汪洋，劉曉偉，徐志鴻，張艷飛

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110001）

·論著·

控制性肺膨脹對(duì)兔外源性肺損傷的療效及其機(jī)制探討

汪洋，劉曉偉，徐志鴻，張艷飛

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110001）

目的探討控制性肺膨脹對(duì)外源性急性肺損傷動(dòng)物模型肺保護(hù)作用及其機(jī)制。方法應(yīng)用靜脈注射油酸成功復(fù)制外源性急性肺損傷模型，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織IL-10和IL-6蛋白表達(dá)；用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)血清中IL-10和IL-6含量；Western blot檢測(cè)肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定肺組織中ICAM-1mRNA和SP-A mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞儀定量分析肺組織細(xì)胞凋亡。結(jié)果35 cmH2O壓力維持20 s的肺復(fù)張方法能有效提高PaO2和PaO2/FiO2，降低PaCO2，改善氧合和肺順應(yīng)性，對(duì)肺外源性急性肺損傷的復(fù)張效果良好；與對(duì)照組比較，控制性肺膨脹治療組肺組織和血清IL-10及IL-6含量明顯增高（P＜0.05），肺組織和肺泡灌洗液SP-A表達(dá)水平顯著減少（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論控制性肺膨脹可通過抑制凋亡，減輕急性肺損傷時(shí)的炎性反應(yīng)，降低肺水腫程度，減少肺組織SP-A降解，促進(jìn)肺泡SP-A合成與分泌，對(duì)外源性急性肺損傷的保護(hù)作用較好。

急性肺損傷；控制性肺膨脹；白介素6；白介素10；肺表面活性物；凋亡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的基礎(chǔ)病變，是多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）在肺臟的表現(xiàn)［1］，其本質(zhì)是由各種原因直接或間接損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，肺毛細(xì)血管通透性增高的血管滲漏綜合征。ALI具有較高的致死率，屬于臨床重癥治療中的難點(diǎn)［2］。早期診斷、早期合理干預(yù)是降低ALI患者病死率的關(guān)鍵，機(jī)械通氣是重要的支持和治療手段，應(yīng)用合理的機(jī)械通氣策略，可為肺損傷的緩解和恢復(fù)創(chuàng)造條件。

控制性肺膨脹（sustained inflation，SI）是一種肺復(fù)張方法，機(jī)械通氣時(shí)通過給予足夠的氣道壓力，使塌陷的肺泡充分復(fù)張，且屏氣一段時(shí)間，增加肺泡的穩(wěn)定性，從而達(dá)到增加機(jī)體氧合的目的［3，4］。本研究應(yīng)用控制性肺膨脹這一肺復(fù)張方法干預(yù)治療外源性ALI動(dòng)物模型，采用免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞技術(shù)、免疫印記技術(shù)、基因逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)（RTPCR）等分別從動(dòng)物臨床癥狀、肺組織形態(tài)、肺組織炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞間黏附分子、肺表面活性物質(zhì)的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡等方面對(duì)SI肺保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行多層次、多角度的對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用24只健康新西蘭兔，建立外源性ALI動(dòng)物模型后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組8只?？瞻讓?duì)照組（C組）：不做任何處理，僅觀察指標(biāo)；ALI組（EP0組）：靜脈內(nèi)注射油酸造成ALI；治療組（EP1組）：靜脈內(nèi)注射油酸造成ALI后，采取SI（35 cmH2O、20 s）進(jìn)行肺復(fù)張。

1.2 主要試劑及設(shè)備

組織總蛋白提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司，Western blot抗體購(gòu)自英國(guó)ABCam，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，凋亡試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程公司，RNA提取Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司，RNA酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床觀測(cè)指標(biāo)：記錄每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模前、后和基礎(chǔ)通氣30、60 min的下述指標(biāo)：（1）氣體交換指標(biāo)：動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、血pH；（2）呼吸力學(xué)指標(biāo)：吸氣峰壓（peak inspiratory pressure，PIP）、氣道平臺(tái)壓力（plateau pressure，Pplat）、計(jì)算呼吸系統(tǒng)動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（dynamic compliance，Cdyn）；（3）血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：平均動(dòng)脈壓力（mean artery pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）。

