宋爭(zhēng)昌,張 萍,陳 愉,孟 玲,趙 立
(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院,遼寧 沈陽(yáng) 110000;2泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東 泰安 271000)
鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境、人體皮膚表面,屬于條件致病菌。其具有強(qiáng)大的獲得耐藥性和克隆傳播的能力,多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呈世界性流行[1],是醫(yī)院內(nèi)流行的主要致病菌之一。近年來,在重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)中,鮑曼不動(dòng)桿菌感染發(fā)病率不斷上升,也迅速出現(xiàn)了多重耐藥菌株,這對(duì)臨床診療造成一定困難。本研究組對(duì)某院呼吸科ICU (respiratory intensive care unit, RICU)2011年11月—2012年10月住院患者標(biāo)本分離的40株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsedfiel d gel electrophoresis,PFGE)同源性及聚類分析,并總結(jié)其臨床特點(diǎn)、耐藥性及傳播特點(diǎn),以指導(dǎo)臨床加強(qiáng)防控,提高治療有效率。
1.1 材料
1.1.1 菌株來源 40株鮑曼不動(dòng)桿菌分離自某院RICU 2011年11月—2012年10月住院且符合醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]的患者,其中34株分離自痰標(biāo)本,肺灌洗液和導(dǎo)管引流液標(biāo)本各分離3株。
1.1.2 主要試劑與儀器 蛋白酶K、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、λLadder(日本Ta Ka Ra公司);低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)科峻公司);CHEF-Mapper XA型脈沖電泳儀、低熔點(diǎn)瓊脂糖、GIS-700D數(shù)碼圖像掃描分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。
1.2 資料收集 收集RICU 40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者的臨床資料。
1.3 PFGE 檢測(cè)
1.3.1 增菌 細(xì)菌接種于LB肉湯振蕩培養(yǎng)過夜,12 000 r/min離心1 min;CSB緩沖液1 mL沖洗后,8 000 r/min離心5 min,棄上清。
1.3.2 DNA原位純化 應(yīng)用EC緩沖液調(diào)整菌液濁度為4麥?zhǔn)蠁挝缓?,?%低熔點(diǎn)瓊脂糖200μL迅速混勻,加入模具,4℃冰箱放置20 min;用蛋白酶K 1.5 mL進(jìn)行裂解。
1.3.3 酶切 在PF管中加入限制性內(nèi)切酶XbaⅠ50 U,37℃、24 h酶切。
1.3.4 電泳 酶切后小膠塊包埋于1%瓊脂糖凝膠中,使用CHEF Mapper XA系統(tǒng)進(jìn)行電泳。
1.3.5 染色、拍照 將凝膠置于EB溶液中染色,應(yīng)用紫外透射儀進(jìn)行拍照。
1.3.6 結(jié)果判定 參照文獻(xiàn)[3]中方法判定PFGE結(jié)果:PFGE圖譜一致,為相同菌株;1~3條帶不同,菌株間有相近關(guān)系,只有單基因的改變;4~6條帶不同,菌株間可能有相近關(guān)系,有2個(gè)基因的改變;6條及以上條帶不同,說明有3個(gè)或更多基因的變化,視為無相關(guān)性。
1.4 聚類分析 根據(jù)PFGE電泳的基因圖譜,將條帶轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)據(jù),其中“1”代表有,“0”代表無。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中,應(yīng)用譜系聚類分析繪制樹狀圖。
1.5 藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散(K-B)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),敏感性判定根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
2.1 一般情況 40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者中,男性19例,女性21例;年齡16~84歲,平均67歲,其中25例年齡>60歲;住院時(shí)間3~129 d,平均41 d;既往有高血壓、糖尿病及冠心病等不同基礎(chǔ)疾病的患者24例,氣管切開術(shù)后9例,人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后1例。
