王 聰，王 檬，赫景鈺，王春玲，侯麗華

（天津科技大學 食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

醬油釀造風味菌株T酵母耐鹽機理的初步研究

王 聰，王 檬，赫景鈺，王春玲，侯麗華*

（天津科技大學 食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

通過模擬高滲環(huán)境來對用于醬油發(fā)酵的T酵母（Candida versatilis）耐高滲的機理進行研究。利用高效液相色譜對不同鹽度條件下胞內(nèi)甘油進行動態(tài)測定發(fā)現(xiàn)當T酵母進入到高滲環(huán)境中，胞內(nèi)的甘油在20 min之內(nèi)就迅速積累到最高值，而且16%鹽度下的含量要高于不含鹽和8%鹽度下的甘油含量。利用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）對耐高滲基因的表達變化考察發(fā)現(xiàn)GPD1和FPS1基因的表達變化趨勢與甘油的變化趨勢相吻合，表明了T酵母能夠耐高滲是由于甘油的合成迅速同時外排通道被關(guān)閉，使得胞內(nèi)甘油的含量升高，保證T酵母的正常生長。

T酵母；耐鹽機理；甘油；實時定量PCR

醬油主要通過豆粕和炒小麥混合制曲，米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物共同發(fā)酵釀造而成。參與醬油發(fā)酵比較有代表性的耐鹽產(chǎn)香酵母主要有魯氏酵母、T酵母（Candida versatilis）以及結(jié)合酵母[1-2]。在高鹽稀態(tài)釀造醬油中，T酵母作為后熟酵母可以利用醬醪中的糖類物質(zhì)生成大量的風味物質(zhì)如：乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯以及4-乙基愈瘡木酚等，這些物質(zhì)是醬油具有獨特香氣和味道的奧秘之所在[3-4]。

醬醪的成分比較復雜且具有較高的滲透壓，T酵母由于對高滲環(huán)境具有一定的抵抗能力因而在醬醪中能夠正常生長，其他雜菌的生長則受到抑制。在高滲環(huán)境中，酵母一般會通過在體內(nèi)積累一些相容性溶質(zhì)來保護細胞，防止胞內(nèi)的水分子外流。通常酵母體內(nèi)的相容性的溶質(zhì)主要分為三大類分別是：Na+/K+離子的動態(tài)平衡，氨基酸以及多羥基化合物。其中多羥基化合物研究的最多的就是甘油[5-6]。BROWN A D等[7-8]發(fā)表了對甘油和海藻糖在保護細胞內(nèi)的可溶性酶和維持細胞膜穩(wěn)定性等方面的研究成果。但是目前對魯式酵母的耐鹽機制研究比較多而T酵母的耐高滲機制的研究還很少[9-10]。

由于醬醪的成分比較復雜因此通過模擬高滲環(huán)境能夠減少其他因素產(chǎn)生的影響。本實驗采用高效液相色譜法對不同時間點不同高滲環(huán)境條件下細胞內(nèi)外的甘油含量變化進行測定，同時利用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的方法從轉(zhuǎn)錄水平上考察耐鹽相關(guān)基因的表達變化，并將甘油含量變化和耐鹽相關(guān)基因的表達變化相互結(jié)合來共同對T酵母的耐鹽機理進行初步的探討，為工業(yè)醬油的生產(chǎn)和管理提供了基礎(chǔ)的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

T酵母（Candida versatilis）：天津科技大學菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。（YPD固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉），115℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖加鹽（yeastextractpeptone dextrose with NaCl，YPDN）培養(yǎng)基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，不同含量的NaCl（實驗設(shè)計需要）115℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

酵母提取物（分析純）：美國OXOID公司；蛋白胨（分析純）、葡萄糖（分析純）：天津市化學試劑一廠；甘油標品（分析純）：博歐特天津化工貿(mào)易有限公司；乙腈（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；超純水實驗室自制（Mili-Q，美國）。

1.2 儀器與設(shè)備

721型可見分光光度計：上海舜宇衡平科學儀器有限公司；Thermo Sorvall ST 16R冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司；LG WP700微波爐：樂金電子電器有限公司；Thermo Arktic PCR儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；Bio-Rad Powerpac Basic電泳儀：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；島津LC-20AB高效液相色譜：日本島津公司；Eppendorf Mastercycler ep realplex實時定量熒光PCR系統(tǒng)：德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

