溫麗華, 許燕濱, 周 艷, 阮晶晶, 侯毛宇, 孫 浩, 屈毛毛, 袁保紅, 鄭 莉

1 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院, 廣州 510006 2 廣東藥學院基礎部, 廣州 510006

重金屬脅迫對PseudomonasalcaligenesLH7抗生素抗性的影響

溫麗華1, 許燕濱1,*, 周 艷1, 阮晶晶1, 侯毛宇1, 孫 浩1, 屈毛毛1, 袁保紅2, 鄭 莉1

1 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院, 廣州 510006 2 廣東藥學院基礎部, 廣州 510006

從廣州某養(yǎng)豬場廢水處理系統中篩選出1株優(yōu)勢菌PseudomonasalcaligenesLH7。為了研究重金屬脅迫對細菌抗生素抗性響應的影響，采用瓊脂稀釋法和K-B紙片擴散法，測定了重金屬(Cu2+、Zn2+、Cr6+)的最小抑制濃度(MIC)，及不同重金屬種類和濃度脅迫下，四種抗生素(紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)的抑菌圈直徑。結果表明：菌體對Cu2+、Zn2+、Cr6+的MIC分別為125、125、100 mg/L，并且具有四環(huán)素、阿莫西林、紅霉素和頭孢拉定多重抗性。重金屬與抗生素之間的交互作用對細菌的抗性有顯著影響(P<0.05)。重金屬和抗生素間的交互作用隨重金屬種類和濃度的不同而改變，可分為三類：低濃度重金屬與抗生素共存時表現為協同抗性，高濃度時則表現為協同殺菌，如Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定；低濃度重金屬與抗生素共存時表現為協同殺菌，高濃度時則表現為協同抗性，如Cr6+或Zn2+與阿莫西林；只與共存重金屬種類相關的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素或阿莫西林或紅霉素，Cr6+與頭孢拉定。環(huán)境中重金屬離子的共存將改變抗生素污染物的生態(tài)危害和環(huán)境行為，并最終影響對應的污染防治技術的開發(fā)和應用。

養(yǎng)豬場廢水;PseudomonasalcaligenesLH7; 重金屬脅迫; 抗生素; 協同抗性; 協同殺菌

在我國每年用作飼料添加劑的抗生素已超過8000t[1]，養(yǎng)殖業(yè)通常利用抗生素提高飼料利用率、牲畜的增重率以及預防和治療牲畜疾病[2]，因為過量添加，大部分抗生素不能被動物吸收，最終以母藥的形式隨糞便和尿液排出[3]。抗生素的濫用、過量使用，甚至人藥獸用，使得抗生素的環(huán)境危害和生態(tài)風險越來越大。研究者已從浙江、廣西、杭州、北京、濟南等多個省市的養(yǎng)殖場畜禽糞便中檢測出抗生素[4- 7]。此外，市政污水、河流水、湖泊水、沉積物和土壤，甚至地下水中均檢測出抗生素殘留[8- 9]?？股乜剐曰蜃鳛榭股匚廴镜拇紊廴疚?，已在包括河流、污水廠排水等多個水體中檢測出來[10- 11]，由于其可能通過水平遷移等途徑實現生物間傳遞，而人們對其具體的環(huán)境行為仍有非常多未知的領域，也吸引了越來越多學者的關注。目前主要的研究集中在抗生素對環(huán)境受體的影響[12]及抗生素在水環(huán)境、土壤環(huán)境以及污染治理設施中的降解情況研究等[13- 16]。

重金屬污染由于來源廣泛，且具有生物累積性、長期性和不可逆性，一直以來備受關注。作為兩種備受關注的污染物，重金屬和抗生素復合污染的現象也越來越普遍，如畜禽養(yǎng)殖的固廢和廢水、施用糞肥的土壤環(huán)境等[4,17]。目前，有關重金屬和抗生素復合污染的研究主要集中在重金屬和抗生素在環(huán)境中的分布、含量上的分析及對污水處理的影響[17- 18]，而重金屬對抗生素抗性的影響未做系統性研究，隨著人們從環(huán)境中篩選出越來越多同時具有重金屬抗性和抗生素抗性的菌種，如從魚、蝦體內及沉積物中分離的氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)等[19- 20]，及從南極海水中分離的莫拉氏菌屬(Moraxella)、產堿桿菌(Alcaligens)和假單胞菌(Pseudomonas)等嗜冷菌[21]，重金屬和抗生素抗性間的相關性也引起了學者的關注，研究發(fā)現重金屬和抗生素的聯合毒性表現為拮抗作用和相加作用[18]。

