成姝婷 梁鑫 王正榮 李世平 劉延友 汪宇輝 江舟 肖靜 郭慧玲

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)研究室，四川 成都 610041）

在哺乳動(dòng)物中，至少有兩種不同的方式來反映局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息，一種是通過對(duì)那些在DNA 復(fù)制過程中起作用的某些組蛋白特定殘基甲基化［1，2］；另一種是通過對(duì)那些能夠復(fù)制DNA 的特定胞嘧啶殘基甲基化［3，4］。這兩種方式的印記都能夠很容易地復(fù)制給新合成的DNA 鏈，并且一代一代的傳遞下去，也就是所謂的表觀遺傳學(xué)修飾。表觀遺傳學(xué)修飾包括DNA 甲基化和組蛋白修飾，通過改變局部的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而改變?nèi)旧|(zhì)和DNA 結(jié)合蛋白之間的相互作用，如轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子與基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間的結(jié)合［5］。不同于遺傳變異，表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)不會(huì)改變其核苷酸序列。值得注意的是，人們?cè)趯?duì)表觀遺傳學(xué)修飾的最初研究里并沒有把其與時(shí)序調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起，因?yàn)橥ǔ６颊J(rèn)為這些印記高度穩(wěn)定，甚至傳代也不會(huì)改變。一直以來，研究人員對(duì)近日節(jié)律分子機(jī)制的研究通常也都是針對(duì)以轉(zhuǎn)錄／轉(zhuǎn)錄后反饋環(huán)路為基礎(chǔ)的這個(gè)復(fù)雜遺傳網(wǎng)絡(luò)［6，7］。然而，近期的研究證明，組蛋白和DNA 甲基化遠(yuǎn)比從前所想的要活躍得多。例如：超過100個(gè)DNA 甲基化位點(diǎn)為了與細(xì)胞周期同步而發(fā)生近日震蕩［8］，而細(xì)胞周期也常常受到近日生物鐘的控制［9，10］。這些研究讓研究者們開始認(rèn)識(shí)到了表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)與近日節(jié)律系統(tǒng)之間的聯(lián)系。DNA 甲基化一般是在胞嘧啶的CpG 位點(diǎn)上加上一個(gè)甲基團(tuán)。這是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育接受表觀遺傳調(diào)節(jié)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。研究表明，DNA 甲基化對(duì)于動(dòng)物胚胎發(fā)育階段的基因調(diào)節(jié)，特別是組織特異性基因，具有至關(guān)重要的作用［11］。值得注意的是，除了印記基因外，哺乳動(dòng)物基因組的表觀遺傳學(xué)修飾在早期胚胎發(fā)育階段會(huì)被消除，并在之后的整個(gè)胚胎發(fā)育階段得到重建［12～14］。目前大多數(shù)對(duì)DNA 甲基化的研究，都是關(guān)于配子生成、發(fā)育、疾病和干細(xì)胞功能的，這些研究闡明了DNA 甲基化是如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞分化的［15～18］。而關(guān)于節(jié)律基因在胚胎基因組DNA 甲基化中所起作用的研究則非常少。