以美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上提供的魯式酵母中GPD1、FPS1和GAPDH基因的序列為模板，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，目的片段合成大小約為100～200bp。GPD1上引為：5′-CTATCTGGTGCTAACTTGGC-3′，下引為：5′-AAGTATGGTCTGTGG AACAA-3′；FPS1上引為：5′-CTGACCGATCCATATACTTC-3′，下引為：5′-TCTTG CCATATTCATTGCTG-3′；GAPDH上引為5′-AGACTGT TGACGGTCCATCC-3′，下引為：5′-CCTTAGCAGCACCGG TAGAG-3′。

1.3.2 不同鹽含量下生長曲線的測定

取培養(yǎng)到對數(shù)期的T酵母菌懸液，將其按初始5×106個/mL的濃度分別接入到200 mL的0、8%、16%鹽含量的YPDN培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)。自接種時間起每隔12 h取一次樣，用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測其光密度OD值[11]。

1.3.3 酵母胞內(nèi)甘油的提取

將特定時間點取得的樣品在25℃、3 000 r/min下離心5 min，將上層培養(yǎng)液舍去。將得到的酵母菌體用1 mL冰冷的無菌水重懸，然后3 000 r/min離心3 min，重復洗滌2次。其中一管的T酵母菌菌體在80℃的烘箱中烘至質(zhì)量恒定，計算每毫升發(fā)酵液中菌體的干質(zhì)量。另外一管的T酵母菌體利用功率為700 W的微波爐進行破碎，每次微波處理時間為1 min，時間間隔為30 s。然后加入1 mL的去離子水，渦旋1 min。最后在冰浴條件下反復抽提3次，每次20 min。抽提完畢后12 000 r/min離心5 min。吸取上清液并用0.22μm的微孔濾膜過濾，過濾完成后的抽提液即可用于測定酵母胞內(nèi)甘油的含量。酵母胞內(nèi)甘油含量定義是每克菌體中所含的甘油的質(zhì)量[12-13]。

1.3.4 甘油含量的測定

（1）標準曲線的制作[14]

分別準確稱取甘油標準品1.5 g，用體積分數(shù)為70%的乙腈溶液溶解甘油并最終定容到100 mL的容量瓶中，使甘油的最終質(zhì)量濃度為15.00 mg/mL。以配制好的甘油標準液為基礎(chǔ)，分別稀釋成3 mg/mL、6 mg/mL、9 mg/mL、12 mg/mL、15 mg/mL的甘油標準液。將色譜純乙腈和去離子水按照7∶3的體積比混合均勻后，經(jīng)0.45μm的有機相微孔纖維素濾膜抽真空過濾除去流動相中的雜質(zhì)，流動相使用前超聲30 min除去空氣。待檢測器平衡之后待基線走平就可以將不同濃度的標準品按次序依次進樣，以保留時間定性，以峰面積定量。

（2）樣品種的甘油含量測定

將特定時間點得到的細胞內(nèi)外甘油樣品依次進樣，以保留時間定性，以峰面積定量。根據(jù)測得的峰面積代入到標準曲線求出樣品中甘油的含量。在分析數(shù)據(jù)時要根據(jù)具體的情況手動積分減少雜質(zhì)干擾產(chǎn)生的誤差。

（3）高效液相色譜檢測分析條件[15]

色譜柱為Inertsil氨基柱（5μm，4.6 mm×300 mm）；柱溫為30℃；流速為1.00 mL/min；檢測器為示差檢測器RID-10A；進樣量為10μL。

1.3.5 酵母核糖核酸的提取

核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的提取方法參考JINMAIJ等[16]的方法進行，提取后的RNA要立即進行電泳驗證。

1.3.6 酵母RNA的反轉(zhuǎn)錄

酵母總RNA驗證之后，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為實時定量PCR的模板。將說明書中的各組分混合到PCR管中，短暫離心后進行反轉(zhuǎn)錄。整個反轉(zhuǎn)錄的程序為：37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，重復3個循環(huán)，反轉(zhuǎn)錄完全，然后85℃處理5 s，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，然后4℃恒溫。

