張 艷，王紅梅，蔣元琴，陳虹宇，趙瑞珍，馬東禮

（1深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518026；2重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系，重慶 400016）

呼吸系統(tǒng)疾病是兒童的常見多發(fā)病，由于兒童呼吸系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，免疫力較低，容易受到外界病原菌的感染，而且病情反復(fù)易危及生命。痰培養(yǎng)是臨床常用的診斷方法之一，但較為費時，而痰涂片檢查是一種簡單、快速的檢查方法。本研究通過對我院915份患兒痰標(biāo)本涂片和培養(yǎng)結(jié)果進行分析，旨在評估痰涂片在下呼吸道感染中的診斷價值，并對病原菌分布及耐藥性進行分析，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 915份痰標(biāo)本來自2014年3—5月下呼吸道感染住院患兒（同一患兒標(biāo)本不重復(fù)計入），其中男性584例，女性331例，年齡2 h～13歲，平均年齡（1.67±1.97）歲。痰標(biāo)本均在患兒入院后未使用抗菌藥物前采集，采集方法為使用無菌吸痰管自鼻腔或口腔插入下呼吸道，利用負壓吸引器經(jīng)吸痰管吸取。

1.2 材料與儀器 血平板及麥康凱平板由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，嗜血巧克力平板由廣州迪景微生物科技有限公司提供，PREVI Col or Gram12自動革蘭染色儀、VITEK 2 Compac全自動細菌鑒定儀及藥敏分析系統(tǒng)、β－內(nèi)酰胺酶快速檢測試劑均購自法國生物梅里埃公司。質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 29213，銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922，流感嗜血桿菌ATCC 9006，肺炎鏈球菌ATCC 49619，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 培養(yǎng)鑒定及藥敏 實驗室收到標(biāo)本后，無菌操作挑取痰中膿性部分涂成均勻薄片，待干燥后使用PREVI Color Gram12自動革蘭染色儀進行革蘭染色，同時將痰標(biāo)本立即接種于血平板、麥康凱平板及含萬古霉素的嗜血巧克力平板，接種后的血平板和嗜血巧克力平板置于35℃的CO2孵育箱中，麥康凱平板置于35℃孵育箱中，培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，對純培養(yǎng)和優(yōu)勢病原菌進行鑒定和藥物敏感性檢測，對嗜血桿菌和卡他莫拉菌僅進行β－內(nèi)酰胺酶檢測。

1.4 痰標(biāo)本質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)革蘭染色后鏡檢，確定標(biāo)本的質(zhì)量。參考《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版［1］，并結(jié)合實際工作情況，將痰涂片分為3類。第1類：白細胞＞25個／低倍視野，鱗狀上皮細胞＜10個／低倍視野，視為合格標(biāo)本；第2類：白細胞＞10個／低倍視野，鱗狀上皮細胞＜25個／低倍視野，可見數(shù)量不等的纖毛柱狀上皮細胞或者細菌種類≤3，此類為可接受標(biāo)本；第3類：白細胞＜10個／低倍視野，鱗狀上皮細胞＞25個／低倍視野，此類為不合格標(biāo)本，不納入研究范圍。

1.5 痰涂片與痰培養(yǎng)是否相符的判斷方法 參考《實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜》［2］，經(jīng)革蘭染色后，根據(jù)被炎性包裹物包裹及膿細胞吞噬的細菌形態(tài)特征為依據(jù)，將涂片與培養(yǎng)是否相符分為4類，其中第1、第2、第3類均被認為相符，第4類被認為不相符。見表1，圖1～4。

表1 痰涂片與痰培養(yǎng)是否相符的判斷方法Table 1 Methods for judging t he coincidence of sputum smear and culture

1.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用 WHONET 5.6對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 痰涂片與痰培養(yǎng)結(jié)果符合性 痰涂片與培養(yǎng)結(jié)果符合率為67.43%（617／915），具體結(jié)果見表2。

圖1 痰涂片和痰培養(yǎng)完全相符（第1類）Figure 1 Sputum smear and culture were completely consistent（category 1）

