許秀洪，洪金妮(綜述)，周國(guó)平(審校)

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸推拿科，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515)

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醫(yī)學(xué)影像學(xué)

激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)在腦卒中針刺機(jī)制中的應(yīng)用進(jìn)展

許秀洪1△，洪金妮2(綜述)，周國(guó)平1※(審校)

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸推拿科，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515)

摘要：激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)作為一種非侵入性圖像分析儀器，有標(biāo)本制備簡(jiǎn)單、分辨率高、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像等特點(diǎn)，可清晰地對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行無(wú)損傷性動(dòng)態(tài)觀察、空間定位、定量檢測(cè)等。針刺療法治療腦卒中具有良好的臨床療效，其機(jī)制研究也越來(lái)越受到重視。CLSM作為新一代的研究工具，也廣泛應(yīng)用于針刺機(jī)制的基礎(chǔ)研究中，該文就CLSM技術(shù)在腦卒中針刺機(jī)制研究中的應(yīng)用情況予以綜述。

關(guān)鍵詞:腦卒中；激光共聚焦掃描顯微鏡；針刺

激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)是20世紀(jì)末推出的高精度醫(yī)學(xué)圖像分析儀器，CLSM是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上，集普通光學(xué)顯微鏡、激光、電子、計(jì)算機(jī)技術(shù)和圖像處理技術(shù)于一體的現(xiàn)代高科技產(chǎn)品，與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡分辨率高，在實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒庥^察的同時(shí)形成清晰的三維圖像，在生命科學(xué)中被譽(yù)為“細(xì)胞CT”。祖國(guó)醫(yī)學(xué)的針刺治療，在腦卒中的治療中具有良好的臨床療效，運(yùn)用各種現(xiàn)代先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)，研究針刺治療腦卒中機(jī)制，已成為針刺機(jī)制研究的重要途徑，CLSM就是采用的先進(jìn)設(shè)備之一?，F(xiàn)就近年來(lái)CLSM技術(shù)在針刺治療腦卒中研究中的應(yīng)用情況予以綜述。

1CLSM的基本原理和應(yīng)用

1.1CLSM的基本原理CLSM以激光作為光源，激光通過(guò)針孔聚焦到達(dá)樣本的某深度，形成一個(gè)點(diǎn)光源，點(diǎn)光源對(duì)樣本內(nèi)聚焦平面上的每一個(gè)點(diǎn)進(jìn)行掃描，樣本上的被照射點(diǎn)在檢測(cè)針孔上達(dá)到成像平面，由倍增管在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。光源針孔與檢測(cè)針孔的位置相對(duì)于焦平面是共軛的，聚焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于光源針孔和檢測(cè)針孔，聚焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在檢測(cè)針孔中成像，這樣得到的共聚焦圖像是樣本的光學(xué)橫斷面，得到的是高清晰度、高分辨率的圖像，同時(shí)激光可以調(diào)節(jié)聚焦的深度，可進(jìn)行X、Y、Z三軸的掃描，將這些軸上形成的圖像經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析重建后，可獲得該樣本任意平面的圖像或者三維立體圖[1]。

1.2CLSM在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用CLSM在各種免疫熒光探針、染料的輔助下，與被檢測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合后可觀察到固定的生物細(xì)胞組織切片，活體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子的動(dòng)態(tài)變化。在生命科學(xué)領(lǐng)域的中常應(yīng)用于：①細(xì)胞組織內(nèi)生物大分子的原位鑒定，細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，如在細(xì)胞原位檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)、抗體及其他分子；檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器、細(xì)胞融合、細(xì)胞骨架、細(xì)胞間縫隙連接通訊等。②活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，如實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+、pH、活性氧物種的產(chǎn)生及膜電位的變化等[2-4]。

2CLSM在針刺治療腦卒中研究中的應(yīng)用

2.1組織、細(xì)胞與亞細(xì)胞的觀察CLSM不僅簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)光鏡的研究程序，同時(shí)可精確聚焦到較厚的切片甚至是組織的深部，莊明華等[5]和白曄等[6]運(yùn)用CLSM觀察在正常狀態(tài)下活體家兔大腦皮質(zhì)內(nèi)血管內(nèi)的軸流、緣流厚度和血管口徑的變化，隨后作針刺處理，再進(jìn)行生理狀態(tài)下和針刺后的對(duì)比，結(jié)果表明電針刺激能引起家兔動(dòng)脈的舒縮運(yùn)動(dòng)，其舒縮運(yùn)動(dòng)的結(jié)果隨著血管口徑大小的不同而有所差別，證明針刺可改變大腦循環(huán)血流量，通過(guò)微循環(huán)的改善進(jìn)而增加缺血腦組織能量供應(yīng)，改善缺血后組織細(xì)胞的代謝，減輕腦組織細(xì)胞的損傷。張金鈴等[7]采用D-273內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光分子探針，通過(guò)CLSM動(dòng)態(tài)掃描觀察，對(duì)比加入正常大鼠血清和電針2周后大鼠的血清，發(fā)現(xiàn)針刺2周后的血清能抑制神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性的下調(diào)。