1.3.7 實時定量PCR

以反轉(zhuǎn)錄完成的cDNA為模板，按照TaKaRa實時定量PCR試劑盒說明書進行定量PCR試驗，按照說明分別將體系中的組成分混合到Axygen八聯(lián)管中，短暫離心后進行定量PCR實驗。整個定量PCR的程序為：95℃變性5 s。然后兩步法PCR，95℃變性5 s，50℃處理30 s，兩步法共40個循環(huán)，最后加上溶解曲線程序。以GAPDH作為內(nèi)參基因，實驗前摸索cDNA的濃度和循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系，保證基因的Ct值在18～30之內(nèi)。每次實時定量PCR要設(shè)沒有模板的陰性對照和加有內(nèi)參的陽性對照。每個基因相對于同一個模板的定量PCR重復3次。將所得的Ct值導出，按照相對定量法2-△△Ct法對基因的表達量進行計算[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽含量下生長曲線的測定

3種不同鹽含量下T酵母的生長曲線見圖1。

由圖1可知，不同鹽度條件下的酵母在12 h之后陸續(xù)進入對數(shù)期，開始進行指數(shù)規(guī)模的生長。在此之前酵母菌已經(jīng)產(chǎn)生對環(huán)境的適應(yīng)能力，因此選擇在12 h之內(nèi)選取時間點來對酵母的耐高滲能力進行研究。

2.2 甘油含量的測定

2.2.1 甘油標準曲線

利用高效液相色譜法測定甘油含量的標準曲線如圖2所示，橫坐標代表不同含量（x）的甘油標品，縱坐標代表色譜峰的峰面積（y）。

由圖2可知，甘油標準曲線的回歸方程為y=48 603x+ 1 978.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.997，說明二者線性關(guān)系良好。結(jié)果表明，高效液相色譜對甘油檢測的特異性很好，而且檢出限比較低，重復性比較好，因此可以用來作為酵母胞內(nèi)、胞外甘油含量檢測的一種比較好的方法。

2.2.2 不同鹽含量下胞內(nèi)和胞外甘油含量變化

由圖3可知，當T酵母進入到高滲環(huán)境中，胞內(nèi)的甘油開始積累，而且鹽度越高，胞內(nèi)的甘油的含量也越多。胞內(nèi)甘油含量的增加十分迅速，在無鹽、8%鹽度條件下，T酵母在進入到環(huán)境20 min左右就已經(jīng)達到了最大值，而隨后又開始緩慢下降，而在16%鹽度條件下，T酵母體內(nèi)的甘油積累最快，而且隨著時間的推移胞內(nèi)甘油含量的降低速度遠遠低于中低鹽度條件下的下降速度。說明T酵母進入環(huán)境后，細胞會通過迅速的合成甘油來保證胞內(nèi)的滲透壓，使得細胞免受損傷，而且胞外鹽度越高，胞內(nèi)甘油的含量也會越高。而在20 min左右3種鹽度條件下胞內(nèi)的甘油的含量都達到最大值，而16%鹽度下胞外甘油含量卻降低到最低值，無鹽和8%鹽度下的胞外甘油含量卻在50 min左右達到最低值。這表明了T酵母進入高滲環(huán)境后在提高胞內(nèi)甘油的合成速度同時也會從環(huán)境中積累一部分甘油來共同達到平衡內(nèi)外壓力的目的。

2.3 T酵母RNA電泳圖

圖4顯示了酵母RNA的電泳結(jié)果，第一條為28S，第二條帶為18S，第三條帶為5S。電泳結(jié)果顯示RNA提取過程發(fā)生降解，但是三條帶很清晰，反轉(zhuǎn)錄后可以作為實時定量PCR的模板。

2.4 耐鹽的基因溶解曲線

利用實時定量PCR儀對耐鹽基因的溶解曲線進行測定，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，這幾個基因的溶解曲線都是單一的重疊峰說明引物的特異性比較好。整個PCR過程的Ct值也在15～30的合理區(qū)間，因此可以用來考察這些基因在不同的cDNA模板中表達情況的變化。

