宋爭(zhēng)昌，張 萍，陳 愉，孟 玲，趙 立

（1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000；2泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000）

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境、人體皮膚表面，屬于條件致病菌。其具有強(qiáng)大的獲得耐藥性和克隆傳播的能力，多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呈世界性流行［1］，是醫(yī)院內(nèi)流行的主要致病菌之一。近年來，在重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）中，鮑曼不動(dòng)桿菌感染發(fā)病率不斷上升，也迅速出現(xiàn)了多重耐藥菌株，這對(duì)臨床診療造成一定困難。本研究組對(duì)某院呼吸科ICU （respiratory intensive care unit， RICU）2011年11月—2012年10月住院患者標(biāo)本分離的40株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsedfiel d gel electrophoresis，PFGE）同源性及聚類分析，并總結(jié)其臨床特點(diǎn)、耐藥性及傳播特點(diǎn)，以指導(dǎo)臨床加強(qiáng)防控，提高治療有效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 40株鮑曼不動(dòng)桿菌分離自某院RICU 2011年11月—2012年10月住院且符合醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］的患者，其中34株分離自痰標(biāo)本，肺灌洗液和導(dǎo)管引流液標(biāo)本各分離3株。

1.1.2 主要試劑與儀器 蛋白酶K、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、λLadder（日本Ta Ka Ra公司）；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)科峻公司）；CHEF－Mapper XA型脈沖電泳儀、低熔點(diǎn)瓊脂糖、GIS－700D數(shù)碼圖像掃描分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）。

1.2 資料收集 收集RICU 40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者的臨床資料。

1.3 PFGE 檢測(cè)

1.3.1 增菌 細(xì)菌接種于LB肉湯振蕩培養(yǎng)過夜，12 000 r／min離心1 min；CSB緩沖液1 mL沖洗后，8 000 r／min離心5 min，棄上清。

1.3.2 DNA原位純化 應(yīng)用EC緩沖液調(diào)整菌液濁度為4麥?zhǔn)蠁挝缓?，?%低熔點(diǎn)瓊脂糖200μL迅速混勻，加入模具，4℃冰箱放置20 min；用蛋白酶K 1.5 mL進(jìn)行裂解。

1.3.3 酶切 在PF管中加入限制性內(nèi)切酶XbaⅠ50 U，37℃、24 h酶切。

1.3.4 電泳 酶切后小膠塊包埋于1%瓊脂糖凝膠中，使用CHEF Mapper XA系統(tǒng)進(jìn)行電泳。

1.3.5 染色、拍照 將凝膠置于EB溶液中染色，應(yīng)用紫外透射儀進(jìn)行拍照。

1.3.6 結(jié)果判定 參照文獻(xiàn)［3］中方法判定PFGE結(jié)果：PFGE圖譜一致，為相同菌株；1～3條帶不同，菌株間有相近關(guān)系，只有單基因的改變；4～6條帶不同，菌株間可能有相近關(guān)系，有2個(gè)基因的改變；6條及以上條帶不同，說明有3個(gè)或更多基因的變化，視為無相關(guān)性。

1.4 聚類分析 根據(jù)PFGE電泳的基因圖譜，將條帶轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，其中“1”代表有，“0”代表無。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中，應(yīng)用譜系聚類分析繪制樹狀圖。

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散（K－B）法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，敏感性判定根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者中，男性19例，女性21例；年齡16～84歲，平均67歲，其中25例年齡＞60歲；住院時(shí)間3～129 d，平均41 d；既往有高血壓、糖尿病及冠心病等不同基礎(chǔ)疾病的患者24例，氣管切開術(shù)后9例，人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后1例。

2.2 PFGE電泳結(jié)果 40株菌染色體經(jīng)酶切后，產(chǎn)生15～20條DNA片段，片段大小約為30～420 kb，見圖1。PFGE聚類分析結(jié)果顯示，分離的鮑曼不動(dòng)桿菌分為A～K共11型，其中A、B、E型為主要流行株。A型包括5株菌，分4個(gè)亞型，38及39號(hào)為同一亞型；B型包括12株菌，分7個(gè)亞型，8、14及7號(hào)為同一亞型，26及29號(hào)為同一亞型，21、33及9號(hào)為同一亞型；E型包括7株菌，分為6個(gè)亞型，31及34號(hào)為同一亞型。見圖2。