楊福霞[8]運(yùn)用攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄病毒pLXSN，利用CLSM觀察大鼠缺血部位側(cè)腦室下區(qū)EGFP細(xì)胞和EGFP/巢蛋白雙標(biāo)細(xì)胞的表達(dá)、缺血處海馬齒狀回EGFP陽(yáng)性細(xì)胞和EGFP/神經(jīng)特異性烯醇化酶雙標(biāo)細(xì)胞的表達(dá)。觀察并計(jì)算其實(shí)驗(yàn)結(jié)果后表明針刺任脈能促進(jìn)缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分化與增殖。刁利紅等[9]在電針刺激任脈和肌內(nèi)注射堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的實(shí)驗(yàn)中，利用CLSM觀測(cè)局灶性缺血模型大鼠原位神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況，也得出針刺可促進(jìn)大鼠腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

于海波等[10]利用CLSM觀察電針任脈腧穴對(duì)于局灶性腦缺血大鼠損傷側(cè)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸是否有正向影響的實(shí)驗(yàn)中，觀察大鼠損傷側(cè)海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性細(xì)胞以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白/神經(jīng)元特異性烯醇化酶雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量后得出：電針刺激任脈可調(diào)節(jié)缺血后大鼠海馬增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞，抑制其過(guò)度增殖，促進(jìn)它的多潛能化，有利于腦缺血后的神經(jīng)修復(fù)，這一結(jié)果與Lin和Matesic[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。羅燕等[12]運(yùn)用CLSM觀察大鼠皮質(zhì)缺血灶周圍區(qū)不同時(shí)間段星形膠質(zhì)細(xì)胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫活性反應(yīng)的變化發(fā)現(xiàn)，電針可減輕缺血引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)性損傷,下調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白的過(guò)度表達(dá)，推斷電針改善腦缺血的作用可能與其干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)有關(guān)。

2.2Ca2+水平的測(cè)定Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，是細(xì)胞接受外界刺激或生物活性物質(zhì)作用后引起生物學(xué)反應(yīng)的重要橋梁，有學(xué)者利用CLSM技術(shù)和活體腦片負(fù)載技術(shù),研究局灶性腦缺血和缺血/再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)Ca2+變化及針刺調(diào)節(jié)Ca2+的變化，發(fā)現(xiàn)急性局灶性腦缺血和缺血/再灌注后大鼠海馬錐體細(xì)胞Ca2+隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)，在再灌注6 h后胞內(nèi)Ca2+達(dá)到高峰，此后有下降趨勢(shì)，但仍高于缺血前水平，驗(yàn)證了臨床上腦缺血在6 h的有效時(shí)間窗內(nèi)采取多方面多水平的干預(yù)措施，對(duì)腦損傷的歸轉(zhuǎn)至關(guān)重要。也證實(shí)了針刺降低缺血區(qū)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞內(nèi)Ca2+,抑制了鈣超載，從而保護(hù)腦缺血后神經(jīng)元的損傷[13-16]。杜亦旭[17]通過(guò)CLSM觀察發(fā)現(xiàn)電針刺激可降低缺血后皮質(zhì)和紋狀體細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，抑制缺血引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣超載，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間的信息傳遞，使其逐步恢復(fù)協(xié)調(diào)，從而有助于減輕腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)元的損傷。

張金鈴等[18]從血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)角度，取海馬細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)后應(yīng)用鈣熒光分子探針Fluo-3 AM染色，運(yùn)用CLSM動(dòng)態(tài)掃描，觀察加入正常大鼠血清和電針2周后的血清對(duì)海馬細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響。結(jié)果表明，加入針刺血清可降低升高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。黃長(zhǎng)軍等[19]采用CLSM和分子探針技術(shù)，對(duì)針刺通過(guò)顱腦損傷大鼠血清影響SY5Y細(xì)胞Ca2+進(jìn)行研究。同樣得出電針可減慢腦損傷大鼠腦組織Ca2+水平的上升趨勢(shì)、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+滯留和超載的結(jié)論。