圖2 痰涂片和痰培養(yǎng)半相符（第2類）Figure 2 Sputum smear and culture were semi－consistent（category 2）

圖3 痰涂片和痰培養(yǎng)半相符（第3類）Figure 3 Sputum smear and culture were semi－consistent（category 3）

圖4 痰涂片和痰培養(yǎng)完全不相符（第4類）Figure 4 Sputum smear and culture were completely inconsistent（category 4）

表2 痰涂片與痰培養(yǎng)結(jié)果符合情況Table 2 Coincidence of sputum smear and culture results（%）

2.2 病原菌分布及藥敏結(jié)果 痰培養(yǎng)標(biāo)本陽性率為65.90%（603／915），共分離730株病原菌，按不同年齡組統(tǒng)計病原菌分布見表3。288株嗜血桿菌屬中，副流感嗜血桿菌占91.67%（264株），流感嗜血桿菌占8.33%（24株）。產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶率：副流感嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌分別為44.70%（118／264）、45.83%（11／24）、93.81%（91／97）。共分離肺炎鏈球菌178株，其對大多數(shù)抗菌藥物較敏感，對紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲口惡唑耐藥率高，具體藥敏結(jié)果見表4。

表3 各年齡組病原菌分布（株數(shù)，%）Table 3 Distribution of pathogens from children of different age groups（No.of isolates，%）

表4 肺炎鏈球菌對15種抗菌藥物的藥敏結(jié)果（%，株數(shù)）Table 4 Antimicrobial susceptibility results of Streptococcus pneumoniae to 15 kinds of antimicrobial agents（%，No.of isolates）

3 討論

對于兒童下呼吸道感染性疾病，痰培養(yǎng)和痰涂片病原學(xué)檢查是臨床常用的診斷方法之一，但培養(yǎng)較為耗時，而痰涂片檢查快速簡單。痰涂片的意義在于：（1）通過涂片能篩選出合格的標(biāo)本，提高培養(yǎng)陽性率；（2）在痰涂片鏡檢中，對于一些具有特殊形態(tài)的細菌，如革蘭陽性矛頭狀排列的肺炎鏈球菌、革蘭陰性細小的嗜血桿菌、革蘭陰性腎形成對排列的卡他莫拉菌和革蘭陽性不規(guī)則排列的葡萄球菌，當(dāng)這幾類細菌單一或大量出現(xiàn)時，可直接描述形態(tài)報告疑似菌，同時結(jié)合細菌有無被炎性包裹物包裹及膿細胞吞噬情況，及時向臨床反饋初步結(jié)果，指導(dǎo)臨床醫(yī)生提前經(jīng)驗用藥，彌補培養(yǎng)時間較長的不足，縮短患兒的治療時間。915份痰標(biāo)本涂片與培養(yǎng)結(jié)果進行比較，兩者總體符合率為67.43%，可見痰涂片對臨床有一定的診斷價值，能作為一種簡便、快速向臨床提供病原學(xué)診斷的方法，因此，細菌室工作人員在痰培養(yǎng)接種之前應(yīng)進行涂片。本研究中痰涂片與培養(yǎng)仍有32.57%不符合，可能原因為（1）涂片陰性但培養(yǎng)陽性：與痰標(biāo)本性狀有關(guān)，當(dāng)細菌被黏液包裹和細胞吞噬時不易著色；革蘭陰性菌染色與背景顏色接近，不易發(fā)現(xiàn)；一些具有莢膜的黏液型細菌如肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等，莢膜抵抗白細胞的吞噬，且有時在痰涂片中形態(tài)會發(fā)生臘腸樣等變化，不易識別。（2）涂片陽性但培養(yǎng)陰性：一些苛養(yǎng)菌如肺炎鏈球菌、嗜血桿菌等，如未及時接種容易死亡；一些生長較慢的致病菌容易被生長較快的優(yōu)勢正常菌掩蓋；另外，在涂片中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)在常規(guī)培養(yǎng)條件下無法生長的細菌被細胞吞噬時也會造成兩者結(jié)果不符，如百日咳鮑特菌、厭氧菌等。針對以上分析的原因，建議臨床應(yīng)在抽取痰標(biāo)本后及時送檢，實驗室應(yīng)及時接種培養(yǎng)，同時實驗室也應(yīng)定期組織相關(guān)的培訓(xùn)學(xué)習(xí)，提高檢驗人員的閱片水平，避免漏檢。

