using Box-Benhnken response surface methodology.Methods：On the basis of single-factor experiments，the effects of ultrasonic power，ultrasonic time and solid to liquid ratio on the extraction yield of tannins from rhubarb was investigated with a three-factor Box-Benhnken design.Results：By the response surface model to obtain the optimal extraction.Conditions：ultrasonic power was 480 w，ultrasonic time was 25 min，solid to liquid ratio was 1∶17.8（w/v）.The validated experiment showed the yield of tannins from rhubarb was（12.72±0.25）%（n=3）under those conditions，Which was in consistency with the theoretic value.ConclusionUltrasonic-assisted model of tannins from rhubarb established by Box-Benhnken design could precisely predict the experiment results well.

rhubarb tannins；ultrasonic-assisted extraction technique；Box-Benhnken response surface methodology

R289.5

A

1004-745X（2015）04-0579-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.005

2015-01-22）

衛(wèi)生部臨床重點專科建設(shè)項目［衛(wèi)辦醫(yī)政函（2011）873號］

△通信作者（電子郵箱：zhangbdr＠126.com）