2.3信號(hào)通路的研究陳小娛[20]用CLSM對(duì)免疫熒光雙標(biāo)的缺血腦片進(jìn)行雙通道斷層掃描,觀察腦缺血/再灌注24 h后大鼠大腦皮質(zhì)胱天蛋白酶3(caspase-3)陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。雙通道掃描圖像重疊后顯示，caspase-3主要在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，在細(xì)胞核有少量的表達(dá)，電針組中caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度較腦缺血/再灌注組中的明顯下降,較對(duì)照組中的平均熒光強(qiáng)度強(qiáng)，提示針刺治療可有效下調(diào)caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。羅文舒等[21]通過(guò)CLSM觀察針刺督脈經(jīng)穴對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織核因子κB 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明針刺督脈經(jīng)穴抑制腦缺血/再灌注大鼠急性期核因子κB的過(guò)度表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，減少炎癥反應(yīng)，改善腦缺血/再灌注損傷。孫寧[22]應(yīng)用整體腦缺血/再灌注模型，對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸受體和酪氨酸激酶受體在針刺治療腦缺血/再灌注損傷中的作用以及兩者之間的相互關(guān)系進(jìn)行探討。電針治療后應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，CLSM下觀察電針治療對(duì)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)酪氨酸激酶表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注損傷后，電針治療可以上調(diào)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)酪氨酸激酶受體的表達(dá)，同時(shí)，也可抑制缺血損傷誘導(dǎo)的N-甲基-D-天冬氨酸受體亞單位NR1的異常表達(dá)，電針的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)可能通過(guò)酪氨酸激酶-磷脂酰肌醇3-激酶通路介導(dǎo)，通過(guò)該信號(hào)通路增強(qiáng)負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子NRSF與N-甲基-D-天冬氨酸受體NR1亞單位基因的結(jié)合能力，從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制NR1的表達(dá)。劉榮[23]對(duì)JAKs激酶在電針抗缺血性腦損傷中作用的研究，采用免疫熒光染色法結(jié)合CLSM，觀察電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠缺血灶周圍區(qū)不同時(shí)間段缺血側(cè)皮質(zhì)JAKs激酶及其轉(zhuǎn)錄激活因子的影響，表明電針治療的介入能顯著提高腦缺血早期缺血側(cè)皮質(zhì)JAK1的活性,激發(fā)機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制，減輕腦缺血損傷，且能促使這種保護(hù)性的效應(yīng)維持一段較長(zhǎng)的時(shí)間,參與受損組織的修復(fù)。

3小結(jié)

CLSM的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞生物學(xué)更深層次的研究，作為一項(xiàng)強(qiáng)有力的研究工具與技術(shù)，能更精準(zhǔn)地從腦組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)、離子濃度變化、信號(hào)因子等方面來(lái)研究針刺抗腦卒中發(fā)展的可能性機(jī)制。針刺抗腦細(xì)胞凋亡方面的研究是近來(lái)研究的熱點(diǎn)，其機(jī)制是一個(gè)龐大而復(fù)雜的網(wǎng)狀關(guān)系[24-25]。隨著CLSM技術(shù)的應(yīng)用，針刺機(jī)制的研究也深入到信號(hào)通路方面，雖然大多只是對(duì)某一信號(hào)因子的研究，但也提示要利用好CLSM的優(yōu)勢(shì),從信號(hào)因子或信號(hào)通路方面來(lái)探究針刺機(jī)制，且重視彼此間的相互關(guān)系，在整體中研究與分析各種信號(hào)傳遞的相關(guān)性，為針刺治療腦卒中提供理論基礎(chǔ)。

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The Advances of Applications of Confocal Laser Scanning Microscope in Studying the Therapeutic Mechanism of Apoplexy with Acupuncture

XUXiu-hong1,HONGJin-ni2,ZHOUGuo-ping1.

(1.AcupunctureandMassageDepartment,TCM-IntegratedHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2.TheschoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:Confocal laser scanning microscope(CLSM)is a new,non-invasive image analyzer,characterized with real-time high resolution imaging and simple specimen preparation,it is a new research tool in the study of morphology,molecular biology,neuroscience and so on.Acupuncture therapy is effective for the treatment of Apoplexy and more and more attention is focused on the research of its mechanism.CLSM is widely applied in the study of therapeutic mechanism of cerebrovascular disease(CVD) treated with acupuncture.Here is to make a review of the advances of applications of CLSM in studying the therapeutic mechanisms of CVD treated with acupuncture.

Key words:Cerebrovascular disease； Confocal laser scanning microscopy; Acupuncture

收稿日期：2014-05-04修回日期：2014-08-15編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173355)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.08.037

中圖分類號(hào)：R332; R331

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)08-1441-03