2.2 PFGE電泳結(jié)果 40株菌染色體經(jīng)酶切后,產(chǎn)生15~20條DNA片段,片段大小約為30~420 kb,見圖1。PFGE聚類分析結(jié)果顯示,分離的鮑曼不動(dòng)桿菌分為A~K共11型,其中A、B、E型為主要流行株。A型包括5株菌,分4個(gè)亞型,38及39號(hào)為同一亞型;B型包括12株菌,分7個(gè)亞型,8、14及7號(hào)為同一亞型,26及29號(hào)為同一亞型,21、33及9號(hào)為同一亞型;E型包括7株菌,分為6個(gè)亞型,31及34號(hào)為同一亞型。見圖2。
2.3 傳播特點(diǎn) 40例患者感染的鮑曼不動(dòng)桿菌主要包括A、B、E 3種基因型,菌株分離先后順序見圖3~5。圖3顯示,感染A型菌株的5例患者在住院時(shí)間上存在交叉;圖4顯示,感染B型菌株的前6例患者在住院時(shí)間上有交叉,后6例患者也存在交叉,而第7例患者于2012年6月分離出鮑曼不動(dòng)桿菌,后6例患者與分離出同種克隆菌株的前6例患者并無住院時(shí)間上的交叉;圖5顯示,感染E型菌株的7例患者在住院時(shí)間上存在交叉。耐藥率最低,為70.00%。見表1?;駻型的5株菌對(duì)亞胺培南及復(fù)方磺胺甲口惡唑敏感;基因B型的12株菌對(duì)19種抗菌藥物均耐藥;基因E型的7株菌對(duì)亞胺培南敏感。
圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE圖譜Figure 1 PFGE map of A.baumannii
2.4 藥敏結(jié)果 40株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)19種常用抗菌藥物的敏感性,結(jié)果顯示,40株菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢替坦、氨曲南及呋喃妥因7種抗菌藥物均耐藥;對(duì)復(fù)方磺胺甲口惡唑、妥布霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素及頭孢吡肟的耐藥率較高,在87.50%~97.50%之間;對(duì)左氧氟沙星的耐藥率稍低,為77.50%;對(duì)亞胺培南
表1 40株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況Table 1 Resistance of 40 A.baumannii strains to commonly used antimicrobial agents
圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE的聚類分析Figure 2 Cluster analysis of A.baumannii PFGE
2.5 鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床特點(diǎn)及治療 40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者中,發(fā)熱24例,體溫37.5~39.5℃;咳嗽咳痰35例;氣短24例;心動(dòng)過速15例;所有患者均無胸痛及咯血癥狀,無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,肺部聽診為呼吸音粗或散在干濕性啰音。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果:白細(xì)胞升高32例,血紅蛋白降低21例,血小板減少2例;尿蛋白陽(yáng)性22例;血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高8例;低蛋白血癥28例;血清肌酐升高7例。所有患者胸部放射線檢查均提示肺部多葉段炎癥。在檢出鮑曼不動(dòng)桿菌前,19例患者住ICU時(shí)間
圖3 基因A型組鮑曼不動(dòng)桿菌傳播特點(diǎn)Figure 3 Trans mission characteristics of A.baumannii with type A gene
圖5 基因E型組鮑曼不動(dòng)桿菌傳播特點(diǎn)Figure 5 Trans mission characteristics of A.baumannii with type E gene
鮑曼不動(dòng)桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌,是廣泛分布于外界環(huán)境中的條件致病菌。由于該菌具有強(qiáng)大的傳播能力,目前已成為我國(guó)醫(yī)院感染重要的致病菌[4]。近年來,鮑曼不動(dòng)桿菌出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象,耐藥率逐年增高,給臨床治療帶來了嚴(yán)峻的>2周,14例患者氣管插管>1周,行呼吸機(jī)治療25例,留置導(dǎo)尿管24例,全部使用過抗菌藥物,24例應(yīng)用廣譜抗菌藥物2周以上,應(yīng)用腎上腺糖皮質(zhì)激素6例。在檢出鮑曼不動(dòng)桿菌后,根據(jù)藥敏結(jié)果選用敏感抗菌藥物治療,給予患者亞胺培南或美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦及米諾環(huán)素等藥物聯(lián)合治療;同時(shí)予以化痰及調(diào)節(jié)免疫等治療。