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)從二細(xì)胞期到囊胚期這段時(shí)間內(nèi)小鼠受精卵中Clock 基因的表達(dá)，研究了7.5～11.5dpc之間的小鼠胚胎基因組DNA 甲基化水平的改變，以及在哺乳動(dòng)物催化發(fā)育過程中去甲基化的CpG 位點(diǎn)重新甲基化的主要甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b。本研究結(jié)果顯示，Clock 基因干擾的小鼠胚胎基因組DNA 甲基化水平比陰性對(duì)照組顯著升高，而甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b的RNA 表達(dá)水平也顯著增加了。因此，這些結(jié)果為我們提供了一個(gè)新的信息，那就是節(jié)律基因Clock 能夠通過甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b調(diào)節(jié)早期小鼠胚胎基因組DNA 的甲基化水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)ICR 雄性小鼠（6～8周）30只，雌鼠（4～6周）65只，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有雄鼠單只每籠，雌鼠5 只每籠，均單獨(dú)飼養(yǎng)于12L∶12D 光暗循環(huán)箱中，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 主要儀器 倒置生物顯微鏡TE 2000－U（日本，Nikon），CO2恒溫細(xì)胞孵箱（日本，SANYO），高效液相色譜儀（美國，VARIAN Pro Star），PCR 儀（德國，Eppendorf），電泳儀及水平電泳槽（美國，BIORAD），超凈細(xì)胞工作臺(tái)、凝膠成像儀、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、微量注射器及眼科剪、眼科鑷等均為國產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑 孕馬血清促性腺激素PMSG、注射用絨促性腺激素HCG（寧波市激素制品有限公司），Clock干擾質(zhì)粒和HK 陰性對(duì)照質(zhì)粒（武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)液、Opti－MEMI培養(yǎng)液和胎牛血清（美國，HyClone），LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、Trizol（美國，Invitrogen），基因組DNA 提取試劑盒（美國，OMEGA），核酸酶P1、堿性磷酸酶、2′－脫氧胞苷dC 和5－甲基－2′－脫氧胞苷mdC（美國，Sigma），第一鏈cDNA 合成試劑盒、Taq酶（美國，F(xiàn)ermentas），其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 獲得胚胎樣本 本實(shí)驗(yàn)為了對(duì)小鼠受精卵中Clock基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，特采用人工授精（IVF）的方法先在體外得到受精卵，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后，再將其移植回假孕雌鼠子宮中以得到所需胚齡（dpc）的小鼠胚胎。

1.2.1.1 人工授精 在進(jìn)行IVF前64小時(shí)，對(duì)每只實(shí)驗(yàn)用雌鼠腹腔注射10IU 的PMSG，48小時(shí)后再對(duì)這些雌鼠腹腔注射10IU 的HCG。頸椎脫臼法處死40只雌鼠，取出輸卵管，放進(jìn)裝有0.5ml T6 培養(yǎng)液（含20mg／ml BSA）的培養(yǎng)皿內(nèi)，撕開膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，將其轉(zhuǎn)移到mCZB 受精滴中，放入37℃的CO2孵箱中孵育得到成熟卵子。頸椎脫臼法處死20只雄鼠，摘取附睪，用眼科剪刀將每段附睪尾剪成4 段，輕輕擠壓出精液，然后將其放置在37℃的CO2孵箱中孵育30 分鐘，讓精子充分游出，然后將表面皿中的精子懸液移至1.5ml的EP 管中，繼續(xù)放置在37℃的CO2孵箱中孵育60分鐘以獲能。調(diào)整精子濃度到1×106／ml，每滴含有成熟卵子的受精滴加入10μl獲能的小鼠精子懸液，繼續(xù)放回37℃的CO2孵箱中孵育6小時(shí)，觀察并分離出受精滴中的二細(xì)胞受精卵，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 質(zhì)粒干擾 將分離出的受精卵隨機(jī)分為Clock干擾組（Clock組）和陰性對(duì)照組（HK 組）兩組，以LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑分別將Clock干擾質(zhì)粒和HK 陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到二細(xì)胞受精卵中。將兩組轉(zhuǎn)染后的受精卵放置在37℃的CO2孵箱中孵育到第5天得到囊胚期胚胎。

1.2.1.3 囊胚移植 在囊胚移植前20天，將10只雄鼠行輸精管結(jié)扎術(shù)，14天后與25只促排卵雌鼠交配獲得假孕雌鼠。將假孕5 天的受體雌鼠用水合氯醛麻醉后，剔除其后腹部的毛并用75%酒精消毒，作一個(gè)長約1cm 的切口，輕輕牽拉出兩側(cè)子宮角，用4號(hào)針頭在子宮角壁上刺一小孔，分別把12 個(gè)胚胎注入兩側(cè)子宮角，將子宮角放回腹腔后縫合肌肉、皮膚。

1.2.1.4 獲取胚胎 從7.5dpc開始，每天頸椎脫臼法處死Clock干擾組和HK 對(duì)照組的受孕雌鼠各2只，剝離其子宮內(nèi)的小鼠胚胎，冷凍于－80℃低溫冰箱，到11.5dpc結(jié)束。

