萬(wàn)寧 張建勇 唐鳳鳴 李永春 張健 陳德

（1.宜賓市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 宜賓 644000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，貴州 遵義 563000）

氣道粘液高分泌是慢性氣道疾病的重要特征，氣道粘液高分泌的確切發(fā)生機(jī)制及其調(diào)控目前尚不十分清楚。氣道粘液高分泌的分子基礎(chǔ)是氣道主要粘蛋白（Muc）5AC的產(chǎn)生和分泌增加［1］，而細(xì)菌感染是慢性氣道疾病發(fā)生發(fā)展或反復(fù)加重的重要因素，其中G－菌是其最主要的致病菌之一，而脂多糖（LPS）則是G－菌感染的主要致病因子。本實(shí)驗(yàn)探討Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)菌LPS誘導(dǎo)大鼠慢性支氣管炎氣道粘蛋白表達(dá)中的作用，將有助于闡明G－菌感染引起氣道粘液高分泌發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)慢性氣道疾病氣道粘液高分泌的防治可能有重要意義，并可能為氣道粘液高分泌的藥物干預(yù)治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 慢性支氣管炎模型建立與分組 SPF 級(jí)6～8周齡雄性Wistar大鼠40只（購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重220～240g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NS組）、慢性支氣管炎組（LPS組）、多粘菌素B（PMB）干預(yù)組（LPS＋PMB 組）和多粘菌素B自身對(duì)照組（PMB組）各10只。參考Nie YC 等［2］方法并作改進(jìn)，建立大鼠慢性支氣管炎模型：第1 天氣管內(nèi)注入脂多糖（LPS）200μg／200μl（E.coli 055：B5，美國(guó)Sigma 公司）后，每天在自制玻璃箱（50cm×50cm×40cm）內(nèi)霧化吸入（德國(guó)百瑞壓縮吸入器，型號(hào)：085G1005）LPS溶液（50μg／ml）1小時(shí)，連續(xù)3周。NS組用NS代替LPS；LPS＋P MB 組除建立大鼠慢性支氣管炎模型外，于每日霧化吸入前1小時(shí)給予腹腔注射PMB（美國(guó)Amresco）1mg／kg干預(yù)；PMB 組除同NS組外，于每日霧化吸入前1小時(shí)給予腹腔注射PMB 1mg／kg。

1.2 肺組織標(biāo)本和支氣管肺泡灌洗液制備 大鼠持續(xù)霧化吸入3 周后處死，取右上、中葉肺組織迅速放入－80℃冰箱保存，以備RNA 提取。取右下葉肺組織放入4%多聚甲醛中固定。左肺行支氣管肺泡灌洗［3］獲得支氣管肺泡灌洗液（BALF）做細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類(lèi)和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）測(cè)定。

1.3 ELISA 測(cè) 定BALF 細(xì)胞因子TNF－α 采 用ELISA 雙抗體夾心法，按試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）說(shuō)明書(shū)檢測(cè)BALF中TNF－α含量，酶標(biāo)儀（ELX800，美國(guó)）在492nm 處測(cè)吸光度。所有光密度（OD）值都減除空白值后再行計(jì)算，以標(biāo)準(zhǔn)品之OD 值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品OD 值在該曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的含量。

1.4 AB－PAS染色 肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，做阿先藍(lán)－過(guò)碘酸雪夫（AB－PAS）染色，進(jìn)行圖片采集和相對(duì)著色面積的定量分析。

1.5 免疫組化法檢測(cè)氣道Muc5AC 和肺組織TLR4的表達(dá) 均采用二步法，Muc5AC 一抗為小鼠抗Muc5AC單克隆抗體（SANTA 公司），鼠抗－Muc5AC抗體二步法試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。TLR4一抗為羊抗大鼠TLR4多克隆抗體（美國(guó)Santa Crue公司），羊抗－TLR4抗體二步法試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，以積分光密度（IOD）為指標(biāo)進(jìn)行定量分析。

1.6 熒光定量RT－PCR 檢測(cè)肺組 織Muc5AC 和TLR4 mRNA 表達(dá) 采用RNAiso Reagent 試劑（TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)提取各組大鼠肺組織總RNA，取0.5μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，DRR037S），按試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。Muc5AC、TLR4及內(nèi)參照β－actin 的引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，其序列見(jiàn)表1。按PCR 反應(yīng)試劑盒（TaKaRa 公 司，DRR041S）說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行PCR 反 應(yīng)（ICycler iQ 熒光定量PCR 儀，美國(guó)BIO－RAD 公司），反應(yīng)條件為：95℃10s，95℃5s，62℃20s，共40個(gè)循環(huán)。每一例樣本反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出定量結(jié)果Ct值（threshold cycle）。