養(yǎng)殖廢水作為一種典型的重金屬和抗生素復合污染環(huán)境，其抗生素濃度范圍多為μg/L級，有些可達到1—6mg/L，而重金屬以Cu2+、Zn2+最高，在豬糞中可達幾百mg/kg[4,22- 23]，為了準確了解重金屬脅迫對菌體抗生素抗性的響應特點，本試驗從中篩選獲得1株優(yōu)勢菌PseudomonasalcaligenesLH7，研究3種典型重金屬(Cu2+、Zn2+、Cr6+)在不同濃度下對菌株抗生素(紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)抗性的影響，從而為微生物法治理重金屬和抗生素復合污染提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

本實驗菌株從廣州某養(yǎng)豬場廢水處理系統中分離獲得，為1株革蘭氏陰性桿菌，細桿狀，無芽孢，能運動，菌落呈圓形，無色，光滑不透明，色氨酸脫氫酶、V-P測定、硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶反應呈陽性，不能利用葡萄糖、蔗糖、果糖，經鑒定為產堿假單胞菌(PseudomonasalcaligenesLH7)。對照菌株為大腸桿菌K- 12，質控菌株為大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸桿菌ATCC 35218。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)菌種的活化和培養(yǎng)、菌懸液的制備、抗生素敏感實驗分別采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基。

(2)試驗培養(yǎng)基：分別稱取定量的分析純CuSO4·5H2O、ZnSO4和K2Cr2O7，以無菌去離子水定容,再用0.22 μm膜過濾，配制成濃度為1×104mg/L的重金屬標準溶液，作為儲備液，用于調節(jié)培養(yǎng)基中重金屬濃度。將滅菌(121 ℃，1.0 MPa)后的MH瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，加入不同量的重金屬儲備液，調節(jié)重金屬濃度。搖勻后，倒入培養(yǎng)皿待凝固，用于菌體的重金屬MIC測定及重金屬對菌株抗生素抗性影響研究。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備

挑取冰箱中甘油保存的菌種，接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h活化，從平板上挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)16—18 h獲得種子培養(yǎng)液；按照5%的接種量，接種到新鮮培養(yǎng)液中，繼續(xù)37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)16—18 h，獲得濃度為108CFU/mL的菌懸液，用于重金屬最小抑制濃度MIC測定及抗生素抗性研究。

1.2.2 重金屬最小抑制濃度(MIC)確定

采用瓊脂稀釋法，用涂布棒將100 μL菌懸液涂布到含重金屬溶液的試驗培養(yǎng)基上，Cu2+、Zn2+、Cr6+的濃度變化范圍為0—200 mg/L,置于生化培養(yǎng)箱恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌的生長情況。以大腸桿菌K- 12為對照菌株，MIC的終點判斷標準為抑制細菌生長的最低濃度。

1.2.3 抗生素抗性實驗

采用K-B紙片擴散法做抗生素耐藥試驗，實驗規(guī)程按美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準進行操作。由于該菌株為革蘭氏陰性菌，本實驗選用四種常見并針對革蘭氏陰性菌的抗生素，分別為紅霉素(15 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、頭孢拉定(30 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)，藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司，直徑為6 mm，于-20 ℃保存。以大腸桿菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853, 大腸桿菌ATCC 35218為質控菌株。

1.2.4 重金屬對抗生素抗性影響實驗

本試驗設計抗生素濃度一定時，即紅霉素(15 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、頭孢拉定(30 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)，不同濃度的重金屬對菌株的抗生素抗性的影響。移取100 μL菌懸液滴加至含重金屬的試驗培養(yǎng)基上，涂布均勻。15 min后，用小鑷子夾取藥敏紙片貼在涂好菌液的培養(yǎng)基上，每個平板上貼3片，每個實驗設置3個平行樣，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16—18 h，測量抑菌圈直徑。

1.3 統計分析

采用SPSS 17.0軟件，以抗生素種類、重金屬種類和重金屬濃度為固定因子，抑菌圈直徑為因變量，對數據進行單變量多因素方差分析，顯著性水平為0.05。抑菌圈直徑變化率k=(b-a)/a(a為未添加重金屬時抑菌圈直徑，b為添加重金屬后抑菌圈直徑)。采用Origin 8.1軟件繪制不同濃度Cu2+、Zn2+、Cr6+對四種抗生素抗性影響的柱形圖。