1.2.2 胚胎基因組DNA 甲基化水平 本實(shí)驗(yàn)參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中檢測(cè)DNA 甲基化的標(biāo)準(zhǔn)方法，先將DNA 樣品水解成堿基，水解產(chǎn)物通過液相色譜柱，所得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，并用紫外光測(cè)定其吸收峰值及出峰面積，計(jì)算mdC／（mdC＋dC）的積分面積，從而得到基因組整體的甲基化水平。

1.2.2.1 提取DNA 使用OMEGA 基因組DNA 提取試劑盒（D3396－02E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit）提取7.5～11.5dpc胚胎的DNA。

1.2.2.2 水解DNA 將DNA 樣本濃度調(diào)節(jié)到0.5μg／μl，每個(gè)樣本吸取3μl開水浴2min 后快速冷卻，加入0.75μl ZnSO4（10mM）和1.25μl核酸酶P1，混勻后在37℃孵 育16 小 時(shí)；再加入1.25μl Tris（0.5M，pH 8.3）和0.75μl堿性磷酸酶［50U／ml溶于2.5M 的（NH4）2SO4］，37℃孵育2小時(shí)，離心后取上清。

1.2.2.3 高效液相色譜法檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用25cm的C18反相色譜柱，柱溫設(shè)定為35℃，泵A 緩沖液為甲醇，泵B緩沖液為0.05M KH2PO4（pH 4.0）；流動(dòng)相為8%甲醇＋92%0.05M KH2PO4（pH 4.0），流速為1ml／min，UV 波長為280nm，運(yùn)行時(shí)間為30min。標(biāo)準(zhǔn)品采用mdC 和dC，注入樣品為水解DNA 所得單核苷。樣本中甲基化的定量以總胞苷中mdC 的百分比來計(jì)算。

1.2.3 甲基轉(zhuǎn)移酶水平 用酚：氯仿法提取7.5～11.5dpc胚胎的RNA，使用Fermentas的第一鏈cDNA 合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列如下：Dnmt3a：5′－TCACAAGGAAGTTTACACCGAC－3′和5′－GAGGCTCCCACATGAGATACA－3′；Dnmt3b：5′－CGCTCAAGGAGTTGGGTATT－3′和5′－TCTTTGCGGGCAGGATT－3′；Gapdh：5′－TCACTGCCACCCAGAAGA－3′和5′－AAG TCG CAG GAG ACA ACC－3′。電泳PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物，用PCR 儀自帶的分析軟件讀取條帶灰度值，并以Gapdh為參照，比較這段時(shí)間內(nèi)兩種甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胚胎獲取結(jié)果 人工授精實(shí)驗(yàn)中觀察并分離出的二細(xì)胞受精卵共528枚。分別轉(zhuǎn)染Clock干擾質(zhì)粒和HK 陰性對(duì)照質(zhì)粒后，有37 枚沒有發(fā)育到囊胚；另隨機(jī)抽取10枚檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，剩余481枚受精卵移植到假孕雌鼠子宮內(nèi)。25只造模的雌鼠僅得到20只假孕受體。Clock 組和HK 組所得到的7.5～11.5dpc胚齡的小鼠胚胎數(shù)量見表1。

2.2 受精卵中Clock 基因下調(diào)對(duì)早期胚胎基因組DNA 甲基化水平的影響 我們應(yīng)用高效液相色譜法得到了Clock 組和HK 組胚胎基因組DNA 中mdC和dC堿基的出峰面積，并通過公式：計(jì)算得到基因組整體的甲基化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了7.5dpc之外，從8.5～11.5dpc 的DNA 甲基 化水平均是Clock組顯著高于HK 組（P＜0.05），見圖1。

表1 兩組小鼠取得各胚齡（dpc）胚胎數(shù)量（個(gè)）Table 1 Embryonic numbers in each dpc of the two groups

圖1 小鼠胚胎基因組DNA甲基化水平變化Figure 1 Methylation level changes of genomic DNA in mice embryos