表1 Muc5AC、TLR4、β－actin引物序列Table 1 Primer sequence of Muc5AC，TLR4，β－actin

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 熒光定量RT－PCR 獲取的Ct值采用2－△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 NS組和PMB 組大鼠支氣管管壁及其周?chē)M織結(jié)構(gòu)完整而清晰，未見(jiàn)或偶見(jiàn)很少量炎性細(xì)胞。LPS組見(jiàn)支氣管上皮細(xì)胞損傷脫落，杯狀細(xì)胞明顯增多，支氣管壁及其周?chē)M織和肺泡以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯處可見(jiàn)管壁平滑肌束斷裂，排列紊亂，管腔狹窄。與LPS 組比較，LPS＋PMB 組大鼠上述病變明顯減輕。

2.2 BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類(lèi) NS組和PMB組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類(lèi)差異無(wú)顯著性（P＞0.05），主要以巨噬細(xì)胞為主；LPS組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均較NS組明顯增多，差異有顯著性（均P＜0.01）；LPS＋PMB組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與LPS組比較明顯減少（均P＜0.01），而較NS組有所增加。

2.3 BALF 細(xì)胞因子TNF－α 水平測(cè)定 NS 組 和PMB組BALF 中TNF－α 水平差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；LPS組、LPS＋PMB 組BALF 中TNF－α水平較NS組明顯增高，差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB組增高值較LPS 組低，差異亦有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠BALF中TNF－α的變化（）Table 2 The levels of TNF－αin BALF

表2 各組大鼠BALF中TNF－α的變化（）Table 2 The levels of TNF－αin BALF

注：與NS組比較，①P＜0.01；與LPS組比較，②P＜0.01

2.4 氣道AB－PAS染色 NS組和PMB組氣道粘液物質(zhì)染色差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；LPS 組、LPS＋PMB組氣道粘液物質(zhì)相對(duì)著色面積較NS組明顯增高，差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB組增高值較LPS組低，差異亦有顯著性（P＜0.01）。

2.5 氣道Muc5AC和肺組織TLR4表達(dá)水平測(cè)定Muc5AC表達(dá)于支氣管管腔內(nèi)，其余肺組織未見(jiàn)表達(dá)。NS組和PMB組Muc5AC表達(dá)低，且二者間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；LPS 組可見(jiàn)大量Muc5AC 表達(dá)，其IOD 值明顯高于NS 組，差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB組Muc5AC表達(dá)量較LPS組明顯減低，但仍高于NS 組，差異亦有顯著性（均P ＜0.01），見(jiàn)表3、圖1～4。TLR4主要表達(dá)于支氣管上皮、肺泡、血管壁等，均為膜表達(dá)。TLR4在NS組和PMB組表達(dá)均低，差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；LPS組可見(jiàn)大量TLR4表達(dá)，其IOD 值明顯高于NS組，組間差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB 組表達(dá)量較LPS組明顯減低（P＜0.01），但仍高于NS 組（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖5～8。

表3 各組大鼠氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達(dá)（）Table 3 The expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

表3 各組大鼠氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達(dá)（）Table 3 The expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

注：與NS組比較，①P＜0.01；與LPS組比較，②P＜0.01

2.6 肺組織Muc5AC 和TLR4 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 NS 組和PMB 組大鼠氣道粘蛋白Muc5AC mRNA表達(dá)量低，且二者間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；LPS組較NS 組表達(dá)明顯增高，差異有顯著性（P＜0.05），LPS＋PMB 組表達(dá)量亦增高，但低于LPS 組（P＜0.05）。TLR4mRNA 在NS 組 和PMB 組大鼠肺組織表達(dá)量低，但二者間差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；LPS組較NS組明顯增高，差異有顯著性（P＜0.05）；LPS＋PMB 組表達(dá)量亦增高，但低于LPS 組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 大鼠肺組織Muc5AC和TLR4mRNA表達(dá)（）Table 4 The mRNA expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

表4 大鼠肺組織Muc5AC和TLR4mRNA表達(dá)（）Table 4 The mRNA expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

注：與NS組比較，①P＜0.05；與LPS組比較，②P＜0.05

圖1 NS組氣道Muc5AC表達(dá)（IHC×200）Figure 1 The expression of Muc5AC in NS group

圖2 LPS組氣道Muc5AC表達(dá)（IHC×200）Figure 2 The expression of Muc5AC in LPS group

圖3 LPS＋PMB組氣道Muc5AC表達(dá)（IHC×200）Figure 3 The expression of Muc5AC in LPS＋PMB group