2 結果與分析

2.1 重金屬最小抑制濃度確定

本研究采用最小二分法確定Cu2+、Zn2+、Cr6+的最小抑制濃度分別為125、125、100 mg/L。根據重金屬的MIC值，重金屬和抗生素交叉抗性試驗中選取重金屬Cu2+和Zn2+的濃度梯度為0、0.1、2、10、50、100 mg/L，Cr6+的濃度梯度為0、0.1、2、20、50、80 mg/L。

2.2 藥敏結果

根據美國臨床和實驗室標準協會中藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準，以R(耐藥)、I(中介)、S(敏感)表示，該菌株對紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定和四環(huán)素4種抗生素的敏感程度見表1，發(fā)現該菌株對阿莫西林和四環(huán)素有抗性，而對頭孢拉定敏感。

表1 Pseudomonas alcaligenes LH7的抗生素敏感性Table 1 Susceptibility of Pseudomonas alcaligenes LH7 to antibiotics

2.3 重金屬對菌體抗生素抗性的影響

2.3.1 重金屬種類和濃度與抗生素抗性的相關性分析

方差分析發(fā)現重金屬種類和濃度對抑菌圈直徑影響顯著(F種類=18.370，P種類<0.05；F濃度=47.335，P濃度<0.05)。另外，抗生素種類×重金屬種類、抗生素種類×重金屬濃度、重金屬種類×重金屬濃度之間的二維交互效應對抑菌圈直徑也有極為顯著的影響(P<0.05)，甚至抗生素種類×重金屬種類×重金屬濃度之間的三維交互效應對抑菌圈直徑也有極為顯著的影響(F=32.605，P<0.05)(表2)。這表明對于菌株的抗性影響因素，除抗生素種類、重金屬種類和重金屬濃度主因子外，抗生素種類×重金屬種類、抗生素種類×重金屬濃度、重金屬種類×重金屬濃度之間的二維交互效應以及抗生素種類×重金屬種類×重金屬濃度之間的三維交互效應也不可忽略，重金屬和抗生素存在交互作用，即重金屬脅迫對細菌抗生素抗性響應有影響。

表2 主效應方差分析Table 2 Tests of Between-Subjects effects

2.3.2 重金屬濃度對抗生素抗性的影響

由圖1—圖3可知，重金屬的加入對細菌的抗生素抗性有不同程度的影響。從抑菌圈直徑相對變化率來看，重金屬的加入對菌體四環(huán)素抗性的影響最為明顯，而對頭孢拉定的影響最不明顯。隨著共存Cu2+濃度升高，四環(huán)素抑菌圈直徑與空白相比，變化率也不斷增大，分別為115.32%(0.1 mg/L Cu2+)，161.56%(2 mg/L Cu2+)，162.14%(10 mg/L Cu2+)，171.97%(50 mg/L Cu2+)，174.28%(100 mg/L Cu2+)，而頭孢拉定抑菌圈直徑變化率范圍在 -16.80% — +11.26%；Zn2+共存時，菌體四環(huán)素抑菌圈直徑變化率分別為170.81%(0.1 mg/L Zn2+)，-100.00%(2 mg/L Zn2+)，-100.00%(10 mg/L Zn2+)，134.54%(50 mg/L Zn2+)，140.03%(100 mg/L Zn2+)，而頭孢拉定抑菌圈直徑變化率范圍很小，在 -9.12% — 34.65%之間； Cr6+共存使得菌體四環(huán)素抑菌圈直徑的變化率分別為 -100.00%(0.1 mg/L Cr6+)，7.80%(2 mg/L Cr6+)，-100.00%(20 mg/L Cr6+)，-100.00%(50 mg/L Cr6+)，-100.00%(80 mg/L Cr6+)，而頭孢拉定抑菌圈直徑的變化率明顯隨著Cr6+濃度的升高而逐漸增大，分別為1.26%(0.1 mg/L Cr6+)，15.65%(2 mg/L Cr6+)，22.30%(20 mg/L Cr6+)，40.91%(50 mg/L Cr6+)，53.32%(80 mg/L Cr6+)。