2.3 傳播特點(diǎn) 40例患者感染的鮑曼不動(dòng)桿菌主要包括A、B、E 3種基因型，菌株分離先后順序見圖3～5。圖3顯示，感染A型菌株的5例患者在住院時(shí)間上存在交叉；圖4顯示，感染B型菌株的前6例患者在住院時(shí)間上有交叉，后6例患者也存在交叉，而第7例患者于2012年6月分離出鮑曼不動(dòng)桿菌，后6例患者與分離出同種克隆菌株的前6例患者并無住院時(shí)間上的交叉；圖5顯示，感染E型菌株的7例患者在住院時(shí)間上存在交叉。耐藥率最低，為70.00%。見表1?；駻型的5株菌對(duì)亞胺培南及復(fù)方磺胺甲口惡唑敏感；基因B型的12株菌對(duì)19種抗菌藥物均耐藥；基因E型的7株菌對(duì)亞胺培南敏感。

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE圖譜Figure 1 PFGE map of A.baumannii

2.4 藥敏結(jié)果 40株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)19種常用抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示，40株菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、替卡西林／克拉維酸、頭孢唑林、頭孢替坦、氨曲南及呋喃妥因7種抗菌藥物均耐藥；對(duì)復(fù)方磺胺甲口惡唑、妥布霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素及頭孢吡肟的耐藥率較高，在87.50%～97.50%之間；對(duì)左氧氟沙星的耐藥率稍低，為77.50%；對(duì)亞胺培南

表1 40株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況Table 1 Resistance of 40 A.baumannii strains to commonly used antimicrobial agents

圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE的聚類分析Figure 2 Cluster analysis of A.baumannii PFGE

2.5 鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床特點(diǎn)及治療 40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者中，發(fā)熱24例，體溫37.5～39.5℃；咳嗽咳痰35例；氣短24例；心動(dòng)過速15例；所有患者均無胸痛及咯血癥狀，無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，肺部聽診為呼吸音粗或散在干濕性啰音。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：白細(xì)胞升高32例，血紅蛋白降低21例，血小板減少2例；尿蛋白陽(yáng)性22例；血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高8例；低蛋白血癥28例；血清肌酐升高7例。所有患者胸部放射線檢查均提示肺部多葉段炎癥。在檢出鮑曼不動(dòng)桿菌前，19例患者住ICU時(shí)間

圖3 基因A型組鮑曼不動(dòng)桿菌傳播特點(diǎn)Figure 3 Trans mission characteristics of A.baumannii with type A gene

圖5 基因E型組鮑曼不動(dòng)桿菌傳播特點(diǎn)Figure 5 Trans mission characteristics of A.baumannii with type E gene

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是廣泛分布于外界環(huán)境中的條件致病菌。由于該菌具有強(qiáng)大的傳播能力，目前已成為我國(guó)醫(yī)院感染重要的致病菌［4］。近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，耐藥率逐年增高，給臨床治療帶來了嚴(yán)峻的＞2周，14例患者氣管插管＞1周，行呼吸機(jī)治療25例，留置導(dǎo)尿管24例，全部使用過抗菌藥物，24例應(yīng)用廣譜抗菌藥物2周以上，應(yīng)用腎上腺糖皮質(zhì)激素6例。在檢出鮑曼不動(dòng)桿菌后，根據(jù)藥敏結(jié)果選用敏感抗菌藥物治療，給予患者亞胺培南或美羅培南、頭孢哌酮／舒巴坦及米諾環(huán)素等藥物聯(lián)合治療；同時(shí)予以化痰及調(diào)節(jié)免疫等治療。

圖4 基因B型組鮑曼不動(dòng)桿菌傳播特點(diǎn)Figure 4 Transmission characteristics of A.baumannii with type B gene

