李亞輝，馬艷弘，黃開紅，張宏志，劉 晨，喬月芳

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

藍(lán)莓發(fā)酵酒澄清和冷穩(wěn)定處理的響應(yīng)面優(yōu)化

李亞輝，馬艷弘*，黃開紅，張宏志，劉 晨，喬月芳

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

研究了藍(lán)莓發(fā)酵酒的澄清和穩(wěn)定處理方法。以澄清度和色度為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳處理條件為：皂土添加量0.80 mg/mL、澄清時間8 d、冷處理時間6 d，在此條件下處理后藍(lán)莓酒的澄清度和色度分別為0.749和1.128。與沒經(jīng)過處理、只進(jìn)行了澄清處理或冷處理的樣品相比，利用優(yōu)化條件處理的藍(lán)莓酒具有較好的澄清度，無潛在的蛋白破敗和色素沉淀，且在長時間瓶儲中具有良好的澄清度和色度穩(wěn)定性。此研究為藍(lán)莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

藍(lán)莓；發(fā)酵酒；澄清；穩(wěn)定；響應(yīng)面法

藍(lán)莓（Blueberry），又稱越桔、藍(lán)漿果等，是杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium spp.）多年生落葉或常綠灌木[1]。藍(lán)莓屬小漿果類果樹，世界上約有450多個品種，中國約有91個種28個變種，主要分布于東北和西南地區(qū)，兔眼藍(lán)莓在我國南方地區(qū)有一定的栽培面積[2-4]。藍(lán)莓果實(shí)酸甜可口、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，富含有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸和微量元素等，尤其是花色苷含量較為豐富[5-7]。

藍(lán)莓酒是以藍(lán)莓為原料的生物發(fā)酵制品，其最大限度地保留了藍(lán)莓果實(shí)中的營養(yǎng)成分和保健功能因子，長期飲用具有美容養(yǎng)顏、降低血脂、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、防治癌癥等功效[8-10]。目前藍(lán)莓酒釀造過程中還存在很多問題，其中化學(xué)性渾濁沉淀是最常見的問題。化學(xué)性渾濁沉淀是指經(jīng)過澄清處理后的澄清酒體重新變渾濁或產(chǎn)生沉淀，是果酒的一種病害，嚴(yán)重影響著果酒的品質(zhì)及商品形象[11-12]。澄清穩(wěn)定處理是果酒后處理中的重要步驟，也是解決果酒渾濁沉淀的主要方法。果酒澄清穩(wěn)定的處理方法主要有下膠、離心、過濾、冷處理、熱處理和添加穩(wěn)定劑等[13-16]。本研究通過對藍(lán)莓酒澄清和穩(wěn)定處理條件的優(yōu)化，以期找到一種合理有效的澄清穩(wěn)定處理方法，使藍(lán)莓酒保持較好澄清度和色度，為藍(lán)莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓酒（兔眼藍(lán)莓釀造，12.6%vol）：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所釀制；皂土、硅藻土：上海杰兔工貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV.1600PC型紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；FYL-YS-258控溫冰箱：北京福意聯(lián)電器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；ZNCL-GS數(shù)顯加熱磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓酒澄清和冷穩(wěn)定處理的操作流程及操作要點(diǎn)

澄清劑配制→澄清處理→冷穩(wěn)定處理→硅藻土過濾

澄清穩(wěn)定處理操作要點(diǎn)

（1）澄清劑的配制：皂土溶液的制備參照王英等所述方法[17]，稱取10 g皂土，加入100 mL蒸餾水在50℃水浴中軟化，浸泡24 h，用磁力攪拌器攪拌成均勻漿體。

（2）澄清處理：取一定量浸泡好的皂土在攪拌狀態(tài)下加入到藍(lán)莓酒中，使其混合均勻后靜置。

（3）冷穩(wěn)定處理：將經(jīng)澄清處理的藍(lán)莓酒放入控溫冰箱，使其溫度降至-5℃，并在此溫度下保持一段時間，然后用硅藻土過濾除去沉淀物。將經(jīng)澄清和冷穩(wěn)定處理的藍(lán)莓酒在常溫下放置2個月后搖勻測定其澄清度和色度。