圖1 Cu2+對抗生素抗性的影響

圖2 Zn2+對抗生素抗性的影響

圖3 Cr6+對抗生素抗性的影響

重金屬對細菌抗生素抗性的影響主要表現為促進作用和抑制作用，即重金屬和抗生素間的交互作用表現為協同抗性和協同殺菌，且隨重金屬種類和濃度的不同而改變，可將交叉抗性組合分為3種類型。第1種，低濃度的重金屬離子與抗生素共存表現為協同抗性，而高濃度重金屬離子與抗生素共存表現為協同殺菌，如Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定。低濃度的Cr6+或Zn2+與紅霉素共存時，測得的抑菌圈直徑均小于空白組的抑菌圈直徑15.41mm，即低濃度的Cr6+和Zn2+使得菌株紅霉素抗性增強，Cr6+或Zn2+與紅霉素之間表現為協同抗性；而高濃度的Cr6+或Zn2+與紅霉素共存時，菌株紅霉素抗性減弱，此時Cr6+或Zn2+與紅霉素之間表現為協同殺菌。第2種，與第1種類型相反，即高濃度的重金屬離子與抗生素共存表現為協同抗性，而低濃度重金屬離子與抗生素共存表現為協同殺菌，如Cr6+或Zn2+與阿莫西林。低濃度的Cr6+或Zn2+與阿莫西林共存時，測得抑菌圈直徑均大于空白組的抑菌圈直徑7.95 mm，即低濃度Cr6+或Zn2+使得PseudomonasalcaligenesLH7對阿莫西林的抗性減弱，Cr6+或Zn2+與阿莫西林之間表現為協同殺菌；而高濃度的Cr6+或Zn2+與阿莫西林共存時，菌株對阿莫西林的抗性增強，此時Cr6+或Zn2+與阿莫西林之間表現為協同抗性。這兩類抗性組合都存在重金屬折點濃度，且因抗性組合而異。如與阿莫西林共存時，Cu2+、Cr6+的折點濃度50 mg/L，而Zn2+的折點濃度為10mg/L。第3種，菌體的抗生素抗性變化只與重金屬種類相關，如Cu2+的共存導致菌體的四環(huán)素抗性減弱，敏感性從R變成S，類似的還有Cu2+與阿莫西林及Cr6+與頭孢拉定，而Cu2+的共存導致菌體的紅霉素抗性明顯增強，敏感性從I變成R(表3)。

表3 重金屬共存對抗生素敏感性的影響Table 3 Effect of heavy metals on susceptibility of Pseudomonas alcaligenes LH7

3 討論

從養(yǎng)殖廢水中篩選出的菌株PseudomonasalcaligenesLH7具有重金屬(Cu2+、Zn2+、Cr6+)抗性和抗生素(紅霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)抗性，菌體的重金屬抗性強弱順序為Cu2+= Zn2+> Cr6+。Matyar等[23]也從海水及沉積物中分離得到具有重金屬和抗生素抗性的假單胞菌，發(fā)現菌體的重金屬抗性強弱順序為Cu > Cd > Mn > Zn > Cr > Pb，且同時對多種抗生素表現出抗性[24]。對于菌體同時具有重金屬和抗生素抗性的原因，可能是與許多抗生素和重金屬抗性基因位于相同的移動遺傳元件(MGEs)，如質粒、轉座子和整合子有關[2]。

重金屬種類和濃度對菌株的抗生素抗性有很大影響(P<0.05)。重金屬和抗生素的交互作用主要表現在協同抗性和協同殺菌。具有協同抗性的抗性組合有Cu2+與紅霉素，低濃度的Cr6+、Zn2+與紅霉素及高濃度的Cr6+、Zn2+與阿莫西林。孫建平等[18]研究了抗生素和重金屬聯合毒性作用下對發(fā)光細菌的影響，發(fā)現金霉素與Cu(Ⅱ)存在拮抗作用，金霉素的抑制作用隨Cu(Ⅱ)濃度的增加而減小。協同抗性是指重金屬抗性基因和抗生素抗性基因定位于同一個遺傳元件上，如質粒、轉座子或整合子，通過轉化、質粒消除和質粒測序方法已經證明重金屬和抗生素抗性基因常常定位于質粒上[25- 26]。除了基因上的聯系，重金屬與抗生素之間的吸附作用、絡合作用也可能是其協同抗性的原因。Jia等[27]研究發(fā)現重金屬銅和四環(huán)素共存時，會影響它們在土壤上的吸附行為，四環(huán)素增加了Cu在兩種土壤上的吸附量。H?lzel等[28]研究發(fā)現鋅離子與四環(huán)素會形成穩(wěn)定的絡合物，鋅離子會抑制腸道對四環(huán)素的吸收，使得瞬時腸道(及排泄的)中的四環(huán)素濃度瞬時增大。而這種螯合作用對母藥的抑菌效力的影響還有待進一步研究。