圖4 基因B型組鮑曼不動(dòng)桿菌傳播特點(diǎn)Figure 4 Transmission characteristics of A.baumannii with type B gene
2.6 轉(zhuǎn)歸 12例患者死亡,其中年齡>60歲者11例,有基礎(chǔ)疾病者8例;24例患者好轉(zhuǎn)出院;4例患者未待病情穩(wěn)定自動(dòng)出院。挑戰(zhàn)。本組40例鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者平均年齡達(dá)67歲,平均住院時(shí)間41 d,60%的患者有基礎(chǔ)疾病。在分離出鮑曼不動(dòng)桿菌之前,19例患者住ICU時(shí)間>2周,長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用廣譜抗菌藥物患者達(dá)60%。25例患者病情危重行機(jī)械通氣治療,14例氣管插管,9例為氣管切開術(shù)后,患者氣道開放,更易感染病菌。氣管插管及留置導(dǎo)尿等處置,使患者感染鮑曼不動(dòng)桿菌的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加[5]。6例患者應(yīng)用過腎上腺糖皮質(zhì)激素,低蛋白血癥患者達(dá)70%。病情危重的患者機(jī)體免疫力低下,腎上腺糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用,也可降低機(jī)體免疫力,使患者極易發(fā)生醫(yī)院感染。以上結(jié)果與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的鮑曼不動(dòng)桿菌危險(xiǎn)因素為住院時(shí)間長(zhǎng)、入住ICU、使用廣譜抗菌藥物、有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、創(chuàng)傷性操作等相一致。雖經(jīng)積極治療,仍有12例患者死亡,其中11例年齡>60歲,8例有基礎(chǔ)疾病。本研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)[7]均表明,有基礎(chǔ)疾病的患者和高齡患者,其感染鮑曼不動(dòng)桿菌后的病死率較高,應(yīng)引起臨床醫(yī)生高度重視。
本組RICU患者分離的40株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨曲南、頭孢唑林、替卡西林/克拉維酸、頭孢替坦、氨芐西林/舒巴坦、呋喃妥因及氨芐西林均耐藥,臨床上針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染治療時(shí)上述藥物不作首選。舒巴坦為聯(lián)合治療藥物之一,但本研究中氨芐西林/舒巴坦耐藥率為100%,考慮其原因之一是用于藥敏試驗(yàn)的舒巴坦?jié)舛鹊?,而臨床治療時(shí)要求4~6 g/d;原因二是氨芐西林/舒巴坦的敏感性不如頭孢哌酮/舒巴坦,臨床上常用后者與亞胺培南聯(lián)合治療。亞胺培南在本研究中耐藥率為70%,與相關(guān)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的亞胺培南耐藥率相符。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)象的不斷增加,使其臨床治療成為棘手問題,合理使用抗菌藥物是減慢其耐藥率增高的最佳途徑。
本研究PFGE圖譜及聚類分析樹圖顯示,40株鮑曼不動(dòng)桿菌主要表現(xiàn)為A、B、E基因型,為主要流行株,說明RICU中存在鮑曼不動(dòng)桿菌的克隆傳播。感染A及E基因型菌株患者在各自住院時(shí)間上均存在交叉,說明出現(xiàn)了同一醫(yī)療單元即同病房的同型菌株的克隆傳播,考慮通過醫(yī)療器械及處置時(shí)造成交叉感染的可能性大[9]。相關(guān)研究[10]也報(bào)道,環(huán)境消毒不徹底及無菌操作不規(guī)范,甚至可能造成醫(yī)院感染的暴發(fā)。感染不同型別鮑曼不動(dòng)桿菌的患者之間在住院時(shí)間上也存在交叉,考慮一為不同型別菌株的單獨(dú)感染;二為亞型之間發(fā)生了基因突變,產(chǎn)生了新亞型感染。B基因型菌株中的首株菌與末株菌分離時(shí)間間隔326 d,后6例患者與前6例患者并無住院時(shí)間上的交叉,提示鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)療環(huán)境中的長(zhǎng)期存留可能是出現(xiàn)交叉感染的主要原因。因此,應(yīng)加強(qiáng)對(duì)醫(yī)療環(huán)境的消毒和醫(yī)療器械的徹底消毒滅菌,以避免及減少醫(yī)院交叉感染的發(fā)生。
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