1.3.2 澄清度和色度測定

澄清度的測定參照徐春等[18]所述方法：以蒸餾水作為參比，測定樣品在波長680 nm處的吸光度值表示澄清度。

色度的測定參照梁冬梅等[19]所述方法：將藍(lán)莓酒稀釋5倍，以蒸餾水為參比，測定樣品在波長420 nm、520 nm和620 nm處的吸光度值，以三者吸光度值之和表示色度。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1所述澄清穩(wěn)定處理方法，分別研究了皂土使用量（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL）、澄清時間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）和冷處理時間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）對藍(lán)莓酒澄清度和色度的影響。每個單因素試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，以皂土用量、澄清時間和冷處理時間3個因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析，以-1，0，+1分別代表自變量的低、中、高3個水平，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計見表1。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性檢驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[20-21]中所述澄清度穩(wěn)定性檢驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，主要對其銅、鐵、蛋白質(zhì)、色素和酒石酸穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。

瓶儲檢驗(yàn)：將樣品裝瓶、打塞、常溫下避光放置，分別在2、4、6、8、10和12個月后搖勻、取樣，測定其澄清度和色度。每個樣品3個重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 皂土添加量對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理后澄清度和色度

的影響

由圖1可知，隨著皂土添加量的增加，澄清度逐漸升高，色度隨著皂土添加量的增加逐漸降低，添加量＞0.8 mg/mL時澄清度變化較小，色度下降較快。說明皂土添加量對藍(lán)莓酒澄清度和色度都有較大影響，綜合考慮澄清度和色度，初步選擇皂土添加量為0.8 mg/mL。

2.1.2 皂土澄清時間對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理后澄清度和色度的影響

由圖2可知，隨著澄清時間的延長，澄清度逐漸升高，當(dāng)澄清時間＞8 d時澄清度變化較小；色度隨著澄清時間的延長逐漸降低，8 d內(nèi)色度下降較快，超過8 d時色度變化較小，初步選擇澄清時間為8 d。

2.1.3 冷處理時間對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理后澄清度和色度的影響

冷處理時間對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理后澄清度和色度的影響見圖3。由圖3可知，隨著冷處理時間的延長，澄清度逐漸升高，當(dāng)冷處理時間＞6 d時澄清度變化較??；色度隨著冷處理時間的延長有下降的趨勢，但變化較小，初步選擇冷處理時間為6 d。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，以皂土添加量（x1）、澄清時間（x2）和冷處理時間（x3）為自變量，以澄清度（y1）和色度（y2）為響應(yīng)值，對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2，對回歸模型的方差分析見表3。

利用Design-Expert軟件對表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得澄清度（y1）和色度（y2）的二次多項回歸模擬方程如下：

由表3可知，皂土添加量對澄清度和色度均具有極顯著影響；澄清時間對色度具有極顯著影響，而對澄清度影響較??；冷處理時間對澄清度具有極顯著影響，對色度有顯著影響。這說明皂土添加量和冷處理時間是澄清度的主要影響因素，澄清時間對其影響較小；皂土添加量和澄清時間是色度的主要影響因素，冷處理時間影響較小。兩個響應(yīng)值所得模型均極顯著，且失擬項在P=0.05水平上均不顯著；兩個模型的校正決定系數(shù)R2Adj分別為0.923 9和0.908 9，表明這兩個模型的擬合度較好，分別能夠解釋92.39%和90.89%響應(yīng)值的變化，說明這兩個模型能夠很好地預(yù)測澄清穩(wěn)定條件對澄清度和色度的影響。同時這兩個模型均具有較低的離散系數(shù)（coefficient of variance，CV）值，分別為0.78% 和1.30%，說明整個試驗(yàn)具有較好的精確度和可靠性。

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

以澄清度為指標(biāo)的響應(yīng)面結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，任何兩個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，皂土量對澄清度的影響比較明顯，皂土量和澄清時間的交互作用也較明顯。

以色度為指標(biāo)的響應(yīng)面結(jié)果如圖5所示（因澄清時間和冷處理時間交互作用對色度影響不明顯，響應(yīng)面不存在最高點(diǎn)，故沒有顯示此圖）。由圖5可以看出，交互因素的響應(yīng)面均存在最高點(diǎn)，皂土量對色度的影響較為明顯，其他兩個因素影響不明顯。