而具有協同殺菌作用的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素或阿莫西林，Cr6+與頭孢拉定，低濃度的Zn2+與阿莫西林以及高濃度的Cu2+與頭孢拉定， Zn2+與四環(huán)素。相類似地，孫建平等研究發(fā)現金霉素與Zn(Ⅱ)之間為相加作用[18]。在重金屬、外源性化合物、有機溶劑的選擇壓力下，細菌的抗生素抗性基因會受到影響[29]。某些金屬(例如Ca、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、Ni和Zn)是必要的，作為微量營養(yǎng)素，用于氧化還原過程，以通過靜電作用穩(wěn)定分子，作為多種酶的組成部分和調節(jié)滲透壓[30]。有研究表明重金屬會引起亞致死損傷，這可能會增加細菌對抗生素的敏感性[28]。另外，同一交叉抗性組合在低濃度和高濃度的表現出的作用類型有所不同，可能有3種原因，第一，不同濃度重金屬的毒性不同，低濃度的重金屬可作為微量營養(yǎng)素刺激微生物生長，高濃度的重金屬與酶或DNA結合，或產生氧自由基發(fā)生Fenton反應，表現為毒性增強，抑制微生物的生長繁殖，延長微生物的增代時間，如0.5 mM的Zn2+可以抑制大腸桿菌的生長，10 mM濃度的Zn2+可以減少大腸桿菌的存活[31- 32]。所以，在低濃度表現為協同抗性，高濃度表現為協同殺菌。然而，某些重金屬既有毒性，又有致突變性，如Cr6+會引起細菌DNA碼組錯位突變和堿基對替換[33]，這就使得高濃度的Cr6+與阿莫西林表現為協同抗性。第二，重金屬與抗生素間的絡合作用，如重金屬陽離子與四環(huán)素類抗生素間的配合作用[34]，銅(Ⅱ)，鎳(Ⅱ)，鈷(Ⅱ)與頭孢拉定的氨基和羰基形成絡合物[35]。由于形成的絡合物對細菌的影響還不明確，有以下3種可能：(1)絡合物無毒性；(2)絡合物低毒性；(3)絡合物高毒性。四環(huán)素與Zn2+共存時，四環(huán)素抗性隨Zn2+濃度的增大表現為先減弱后增強再減弱，可能是由于Zn2+與四環(huán)素形成的絡合物無毒或低毒，在低濃度時，以抗生素和重金屬的毒性為主，在一定范圍的高濃度，以絡合作用后四環(huán)素或重金屬的毒性為主，超過臨界濃度時，則以重金屬的毒性為主。第三，與抗生素的種類有關，種類不同，抗菌作用機制也不同。紅霉素和四環(huán)素主要抑制蛋白質的形成，阿莫西林和頭孢拉定則抑制細胞壁的合成。細菌的耐藥作用可能需要某些重金屬的參與，如Zn2+與阿莫西林共存時，阿莫西林屬β-內酰胺青霉素類抗生素，產生β-內酰胺酶是細菌耐藥的重要機制之一，其中金屬β-內酰胺酶為β-內酰胺酶中的一類，需要金屬離子Zn2+作輔因子[36]。此外，微生物的不同發(fā)育階段對重金屬敏感性不同[32]，失活的菌體對某些重金屬還具有一定的吸附作用或還原作用，如Cr6+，有研究發(fā)現用失活的黑曲霉吸附水體中的Cr6+時，發(fā)現吸附在菌體上的鉻大部分以Cr3+存在，說明失活菌體對在吸附Cr6+的過程中還有較好的還原作用[37]。因此，重金屬的濃度與抗生素抗性之間有著很復雜的關系。

4 結論

(1)從養(yǎng)殖廢水分離出的革蘭氏陰性桿菌PseudomonasalcaligenesLH7具有3種重金屬抗性和4種抗生素抗性，對重金屬抗性強弱順序為Cu2+= Zn2+> Cr6+。