2.5 不同鹽度下GPD1基因表達量變化

以起始時間GPD1基因的表達量作為參考，利用相對定量法考察不同取樣時間點GPD1基因的表達量變化情況，結(jié)果見圖6。

GPD1基因主要參與3-磷酸甘油脫氫酶的合成，是HOG-MAPK途徑介導的甘油合成的主要基因[19-20]。由圖6可知，在進入高滲環(huán)境不久，T酵母的GPD1基因的表達量開始上升并且高鹽度條件下GPD1的基因表達量明顯高于低鹽度水平下的表達量。進入環(huán)境20 min左右，GPD1在T酵母中的表達量達到最大，然后隨著培養(yǎng)時間段的延長其表達量開始緩慢的下降。通過和測定的胞內(nèi)外甘油含量的變化情況進行比對可以發(fā)現(xiàn)，在20 min左右時胞內(nèi)的甘油含量達到最高隨后開始緩慢下降而此時GPD1的表達量也達到最高值，但是由于基因表達調(diào)控相對于甘油的合成還具有一定的滯后性，所以可以推測在酵母細胞進入環(huán)境20 min后甘油的合成量仍然很高，但此時細胞膜的通透性發(fā)生改變使得部分甘油外排到環(huán)境中，實際測得胞外甘油含量的變化也印證了這一推測。

孟子見梁襄王。出，語人曰：“……卒然問曰：‘天下惡乎定？’吾對曰：‘定于一?！肽芤恢?？’對曰：‘不嗜殺人者能一之?！肽芘c之？’對曰：‘……今夫天下之人牧，未有不嗜殺人者也。如有不嗜殺人者，則天下之民皆引領(lǐng)而望之矣。誠如是也，民歸之，由水之就下，沛然誰能御之？’”[4](P207)

2.6 不同鹽度下FPS1基因表達量變化

以起始時間FPS1基因的表達量作為參考，利用相對定量法考察不同取樣時間點FPS1基因的表達量變化情況，結(jié)果見圖7。

FPS1在釀酒酵母體內(nèi)主要編碼細胞膜上的通道蛋白，屬于主體蛋白（major intrinsic protein，MIP）蛋白家族，主要參與調(diào)控甘油的外排和吸收[21-22]。由圖7可知，在進入高滲環(huán)境不久，T酵母的FPS1基因的表達量開始上升并且中低鹽度條件下FPS1的基因表達量明顯高于高鹽度水平下的表達量，而16%條件下FPS1的表達水平變化不是很大。進入環(huán)境20 min左右，F(xiàn)PS1在T酵母中的表達量達到最大，說明T酵母中的Fps1p蛋白對環(huán)境變化產(chǎn)生的影響反應(yīng)十分迅速，這可能由于Fps1p蛋白位于細胞膜上因此對環(huán)境的信號的相應(yīng)十分迅速。在60 min左右3個鹽度下的FPS1基因的表達量就大致相當，說明Fps1p蛋白在整個甘油累積的過程中的前期起著重要作用。

3 結(jié)論

甘油是T酵母平衡胞內(nèi)外滲透壓的一種重要的相容性物質(zhì)，對其有著極其重要的意義。在高滲環(huán)境中胞內(nèi)甘油的合成基本上瞬間啟動，隨著培養(yǎng)時間的延長，甘油的合成趨于平穩(wěn)。通過對GPD1和FPS1的表達量變化分析可以得知，T酵母通過加快甘油的合成以及關(guān)閉甘油外排通道來共同提高胞內(nèi)甘油的含量，維持細胞正常的生長。T酵母的耐鹽機制十分復雜，其他耐高滲相關(guān)基因的變化還需要進一步的分析。

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Preliminary study on osmotolerance mechanism of T yeast on soy sauce brewing flavor

WANG Cong,WANGMeng,HE Jingyu,WANG Chunling,HOU Lihua*

(College of Food Engineering&Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

The osmotolerance mechanism of T yeast(Candida versatilis)used in soy sauce fermentation was studied by simulating hypertonic environment.The content of intracellular glycerolin different salinity conditions was dynamically determined by HPLC.Results showed that intracellular glycerol was accumulated rapidly within 20 min and the content with 16%salinity was higher than without salt and 8%salinity.The expression changes of osmotolerance genes was considered by realtime quantitative PCR.The expression changes of GPD1 and FPS1 was identicalto the variation tend of intracellular glycerol,showing that the osmotolerance of C.versatilis due to the rapid glycerol synthesis ability and turn off of efflux channel,which increased intracellularglyceroland ensured yeastgrowth.

T yeast;osmotolerance mechanism;glycerol;realtime quantitative PCR

TS201.3

A

0254-5071（2015）02-0026-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.006

2014年全國調(diào)味品行業(yè)“安琪酵母抽提物杯”科學技術(shù)論文大賽三等獎

2014-11-10

國家自然科學基金（31371819）

王 聰（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與基因組學。

*通訊作者：侯麗華（1976-），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物。