通過Design-Expert軟件分析優(yōu)化得到，獲得最大澄清度和最高色度時的澄清穩(wěn)定處理條件為皂土添加量0.80 mg/mL、澄清時間7.81 d、冷處理時間6.29 d，在此條件下藍(lán)莓酒澄清度和色度的預(yù)測值分別為0.758和1.139。為了驗(yàn)證回歸方程的可行性，對所得最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證試驗(yàn)。在皂土量、澄清時間和冷處理時間分別為0.80 mg/mL、8 d和6 d下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得澄清度和色度值分別為0.749±0.009和1.128±0.011，與預(yù)測值的相對誤差分別為1.19%和0.97%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

按照優(yōu)化條件對藍(lán)莓酒進(jìn)行澄清穩(wěn)定處理后，對其進(jìn)行澄清度穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。其中，對照1沒有進(jìn)行澄清和穩(wěn)定處理；對照2只進(jìn)行了澄清處理；對照3只進(jìn)行了冷處理。對照1結(jié)果說明，沒有進(jìn)行處理的藍(lán)莓酒具有潛在的蛋白破敗和色素沉淀；對照2結(jié)果說明，利用皂土進(jìn)行澄清處理可除去潛在的蛋白破敗和部分潛在的色素沉淀；對照3結(jié)果說明，冷處理可減弱潛在的蛋白破敗和除去部分潛在的色素沉淀。澄清穩(wěn)定處理樣品結(jié)果說明，澄清處理和冷處理結(jié)合可完全除去潛在的蛋白破敗和色素沉淀，可使其具有良好的澄清度穩(wěn)定性。

2.3.2 瓶儲檢驗(yàn)

對樣品和對照進(jìn)行瓶儲試驗(yàn)，以進(jìn)一步檢驗(yàn)其穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。圖6A顯示了瓶儲中藍(lán)莓酒澄清度的變化，沒有進(jìn)行處理的藍(lán)莓酒（對照1）瓶儲2個月后澄清度開始下降；只進(jìn)行澄清處理的藍(lán)莓酒（對照2）瓶儲8個月后澄清度開始下降；只進(jìn)行冷處理的藍(lán)莓酒（對照3）瓶儲4個月后澄清度開始下降；利用優(yōu)化條件處理的藍(lán)莓酒樣有較高澄清度且在瓶儲12個月內(nèi)仍保持較好澄清度。圖6B顯示了瓶儲中藍(lán)莓酒色度的變化，3個對照隨著瓶儲時間的延長色度都逐漸升高，這可能是因?yàn)槠涑吻宥认陆?，在波長420 nm、520 nm和620 nm處OD值升高造成的；經(jīng)優(yōu)化條件處理的藍(lán)莓酒樣的色度在瓶儲12個月內(nèi)較為穩(wěn)定，幾乎沒有變化。

3 結(jié)論

以澄清度和色度為指標(biāo)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理條件進(jìn)行了優(yōu)化。最佳處理條件為皂土添加量0.80 mg/mL、澄清時間8 d、冷處理時間6 d，在此條件下，藍(lán)莓酒的澄清度和色度分別為0.749和1.128。利用此條件處理的藍(lán)莓酒具有較好的澄清度、無潛在的蛋白破敗和色素沉淀，且在長時間瓶儲中具有良好的澄清度和色度穩(wěn)定性。

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Optimization of clarification and cold treatment for blueberry wine using response surface methodology

LIYahui,MAYanhong*,HUANG Kaihong,ZHANG Hongzhi,LIUChen,QIAOYuefang

(Institute of Farm Product Processing,Jiangsu Academy of AgriculturalSciences,Nanjing 210014,China)

The technology for blueberry wine clarification and stabilization was studied.Using clarity and chroma as index,the clarification and stabilization condition of blueberry wine were optimized using response surface methodology.Results showed thatthe optimum conditions for clarification and stabilization were bentonite addition 0.80 mg/mL,clarification time 8 d and cold treatment time 6 d.Under such conditions,the final clarity and chroma of blueberry wine were 0.749 and 1.128,respectively.The wine treated with the optimum method showed higher clarity compared with the wine without treatment or only with clarification or cold treatment,and it showed no potential protein and pigment precipitate.The blueberry wine afteroptimum treatmentshowed high clarity and chroma stability in a long-term bottle storage.This study provided a theoreticalbasis and technicalsupportforthe industrialproduction of blueberry wine.

blueberry;brewed wine;clarification;stabilization;response surface methodology

S567.2

A

0254-5071（2015）02-0126-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.028

2014-12-16

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后基金（6511307）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012786）

李亞輝（1985-），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵與生物技術(shù)。

*通訊作者：馬艷弘（1972-），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵與生物技術(shù)。