(2)重金屬作用下，對菌株的抗生素抗性有顯著影響。抗生素種類、重金屬種類和重金屬濃度、抗生素種類×重金屬種類、抗生素種類×重金屬濃度、重金屬種類×重金屬濃度之間的二維交互效應以及抗生素種類×重金屬種類×重金屬濃度之間的三維交互效應對抑菌圈直徑有極為顯著的影響(P<0.05)。重金屬的加入對四環(huán)素抗性的影響最為明顯，而對頭孢拉定的影響最不明顯。

(3) 重金屬和抗生素的交互作用主要表現為協同抗性和協同殺菌，濃度對交叉抗性組合的影響主要分為3種類型。在低濃度表現為協同抗性，高濃度表現為協同殺菌的抗性組合有Cr6+或Zn2+與紅霉素，Cu2+與頭孢拉定；在低濃度表現協同殺菌，高濃度表現為協同抗性的抗性組合有Cr6+或Zn2+與阿莫西林；菌體的抗生素抗性變化只與重金屬種類相關的抗性組合有Cu2+與四環(huán)素或阿莫西林或紅霉素，Cr6+與頭孢拉定。

[1] Ben W W, Qiang Z M, Pan X, Chen M X. Removal of veterinary antibiotics from sequencing batch reactor (SBR) pretreated swine wastewater by Fenton′s reagent. Water Research, 2009, 43(17): 4392- 4402.

[2] Fard R M N, Heuzenroeder M W, Barton M D. Antimicrobial and heavy metal resistance in commensal enterococci isolated from pigs. Veterinary Microbiology, 2011, 148(2/4): 276- 282.

[3] Ji X L, Shen Q H, Liu F, Ma J, Xu G, Wang Y L, Wu M H. Antibiotic resistance gene abundances associated with antibiotics and heavy metals in animal manures and agricultural soils adjacent to feedlots in Shanghai; China. Journal of Hazardous Materials, 2012, 235- 236: 178- 185.

[4] 單英杰, 章明奎. 不同來源畜禽糞的養(yǎng)分和污染物組成. 中國生態(tài)農業(yè)學報, 2012, 20(1): 80- 86.

[5] 董占榮, 陳一定, 林咸永, 章永松, 倪丹華. 杭州市郊規(guī)?；B(yǎng)殖場豬糞的重金屬含量及其形態(tài). 浙江農業(yè)學報, 2008, 20(1): 35- 39.

[6] 張樹清, 張夫道, 劉秀梅, 王玉軍, 鄒紹文, 何緒生. 規(guī)?；B(yǎng)殖畜禽糞主要有害成分測定分析研究. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2005, 11(6): 822- 829.

[7] 黃玉溢, 劉斌, 陳桂芬, 王影. 規(guī)模化養(yǎng)殖場豬配合飼料和糞便中重金屬含量研究. 廣西農業(yè)科學, 2007, 38(5): 544- 546.

[8] Lei T, Li P, Wang Y X, Zhu K Z. Analysis of veterinary antibiotic residues in swine wastewater and environmental water samples using optimized SPE-LC/MS/MS. Chemosphere, 2008, 74(8): 1090- 1097.

[9] Hamscher G, Sczesny S, H?per H, Nau H. Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry, 2002, 74(7): 1509- 1518.

[10] 何基兵, 胡安誼, 陳猛, 胡友彪, 于昌平. 九龍江河口及廈門污水處理設施抗生素抗性基因污染分析. 微生物學通報, 2012, 39(5): 683- 695.

[11] Luo Y, Mao D Q, Rysz M, Zhou Q X, Zhang H J, Xu L, Alvarez P J J. Trends in antibiotic resistance genes occurrence in the Haihe River, China. Environmental Science and Technology, 2010, 44(19): 7220- 7225.

[12] 劉鋒, 陶然, 應光國, 楊基峰, 張麗娟. 抗生素的環(huán)境歸宿與生態(tài)效應研究進展. 生態(tài)學報, 2010, 30(16): 4503- 4511.

[13] 張健, 關連珠, 顏麗. 雞糞中3種四環(huán)素類抗生素在棕壤中的動態(tài)變化及原因分析. 環(huán)境科學學報, 2011, 31(5): 1039- 1044.