2.3 干擾受精卵Clock基因表達(dá)對(duì)早期胚胎中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響 Clock組小鼠胚胎中甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a的表達(dá)從8.5dpc開始到11.5dpc均顯著高于HK 組（P＜0.05），而其在7.5dpc時(shí)則無顯著差異（P＞0.05），見圖2A。而甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b則從7.5～11.5dpc均是Clock組顯著高于HK 組（P＜0.05），見圖2B。

3 討論

目前已有研究證明，近日節(jié)律系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物的生殖存在千絲萬縷的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已經(jīng)證實(shí)干擾雄性小鼠圓形精子中Clock基因的表達(dá)后，可以引起雄鼠的生殖能力降低，這種影響不僅表現(xiàn)在與雄鼠交配的雌鼠胎仔數(shù)的減少、體外受精實(shí)驗(yàn)中囊胚形成率的降低，還表現(xiàn)在其子代胚胎發(fā)育過程中早期吸收胎的增多［19］。早期胚胎發(fā)育的過程包含了許多重要細(xì)胞命運(yùn)的決定，還有染色質(zhì)狀態(tài)的改變。在這段期間，多種表觀遺傳學(xué)機(jī)制的運(yùn)行改變了染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得某些基因的表達(dá)激活，而另一些基因的表達(dá)沉默［20］。通常情況下，發(fā)育中的胚胎DNA 甲基化模式在個(gè)體的整個(gè)發(fā)育階段以及之后的成年時(shí)期都會(huì)保持穩(wěn)定［11］。然而個(gè)別位點(diǎn)DNA 甲基化的改變是存在的，并且這種改變能夠影響某些在發(fā)育和病理過程中具有重要生物功能的基因表達(dá)［15，21］，如全基因組范圍或是特定基因位點(diǎn)5－甲基胞嘧啶水平的變化會(huì)增加疾病的易感性，DNA 甲基化的失調(diào)與心血管疾病、Ⅱ型糖尿病以及腫瘤有密切的關(guān)聯(lián)［21～23］。

圖2 甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b在RNA水平的表達(dá)變化Figure 2 Expression changes of methyltransferase Dnmt3aand Dnmt3bat RNA level

本實(shí)驗(yàn)通過人工授精技術(shù)在動(dòng)物體外得到了二細(xì)胞受精卵，以RNAi干擾技術(shù)下調(diào)其Clock 基因的表達(dá)，再將其培育到囊胚并移植到假孕受體雌鼠體內(nèi)。我們對(duì)收獲的7.5～11.5dpc的小鼠胚胎整體進(jìn)行基因組DNA 甲基化水平的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Clock干擾組胚胎的甲基化水平顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）。這就說明二細(xì)胞受精卵中的Clock 基因?qū)τ谛∈笈咛サ脑缙诩谆蔷哂杏绊懙?。DNA 甲基化就是一個(gè)將甲基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到哺乳動(dòng)物基因組CpG位點(diǎn)上的胞嘧啶殘基上的過程。這個(gè)過程需要一組被稱為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的酶類參與［24］。由于哺乳動(dòng)物催化發(fā)育過程中去甲基化的CpG 位點(diǎn)重新甲基化的主要甲基轉(zhuǎn)移酶是Dnmt3a 和Dnmt3b［20］，所以我們又用PCR 檢測(cè)了這些胚胎中Dnmt3a和Dnmt3b的RNA 表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種酶的變化與其DNA 甲基化水平的變化具有相似性，且也是Clock 組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。因此，我們認(rèn)為二細(xì)胞受精卵中Clock 基因可以通過調(diào)節(jié)甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b對(duì)小鼠早期胚胎基因組DNA 甲基化水平造成影響，它們之間具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用RNAi技術(shù)干擾了小鼠二細(xì)胞受精卵中Clock 基因的表達(dá)，并成功將這些處理后的受精卵移植到假孕雌鼠子宮內(nèi)，從而得到了由這些受精卵發(fā)育而來的各胚齡（7.5～11.5dpc）小鼠胚胎。對(duì)這些胚胎基因組DNA 甲基化水平和甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)結(jié)果顯示，Clock干擾組無論是基因組DNA甲基化水平還是甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a、Dnmt3b的表達(dá)量均較對(duì)照組高。由此我們認(rèn)為，受精卵中Clock 基因表達(dá)的下調(diào)可以使得甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致其早期胚胎（7.5～11.5dpc）基因組DNA 甲基化水平上升。

［1］Fischle W，Wang Y，Allis C D.Histone and chromatin crosstalk［J］.Current opinion in cell biology，2003，15（2）：172－83.