將730株痰培養(yǎng)病原菌按不同年齡組進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)＜1歲年齡組病原菌所占比率最高，占57.53%，1～3歲組占33.29%，4～6歲組占8.08%，≥7歲患兒僅占1.10%，說明下呼吸道感染性疾病容易發(fā)生于0～3歲嬰幼兒。痰培養(yǎng)病原菌分離居前3位的是副流感嗜血桿菌（36.17%，264株）、肺炎鏈球菌（24.38%，178株）和卡他莫拉菌（13.29%，97株），均為苛養(yǎng)菌，是兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要致病菌，與文獻報道［4］一致。各年齡組病原菌分布也有所差異，0～1歲組主要以副流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌為主，卡他莫拉菌排第4位，僅次于金黃色葡萄球菌；而1～3歲和4～6歲組均以副流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌為主。嗜血桿菌屬和卡他莫拉菌均能產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的β－內(nèi)酰胺酶（青霉素酶和頭孢菌素酶），這些酶的產(chǎn)物是導(dǎo)致β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的常見原因［5］。288株嗜血桿菌中，以副流感嗜血桿菌為主（占91.67%），其次是流感嗜血桿菌（占8.33%），其中產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的嗜血桿菌占44.79%（129株），產(chǎn)酶率高于肖啟國［6］報 道 的23.50%，低 于 何 娟 妃 等［7］報 道 的55.80%，提示嗜血桿菌屬細菌產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶比率較高，應(yīng)引起高度重視。93.81%（91／97）的卡他莫拉菌產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶，與張玲等［8］報道一致。

本組研究中，肺炎鏈球菌對青霉素敏感率為54.49%，對紅霉素耐藥率已高達96.63%，與袁紅英等［9］報道的90.48%接近，提示紅霉素已不適用于臨床肺炎鏈球菌感染的治療。肺炎鏈球菌對頭孢曲松和頭孢噻肟的敏感率分別為82.02%和77.53%，尚有較佳的抗菌活性，提示第三代頭孢仍可用于臨床肺炎鏈球菌感染（非腦膜炎）的經(jīng)驗性治療。未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺、莫西沙星耐藥的菌株。

本研究結(jié)果表明，痰涂片對臨床有一定的診斷價值，在痰培養(yǎng)接種之前應(yīng)進行涂片；重視病原學(xué)診斷，并將病原菌分布及其耐藥性為合理使用抗菌藥物提供參考，以減少耐藥菌株的形成。

［1］ 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：744－745.

［2］ 陳東科，孫長貴.實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：158.

［3］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；t wenty－second informational supplement.CLSI document M100－S22［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2012.

［4］ 張蕾，艾濤，楊亞靜，等.兒童社區(qū)獲得性肺炎病原菌分析［J］.中國感染控制雜志，2014，13（1）：50－52.

［5］ Karlowsky JA，Ver ma G，Zhanel GG，et al.Presence of ROB－1 beta－lactamase correlates with cefaclor resistance among recent isolates of Haemophil us influenzae ［J］.J Antimicrob Chemot her，2000，45（6）：871－875.

［6］ 肖啟國.嗜血桿菌的分離及耐藥性分析［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（1）：11－13.

［7］ 何娟妃，陳群英，馬巧紅.兒童下呼吸道感染病原菌的耐藥性分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014，24（2）：276－278.

［8］ 張玲，程方雄，劉瑾，等.卡他莫拉菌臨床分布及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（3）：545－546.

［9］ 袁紅英，于軍校，府偉靈，等.兒童下呼吸道感染的肺炎鏈球菌耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（10）：2127－2128.