[14] 陳永山, 章海波, 駱永明, 胡冠九, 趙永剛, 宋靜. 典型規(guī)?；B(yǎng)豬場廢水中獸用抗生素污染特征與去除效率研究. 環(huán)境科學學報, 2010, 30(11): 2205- 2212.

[15] 鮑艷宇, 周啟星, 萬瑩, 余強, 謝秀杰. 3種四環(huán)素類抗生素在褐土上的吸附和解吸. 中國環(huán)境科學, 2010, 30(10): 1383- 1388.

[16] 鮑艷宇, 周啟星, 張浩. 陽離子類型對土霉素在2種土壤中吸附-解吸影響. 環(huán)境科學, 2009, 30(2): 551- 556.

[17] 王瑾, 韓劍眾. 飼料中重金屬和抗生素對土壤和蔬菜的影響. 生態(tài)與農村環(huán)境學報, 2008, 24(4): 90- 93.

[18] 孫建平. 抗生素與重金屬對豬場廢水厭氧消化的抑制效應及其調控對策[D]. 杭州: 浙江大學, 2009.

[19] Akinbowale O L, Peng H H, Grant P, Barton M D. Antibiotic and heavy metal resistance in motile aeromonads and pseudomonads from rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) farms in Australia. International Journal of Antimicrobial Agents, 2007, 30(2): 177- 182.

[20] Najiah M, Lee S W, Wendy W, Tee L W, Nadirah M, Faizah S H. Antibiotic resistance and heavy metals tolerance in Gram-Negative bacteria from diseased American bullfrog (Ranacatesbeiana) cultured in Malaysia. Agricultural Sciences in China, 2009, 8(10): 1270- 1275.

[21] De Souza M J, Nair S, Bharathi P A L, Chandramohan D. Metal and antibiotic-resistance in psychrotrophic bacteria from Antarctic Marine waters. Ecotoxicology, 2006, 15(4): 379- 384.

[22] 楊煜東, 陳東輝, 黃滿紅. 環(huán)境中抗生素的來源及其生態(tài)影響研究進展. 環(huán)境科學與管理, 2010, 35(1): 140- 143.

[23] 冀秀玲, 劉芳, 沈群輝, 劉揚. 養(yǎng)殖場廢水中磺胺類和四環(huán)素抗生素及其抗性基因的定量檢測. 生態(tài)環(huán)境學報, 2011, 20(5): 927- 933.

[24] Matyar F, Akkan T, U?ak Y, Eraslan B.AeromonasandPseudomonas: antibiotic and heavy metal resistance species from Iskenderun Bay, Turkey (northeast Mediterranean Sea). Environmental Monitoring and Assessment, 2010, 167(1/4): 309- 320.

[25] Baker-Austin C, Wright M S, Stepanauskas R, McArthur J V. Co-selection of antibiotic and metal resistance. Trends in Microbiology, 2006, 14(4): 176- 182.

[26] 季秀玲, 魏云林, 林連兵. 細菌抗生素和重金屬協同選擇抗性機制研究進展. 生物技術通報, 2010, (5): 65- 69.

[27] Jia D A, Zhou D M, Wang Y J, Zhu H W, Chen J L. Adsorption and cosorption of Cu(Ⅱ) and tetracycline on two soils with different characteristics. Geoderma, 2008, 146(1/2): 224- 230.

[28] H?lzel C S, Müller C, Harms K S, Mikolajewski S, Sch?fer S, Schwaiger K, Bauer J. Heavy metals in liquid pig manure in light of bacterial antimicrobial resistance. Environmental Research, 2012, 113: 21- 27.

[29] Alonso A, Sánchez P, Martínez J L. Environmental selection of antibiotic resistance genes. Environmental Microbiology, 2001, 3(1): 1- 9.

[30] Hussein H, Farag S, Kandil K, Moawad H. Tolerance and uptake of heavy metals byPseudomonads. Process Biochemistry, 2005, 40(2): 955- 961.

[31] Matyar F, Kaya A, Din?er S. Antibacterial agents and heavy metal resistance in Gram-negative bacteria isolated from seawater, shrimp and sediment in Iskenderun Bay, Turkey. Science of the Total Environment, 2008, 407(1): 279- 285.

[32] 張甲耀. 重金屬對微生物的毒性效應. 環(huán)境科學,1983, 4(3): 71- 74, 64- 64.