1.3.2 蛋白印記：取蛋白樣本，經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗（1∶100稀釋）4℃孵育過夜、洗膜后二抗室溫孵育30 min，ECL發(fā)光，顯影。結(jié)果處理，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的光密度比值作為目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IL-10和IL-6蛋白表達(dá)：采用SP法，樣本10%甲醛溶液固定，常規(guī)制作組織蠟塊，石蠟切片，0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min，抗原修復(fù)，一抗（羊抗兔IL-10、IL-6 IgG多克隆抗體，1∶100），PBS清洗3次，每次5 min，分別滴加二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔IgG）工作液，37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；PBS清洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色2～5 min，自來(lái)水充分沖洗，終止顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。陰性對(duì)照用PBS替代一抗，其余步驟同上，光鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)部位并照相。結(jié)果判定：（1）著色細(xì)胞占細(xì)胞計(jì)數(shù)百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；（2）無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分；棕褐色為3分；（3）二者相乘即陽(yáng)性等級(jí)。0分為陰性，1～4分為弱陽(yáng)性，5～8分為陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定肺組織目的基因表達(dá)：總RNA提取，取肺組織0.1 g，剪碎后加人1 mL Trizol Reagent，用無(wú)菌注射器反復(fù)抽吸使之成乳狀，再用氯仿、異丙醇、酒精等處理后提取總RNA。在紫外分光光度下檢測(cè)波長(zhǎng)在260、280 nm的吸光度值，計(jì)算提取物RNA濃度，判定其純度；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入樣本RNA、2倍緩沖液、25 mmol/L硫酸鎂、寡核苷酸、RNA酶抑制劑、寡核苷酸引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后65℃l min、30℃5 min、30 min勻速升溫至65℃30 min、98℃5 min、5℃5 min，其產(chǎn)物即cDNA；常規(guī)PCR擴(kuò)增。

1.3.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡：?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備，Annexin Ⅴ-FITC+PI雙染，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，雙參數(shù)分析綠熒光（Annexin Ⅴ標(biāo)記的胞膜完整但外翻的細(xì)胞）及紅熒光（PI標(biāo)記的胞膜破損細(xì)胞）MODFIT軟件分析細(xì)胞凋亡結(jié)果，結(jié)果以散點(diǎn)圖形式輸出。左上代表細(xì)胞碎片；右上代表壞死或凋亡晚期細(xì)胞；左下代表正常細(xì)胞；右下代表早期凋亡細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血?dú)夥治觥⒀鲃?dòng)力學(xué)指標(biāo)

EP1組在各時(shí)間點(diǎn)（30、60 min）PaO2/FiO2和PaO2均明顯高于EP0組（P＜0.05），EP1組較EP0組改善更顯著；EP1組在機(jī)械通氣后60 min時(shí)PaCO2變化與EP0組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

機(jī)械通氣30、60 min時(shí)，EP1組HR變化與EP0組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而MAP變化組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 肺外源性ALI家兔血?dú)夥治鲋笜?biāo)Tab.1 The blood gas analysis of rabbit with lung exogenous ALI

表2 肺外源性ALI家兔血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化Tab.2 Changes in hemodynamic indexes of rabbit with lung exogenous ALI

2.2 肺組織中IL-10、IL-6的變化

IL-10、IL-6陽(yáng)性染色為棕黃色。C組、EP0組和EP1組肺組織中IL-10和IL-6均呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見微量棕黃色陽(yáng)性顆粒（圖1、2）。

2.3 各組血清中IL-10、IL-6含量變化

與C組比較，EP0、EP1組血清中IL-10、IL-6含量均顯著增加（P＜0.05），而EP1組血清中IL-10含量低于EP0組（P＜0.05）。見表3。

圖2 各組肺組織中IL-6表達(dá)情況 免疫組化×200Fig.2 The expression of IL-6 in lung tissue of each group IHC×200

2.4 肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白和mRNA表達(dá)

與C組比較，EP0、EP1組肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白含量和mRNA表達(dá)均顯著減少；EP1組肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白含量和mRNA表達(dá)均明顯高于EP0組，見圖3。

表3 血清中IL-10、IL-6含量比較（pg/mL）Tab.3 Comparison of IL-10 and IL-6 content in serum（pg/mL）

圖3 肺組織和肺泡灌洗液SP-A蛋白及mRNA表達(dá)Fig.3 The expression of SP-A protein and mRNA in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid

2.5 肺組織細(xì)胞凋亡結(jié)果

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，C組、EP0組、EP1組肺組織細(xì)胞凋亡率分別為（14.56±1.67）%、（23.61± 2.58）%、（19.16±2.14）%。與C組比較，EP0、EP1組肺組織細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），EP0與EP1組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

急性肺損傷是一種臨床急危重癥，肺容積明顯減少且病變不均一是ALI的重要特征。國(guó)內(nèi)外的研究資料顯示［5，6］，ALI主要以肺泡及肺間質(zhì)水腫，大量肺泡萎陷且程度不均一為特點(diǎn)。ALI目前尚無(wú)簡(jiǎn)單而可靠的診斷指標(biāo)，仍根據(jù)臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷。ALI的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，隨著科學(xué)及各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，人類對(duì)于ALI的發(fā)病機(jī)制有了更深刻的認(rèn)識(shí)，主要包括以下方面［7］：（1）炎性細(xì)胞因子的失衡；（2）細(xì)胞間黏附分子的參與；（3）肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS）系統(tǒng)的異常；（4）細(xì)胞凋亡等。

SI是近年來(lái)研究較多的機(jī)械通氣新策略，無(wú)論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床研究均顯示對(duì)ALI/ARDS有良好的療效［8］。研究顯示，SI復(fù)張后肺容積明顯增加，提示SI能夠促進(jìn)塌陷肺泡的復(fù)張［9］。還有研究結(jié)果顯示，SI的應(yīng)用能夠顯著提高氧合，增加肺順應(yīng)性、呼氣末肺容積以及功能殘氣量，減少機(jī)械通氣時(shí)的死腔量，減輕肺水腫與肺損傷程度，達(dá)到治療ALI的目的［10］。SI等肺泡復(fù)張手法能顯著改善氧合的原因在于：通過給予氣道較高的壓力，使較多的萎陷肺泡復(fù)張，改善肺內(nèi)氣體分布，從而減少分流，改善了通氣/血流比例，使肺部氧合增加；SI持續(xù)一定的時(shí)間有助于時(shí)間常數(shù)不同的肺泡的氣體均勻分布，并且延長(zhǎng)氣體交換時(shí)間，也增加肺部的氧合［11，12］。

本研究建立ALI動(dòng)物模型，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最適SI壓力（35 cmH2O 20 s）治療外源性ALI，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SI治療能有效改善動(dòng)物血?dú)夥治黾把鲃?dòng)力學(xué)指標(biāo)，為進(jìn)一步闡明其治療機(jī)制，本研究從分子生物學(xué)水平及細(xì)胞水平揭示SI對(duì)炎性因子IL-10及IL-6、肺表面活性物SP-A以及細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALI中存在著促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的平衡失調(diào)，而SI不僅可以抑制促炎細(xì)胞因子的含量，同時(shí)抑制抗炎細(xì)胞因子的分泌，有利于維持機(jī)體炎性反應(yīng)的平衡，且對(duì)外源性ALI的作用更加明顯。ALI存在SP-A下調(diào)的現(xiàn)象，SI治療后動(dòng)物肺組織及肺泡灌洗液中SP-A含量升高，表明實(shí)施SI對(duì)改善ALI引起的SP-A含量下降作用明顯。其原因?yàn)椋篠I治療可減輕肺組織炎性反應(yīng)，降低肺水腫發(fā)生程度，使肺泡SP-A合成增加、降解減少，肺泡灌洗液及肺組織SP-A蛋白表達(dá)均增加。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)SI可通過抑制ALI時(shí)異常增高的肺組織細(xì)胞凋亡，使肺組織炎性反應(yīng)降低，肺臟損傷程度減弱。

綜上所述，SI可通過抑制凋亡，減輕ALI時(shí)的炎性反應(yīng)，降低肺水腫程度，減輕AT-Ⅱ的損傷，減少肺組織SP-A降解，促進(jìn)肺泡SP-A合成與分泌，維持AT-Ⅱ正常的結(jié)構(gòu)與功能，從而發(fā)揮對(duì)外源性ALI保護(hù)作用。

［1］Iliodromiti Z，Zygouris D，Sifakis S，et al.Acute lung injury in preterm fetuses and neonates：mechanisms and molecular pathways［J］. J Matern Fetal Neonatal Med，2013，26（17）：1696-1704.