［2］Kikuchi H，Barman H K，Nakayama M，et al.Participation of histones，histone modifying enzymes and histone chaperones in vertebrate cell functions［J］.Sub－cellular biochemistry，2006，40：225－243.

［3］Klose R J，Bird AP.Genomic DNA methylation：the mark and its mediators［J］.Trends in biochemical sciences，2006，31（2）：89－97.

［4］Bird AP，Wolffe AP.Methylation－induced repression－－belts，braces，and chromatin［J］.Cell，1999，99（5）：451－454.

［5］Goldberg AD，Allis CD，Bernstein E.Epigenetics：a landscape takes shape［J］.Cell，2007，128（4）：635－638.

［6］Ko CH，Takahashi JS.Molecular components of the mammalian circadian clock［J］.Hum Mol Genet，2006，15（2）：271－277.

［7］Young MW，Kay SA.Time zones：a comparative genetics of circadian clocks［J］.Nature reviews Genetics，2001，2（9）：702－715.

［8］Brown SE，F(xiàn)raga MF，Weaver IC，et al.Variations in DNA methylation patterns during the cell cycle of HeLa cells［J］.Epigenetics ：official journal of the DNA Methylation Society，2007，2（1）：54－65.

［9］Merrow M，Roenneberg T.Cellular clocks：coupled circadian and cell division cycles［J］.Current biology：CB，2004，14（1）：25－26.

［10］Nagoshi E，Saini C，Bauer C，et al.Circadian gene expression in individual fibroblasts：cell－autonomous and self－sustained oscillators pass time to daughter cells［J］.Cell，2004，119（5）：693－705.

［11］Reik W.Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development［J］.Nature，2007，447（7143）：425－432.

［12］Howlett SK，Reik W.Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development［J］.Development，1991，113（1）：119－127.

［13］Olek A，Walter J.The pre－implantation ontogeny of the H19 methylation imprint［J］.Nature genetics，1997，17（3）：275－276.

［14］Okano M，Bell DW，Haber DA，et al.DNA methyltransferases Dnmt3aand Dnmt3bare essential for de novo methylation and mammalian development［J］.Cell，1999，99（3）：247－257.

［15］Movassagh M，Choy MK，Goddard M，et al.Differential DNA methylation correlates with differential expression of angiogenic factors in human heart failure ［J］.PloS one，2010，5（1）：e8564.

［16］Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluri－potent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131（5）：861－872.

［17］Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126（4）：663－676.

［18］Ueda Y，Okano M，Williams C，et al.Roles for Dnmt3bin mammalian development：a mouse model for the ICF syndrome［J］.Development，2006，133（6）：1183－1192.

［19］Liang X，Cheng S，JIANG X，et al.The noncircadian function of the circadian Clock gene in the regulation of male fertility［J］.J Biol Rhythms，2013，28（3）：208－217.

［20］Geiman TM，Muegge K.DNA methylation in early development［J］.Mol Reprod Dev，2010，77（2）：105－113.

［21］Shahrzad S，Bertrand K，Minhas K，et al.Induction of DNA hypomethylation by tumor hypoxia ［J］.Epigenetics：official journal of the DNA Methylation Society，2007，2（2）：119－125.

［22］Watson JA，Watson CJ，Mccrohan AM，et al.Generation of an epigenetic signature by chronic hypoxia in prostate cells［J］.Human molecular genetics，2009，18（19）：3594－3604.

［23］Waterland RA，Michels KB.Epigenetic epidemiology of the developmental origins hypothesis［J］.Annual review of nutrition，2007，27：363－388.

［24］Gopalakrishnan S，Van Emburgh BO，Robertson KD.DNA methylation in development and human disease［J］.Mutation research，2008，647（1－2）：30－38.