2.6 轉(zhuǎn)歸 12例患者死亡，其中年齡＞60歲者11例，有基礎(chǔ)疾病者8例；24例患者好轉(zhuǎn)出院；4例患者未待病情穩(wěn)定自動(dòng)出院。挑戰(zhàn)。本組40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者平均年齡達(dá)67歲，平均住院時(shí)間41 d，60%的患者有基礎(chǔ)疾病。在分離出鮑曼不動(dòng)桿菌之前，19例患者住ICU時(shí)間＞2周，長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用廣譜抗菌藥物患者達(dá)60%。25例患者病情危重行機(jī)械通氣治療，14例氣管插管，9例為氣管切開術(shù)后，患者氣道開放，更易感染病菌。氣管插管及留置導(dǎo)尿等處置，使患者感染鮑曼不動(dòng)桿菌的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加［5］。6例患者應(yīng)用過腎上腺糖皮質(zhì)激素，低蛋白血癥患者達(dá)70%。病情危重的患者機(jī)體免疫力低下，腎上腺糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，也可降低機(jī)體免疫力，使患者極易發(fā)生醫(yī)院感染。以上結(jié)果與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的鮑曼不動(dòng)桿菌危險(xiǎn)因素為住院時(shí)間長(zhǎng)、入住ICU、使用廣譜抗菌藥物、有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、創(chuàng)傷性操作等相一致。雖經(jīng)積極治療，仍有12例患者死亡，其中11例年齡＞60歲，8例有基礎(chǔ)疾病。本研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)［7］均表明，有基礎(chǔ)疾病的患者和高齡患者，其感染鮑曼不動(dòng)桿菌后的病死率較高，應(yīng)引起臨床醫(yī)生高度重視。

本組RICU患者分離的40株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨曲南、頭孢唑林、替卡西林／克拉維酸、頭孢替坦、氨芐西林／舒巴坦、呋喃妥因及氨芐西林均耐藥，臨床上針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染治療時(shí)上述藥物不作首選。舒巴坦為聯(lián)合治療藥物之一，但本研究中氨芐西林／舒巴坦耐藥率為100%，考慮其原因之一是用于藥敏試驗(yàn)的舒巴坦?jié)舛鹊?，而臨床治療時(shí)要求4～6 g／d；原因二是氨芐西林／舒巴坦的敏感性不如頭孢哌酮／舒巴坦，臨床上常用后者與亞胺培南聯(lián)合治療。亞胺培南在本研究中耐藥率為70%，與相關(guān)文獻(xiàn)［8］報(bào)道的亞胺培南耐藥率相符。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)象的不斷增加，使其臨床治療成為棘手問題，合理使用抗菌藥物是減慢其耐藥率增高的最佳途徑。

本研究PFGE圖譜及聚類分析樹圖顯示，40株鮑曼不動(dòng)桿菌主要表現(xiàn)為A、B、E基因型，為主要流行株，說明RICU中存在鮑曼不動(dòng)桿菌的克隆傳播。感染A及E基因型菌株患者在各自住院時(shí)間上均存在交叉，說明出現(xiàn)了同一醫(yī)療單元即同病房的同型菌株的克隆傳播，考慮通過醫(yī)療器械及處置時(shí)造成交叉感染的可能性大［9］。相關(guān)研究［10］也報(bào)道，環(huán)境消毒不徹底及無菌操作不規(guī)范，甚至可能造成醫(yī)院感染的暴發(fā)。感染不同型別鮑曼不動(dòng)桿菌的患者之間在住院時(shí)間上也存在交叉，考慮一為不同型別菌株的單獨(dú)感染；二為亞型之間發(fā)生了基因突變，產(chǎn)生了新亞型感染。B基因型菌株中的首株菌與末株菌分離時(shí)間間隔326 d，后6例患者與前6例患者并無住院時(shí)間上的交叉，提示鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)療環(huán)境中的長(zhǎng)期存留可能是出現(xiàn)交叉感染的主要原因。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)醫(yī)療環(huán)境的消毒和醫(yī)療器械的徹底消毒滅菌，以避免及減少醫(yī)院交叉感染的發(fā)生。

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