［2］Wang S，Singh B，Tian L，et al.Epidemiology of noninvasive mechanical ventilation in acute respiratory failure--a retrospective population-based study［J］.BMC Emerg Med，2013，13：6.

［3］Keenan JC，F(xiàn)ormenti P，Marini JJ.Lung recruitment in acute respiratory distress syndrome：what is the best strategy?［J］.Curr Opin Crit Care，2014，20（1）：63-68.

［4］Zhao F，Wang W，F(xiàn)ang Y，et al.Molecular mechanism of sustained inflation in acute respiratory distress syndrome［J］.J Trauma Acute Care Surg，2012，73（5）：1106-1113.

［5］Atabai K，Matthay MA.Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome：definition and epidemiology［J］.Thorax，2002，57（5）：452-458.

［6］Rubenfeld GD，Caldwell E，Peabody E，et al.Incidence and outcomes of acute lung injury［J］.N Engl J Med，2005，353（16）：1685-1693.

［7］Wandowski K，Lewandowski M.Epidemiology of ARDS［J］.Minerva Anestesiol，2006，72（6）：473-477.

［8］Odenstedt H，Aneman A，Kárason S，et al.Acute hemodynamic changes during lung recruitment in lavage and endotoxin-induced ALI［J］.Intensive Care Med，2005，31（1）：112-120.

［9］Halbertsma FJ，van der Hoeven JG.Lung recruitment during mechanieal positive pressure ventilation in the PICU：what call be learned from the literature?［J］.Anaesthesia，2005，60（8）：779-790.

［10］Frank JA，McAuley DF，Gutierrez JA，et al.Differential effects of sustained inflation in recruitment maneu alveolar epithelial and lung endothelial injury［J］.Crit Care Med，2005，33（1）：181-188.

［11］Oczenski W，H?rmann C，Keller C，et al.Recruitment maneuvera during prone positioning in patients with acute respiratory aistre syndrome［J］.Crit Care Med，2005，33（1）：54-61.

［12］Halbertsma FL，van der Hoeven JG.Lung recruitment during mechanical positive pressure ventilation in the PICU：what can be learned from the literature?［J］.Anaesthesia，2005，60（8）：779-790.

（編輯武玉欣）

Study of Sustained Inflation and Its Mechanism for Exogenous Acute Lung Injury Animal Models on
Lung Protection

WANG Yang，LIU Xiao-wei，XU Zhi-hong，ZHANGYan-fei

（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo evaluate the lung protective effect of sustained inflation（SI）and its mechanism for exogenous acute lung injury（ALI）animalmodels.MethodsExogenousacute lung injury animalmodelswere replicated using intravenous injection ofoleic acid.Immunohistochemistry and double antibody sandwich ELISA were carried out to detect IL-10 and IL-6 protein levels in lung tissues and serum.Western blot was used to detect the expression level of SP-A in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）.The expression of ICAM-1and SP-A mRNA in lung tissue was measured by reverse transcription PCR.The apoptosis of lung tissue cells was detected by flow cytometry.ResultsThe maintenance of 20 s lung recruitment method of 35 cmH2O pressure could improve PaO2and PaO2/FiO2，reduce PaCO2，and improve oxygenation and pulmonary compliance.The re-expansion effect of sustained inflation for exogenous acute lung injury was good.The IL-10 and IL-6 levels in lung tissue and serum for SI group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.The SP-A expression level of lung tissue and BALF in SI group was significantly reduced compared with the control group（P＜0.05）.Flow cytometry analysis showed that the apoptosis rate of SI group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.ConclusionSustained inflation played an important role in lung protection against exogenous ALI through inhibition of apoptosis，lightening of inflammatory response，reduction of pulmonary edema and SP-A degradation in lung tissue，as well as promotion of SP-A synthesis and secretion in pulmonary alveolus.

acute lung injury；sustained inflation；IL-10；IL-6；pulmonary surfactant；apoptosis

R655.3

A

0258-4646（2015）06-0498-05

遼寧省自然科學(xué)基金（201202284）

汪洋（1971-），男，副教授，博士. E-mail：wywxt2000@sohu.com

2015-01-14

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：