圖4 PMB組氣道Muc5AC表達(dá)（IHC×200）Figure 4 The expression of Muc5AC in PMB group

圖5 NS組肺TLR4表達(dá)（IHC×400）Figure 5 The expression of TLR4in NS group

圖6 LPS組肺TLR4表達(dá)（IHC×400）Figure 6 The expression of TLR4in LPS group

圖7 LPS＋PMB組肺TLR4表達(dá)（IHC×400）Figure 7 The expression of TLR4in LPS＋PMB group

圖8 PMB組肺TLR4表達(dá)（IHC×400）Figure 8 The expression of TLR4in PMB group

3 討論

目前認(rèn)為氣道粘液高分泌已成為影響慢性氣道疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘及囊性纖維化等病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4］。粘蛋白是氣道粘液的最主要成分。以往的研究顯示，病理情況下氣道Muc以Muc5AC占優(yōu)勢(shì)，故氣道上皮Muc5AC 的含量和Muc5AC的轉(zhuǎn)錄水平代表氣道粘液產(chǎn)生分泌的強(qiáng)度［5］。

TLR 為一類(lèi)被某些內(nèi)源性分子和微生物保守性分子成分所激活的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），因其胞外段與果蠅蛋白Toll同源而得名，在免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的TLR 家族蛋白有10 種，分別命名為T(mén)LR1～10，TLR4是G－菌LPS的主要受體［6］。研究表明，人類(lèi)氣道上皮細(xì)胞存在TLR，其中TLR4主要分布于細(xì)胞基底膜［7］。在LPS刺激下，可使TLR 激活并通過(guò)TLRs信號(hào)通路介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)［8］。

細(xì)菌感染是氣道炎癥反應(yīng)和粘液高分泌發(fā)生發(fā)展的重要因素，G－菌是呼吸道感染最重要的致病菌，LPS是決定G－細(xì)菌致病力的關(guān)鍵毒素。在LPS刺激下，氣道上皮細(xì)胞的TLR 水平升高，Xu Y 等［9］用RT－PCR 及免疫組化證實(shí)，主要是TLR4上調(diào)。Pera T 等［10］發(fā)現(xiàn)，LPS可誘使豚鼠氣道上皮粘蛋白分泌增多和杯狀細(xì)胞化生。本研究中我們使用大腸桿菌LPS，向SPF級(jí)大鼠氣管內(nèi)一次注入LPS和持續(xù)LPS霧化吸入3周，成功建立了LPS致大鼠慢性支氣管炎和氣道粘液高分泌模型。結(jié)果顯示，LPS組病理學(xué)改變?yōu)橹夤苌掀ぜ?xì)胞損傷脫落，杯狀細(xì)胞明顯增多，支氣管壁及其周?chē)M織和肺泡有以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)管壁平滑肌束斷裂，排列紊亂，管腔狹窄。LPS組BALF 中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、TNF－α水平均較NS組明顯增多。LPS組在AB－PAS氣道粘液物質(zhì)相對(duì)著色面積和免疫組化檢測(cè)肺組織Muc5AC、TLR4 的IOD 值均較NS 組明顯增 高。LPS 組Muc5AC mRNA、TLR4mRNA 表達(dá)均較NS 組明顯增高。

PMB是一種陽(yáng)離子性環(huán)狀10縮氨酸結(jié)構(gòu)，是由多粘桿菌產(chǎn)生的一組化學(xué)上相關(guān)的脂酰基縮氨酸抗生素的總稱(chēng)。這種兩性分子試劑含有疏脂和親脂性集團(tuán)，一個(gè)多肽尾（以脂肪酸終止），與LPS的脂質(zhì)A部分具有高度的親和力，能吸附除去介質(zhì)中的LPS，并能破壞G－菌外層或細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，具有抗菌和滅活LPS的作用，使LPS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中斷。本研究結(jié)果顯示，LPS＋PMB 組病理學(xué)改變較LPS組明顯減輕，在BALF中白細(xì)胞總數(shù)及其細(xì)胞分類(lèi)、TNF－α水平均較LPS組明顯減少，但高于NS組。且其AB－PAS氣道粘液物質(zhì)相對(duì)著色面積和免疫組化檢測(cè)肺組織Muc5AC、TLR4的IOD 值均較LPS組明顯減低，但仍高于NS 組。同時(shí)LPS＋PMB 組Muc5AC mRNA、TLR4mRNA 表達(dá)量增高，但均低于LPS組，與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

通過(guò)本研究結(jié)果可以推測(cè)，TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)菌LPS作用與氣道粘蛋白Muc5AC 的產(chǎn)生及其高表達(dá)之間可能存在必然聯(lián)系。PMB通過(guò)對(duì)抗LPS，可能抑制氣道Muc5AC、TLR4蛋白及Muc5ACmRNA、TLR4mRNA 表達(dá)。

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