[33] 龔平, 孫鐵珩, 李培軍. 重金屬對土壤微生物的生態(tài)效應. 應用生態(tài)學報, 1997, 8(2): 218- 224.

[34] Bednorz C, Oelgeschl?ger K, Kinnemann B, Hartmann S, Neumann K, Pieper R, Bethe A, Semmler T, Tedin K, Schierack P, Wieler L H, Guenther S. The broader context of antibiotic resistance: Zinc feed supplementation of piglets increases the proportion of multi-resistant Escherichia coli in vivo. International Journal of Medical Microbiology, 2013, 303(6/7): 396- 403.

[35] Shoukry M M, Shoukry E M, El-Medani S M. Metal complexes of cephradine: Synthesis and equilibrium studies. Monatshefte für Chemie/Chemical Monthly, 1995, 126(8/9): 909- 918.

[36] 陳照強, 劉一方, 朱寧, 陳姣, 鄭珩. 金屬β-內酰胺酶的研究進展. 國外醫(yī)藥(抗生素分冊), 2011, 32(3): 111- 115.

[37] Park D, Yun Y S, Jo J H, Park J M. Mechanism of hexavalent chromium removal by dead fungal biomass ofAspergillusniger. Water Research, 2005, 39(4): 533- 540.

Effects of heavy metal stress on antibiotics resistance ofPseudomonasalcaligenesLH7

WEN Lihua1, XU Yanbin1,*, ZHOU Yan1, RUAN Jingjing1, HOU Maoyu1, SUN Hao1, QU Maomao1, YUAN Baohong2, ZHENG Li1

1SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China2SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China

To study the effect of heavy metal stress on bacterial antibiotic resistance, a Gram-negative bacteria isolated from swine wastewater in Guangzhou was characterized and identified asPseudomonasalcaligenesLH7. The minimal inhibition concentration (MIC) of heavy metals (Cu2+, Zn2+and Cr6+) and antibiotic susceptibility test were determined by the methods of Kirby-Bauer disk diffusion and agar dilution. Furthermore, with the joint effect of type and concentration of heavy metals, the inhibition zone diameter of the tested antibiotics (erythromycin, amoxicillin, cephradine and tetracycline) was measured by vernier caliper. The results showed that the MICs of Cu2+, Zn2+and Cr6+were 125 mg/L,125 mg/L and 100 mg/L, respectively. Multiple antibiotic resistance was also observed. ThePseudomonasalcaligenesLH7 showed resistance to erythromycin, amoxicillin, cephradine and tetracycline. The interaction of antibiotics and heavy metals significantly affected bacterial resistance (P﹤0.05). There were three kinds of cross-effects between antibiotics and heavy metals according to the types and concentrations of heavy metals. Firstly, the effect of heavy metals on antibiotic resistance could be co-resistance at low concentrations but synergic germicidal at high concentrations, such as Cr6+and erythromycin, Zn2+and erythromycin, Cu2+and cephradine. Secondly, the effect of heavy metals on antibiotic resistance could be synergic germicidal at low concentrations but co-resistance at high concentrations, such as Cr6+and amoxicillin, Zn2+and amoxicillin. Finally, the antibiotic resistance was only associated with the types of heavy metal, such as Cu2+and tetracycline or amoxicillin or erythromycin, Cr6+and cephradine. Co-existence of heavy metals in environment will change the ecological harm and environmental behavior of antibiotics, and affect the development and application of relative pollution prevention techniques, so this is a field worthy of attention.

swine wastewater;PseudomonasalcaligenesLH7; heavy metal stress; antibiotics; co-resistance; synergic germicidal

國家自然科學基金資助項目(40801194); 中山市科技計劃項目(2013A3FC0243)

2013- 06- 24;

2014- 05- 30

10.5846/stxb201306241772

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hopeybxu@163.com

溫麗華, 許燕濱, 周艷, 阮晶晶, 侯毛宇, 孫浩, 屈毛毛, 袁保紅, 鄭莉.重金屬脅迫對PseudomonasalcaligenesLH7抗生素抗性的影響.生態(tài)學報,2015,35(10):3411- 3418.

Wen L H, Xu Y B, Zhou Y, Ruan J J, Hou M Y, Sun H, Qu M M, Yuan B H, Zheng L.Effects of heavy metal stress on antibiotics resistance ofPseudomonasalcaligenesLH7.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3411- 3418.