熊 科，楊玉煥，李秀婷*

（1.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；3.北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048）

宏基因組學在木聚糖酶制劑基因新資源開發(fā)中的應用

熊 科1，2，楊玉煥1，2，李秀婷1，3*

（1.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；3.北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048）

木聚糖酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，其來源主要是從多種生物體，尤其是微生物體中通過培養(yǎng)分離得到的。目前通過常規(guī)培養(yǎng)手段只能獲取自然界約1%的微生物木聚糖酶基因資源，使得優(yōu)良木聚糖酶制劑的開發(fā)遭遇限制瓶頸。而宏基因組學研究通過提取環(huán)境中的大量微生物基因組DNA、構(gòu)建文庫并對文庫進行篩選尋找，它突破了傳統(tǒng)微生物產(chǎn)木聚糖純培養(yǎng)方法的局限，使得從環(huán)境中獲得大量非培養(yǎng)的99%的微生物基因資源成為現(xiàn)實，極大地擴展了微生物產(chǎn)木聚糖酶資源的利用空間。宏基因組學在開發(fā)具有工業(yè)應用價值的優(yōu)良木聚糖酶基因方面具有獨特優(yōu)勢，綜述了宏基因組學文庫的構(gòu)建、篩選方法以及其在木聚糖酶基因資源開發(fā)應用的情況。

宏基因組學；構(gòu)建；篩選；木聚糖酶；新基因資源

木聚糖酶是能夠催化水解木聚糖的一類在食品工業(yè)中有廣泛應用的酶制劑。目前在食品、釀酒、飼料和造紙行業(yè)被廣泛應用的不同類型和功能的木聚糖酶制劑基本都是從多種生物體中培養(yǎng)分離得到的。

目前，木聚糖酶制劑的生產(chǎn)主要由微生物發(fā)酵生產(chǎn)制備，其中包括細菌、絲狀真菌及放線菌等。這種依靠培養(yǎng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶制劑的傳統(tǒng)常規(guī)手段獲得的微生物木聚糖酶資源只占環(huán)境中不到1%的木聚糖微生物資源，99%以上的非培養(yǎng)的木聚糖酶微生物資源都無法在現(xiàn)有條件下進行培養(yǎng)篩選獲得，這樣就損失了大量的微生物物種多樣性，尤其是一些具有優(yōu)良性質(zhì)的環(huán)境微生物木聚糖酶來源，在常規(guī)條件下無法進行人工的培養(yǎng)并使其穩(wěn)定產(chǎn)酶。所以，尋找一種能夠克服傳統(tǒng)常規(guī)篩選培養(yǎng)技術(shù)的不足的研究手段是探知非培養(yǎng)木聚糖酶微生物，擴大尋找木聚糖酶制劑基因資源的必要條件。而利用宏基因組學的方法可以獲得某一環(huán)境中所有微生物的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、然后以此為基礎(chǔ)構(gòu)建基因組文庫并對文庫進行篩選，大大提高了尋找和發(fā)現(xiàn)優(yōu)良性狀木聚糖酶基因資源的概率，在木聚糖酶制劑工業(yè)生產(chǎn)上具有較大價值。

宏基因組學是通過提取某一特定環(huán)境中的所有微生物基因組DNA、構(gòu)建基因組文庫并對文庫進行篩選，尋找和發(fā)現(xiàn)新基因資源的一種方法，它繞過了微生物分離培養(yǎng)過程，成為研究環(huán)境樣品中不可培養(yǎng)微生物的有力手段，在開發(fā)具有重要工業(yè)應用價值的木聚糖酶基因方面具有獨特優(yōu)勢。為此，人們正在研究如何利用這一技術(shù)解決高效篩選未知來源的食品工業(yè)酶制劑基因資源[1]，并在異源宿主中成功表達的新研究策略[2]。本文綜述了宏基因組學的概念、宏基因文庫的構(gòu)建、篩選方法以及其在開發(fā)木聚糖酶基因研究中的應用情況。

1985年，PACE N R等[3]首次提出可以通過直接從環(huán)境樣品中提取微生物的群體基因組DNA，繞過純培養(yǎng)技術(shù)直接對其進行研究，并成功獲得了大量前所未知的微生物信息。1998年，HANDELSMAN J等[4]正式提出了宏基因組（metagenone）概念，定義為“生物環(huán)境中全部微小生物的基因組”（the genomes of the totalmicrobiota found in nature）。它包含了可培養(yǎng)和未可培養(yǎng)的微生物的基因，目前主要指環(huán)境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。

1 宏基因組學的研究過程

宏基因組學的研究過程與基因組學相似，一般包括：（1）從環(huán)境樣品中提取宏基因組DNA；（2）將DNA片段連接到合適的載體上；（3）將載體轉(zhuǎn)化到宿主細菌，建立宏基因組文庫；（4）對宏基因組文庫進行分析與篩選（見圖1）。宏基因組學與基因組學的主要區(qū)別：（1）研究對象的復雜性不同，宏基因組學的研究對象是環(huán)境樣品的宏基因組DNA，而基因組學的研究對象是某一種生物的基因組，前者比后者復雜，環(huán)境樣品的微生物多樣性越豐富，前者越復雜；（2）研究目標不同，前者要測定由多種微生物組成的復雜群體（community）的混合基因組序列，而后者通常是測定單一物種的基因組序列。

2 宏基因組文庫的構(gòu)建

目前，構(gòu)建宏基因組學文庫常用的為載體克隆文庫。載體克隆文庫的構(gòu)建沿用了分子克隆的基本原理和技術(shù)方法，并根據(jù)具體環(huán)境樣品的特點和建庫目的采用了一些特殊的步驟和對策。一般包括樣品總DNA的提取、與載體連接和克隆到宿主中。

2.1 樣品總DNA的提取和純化

環(huán)境樣品DNA的提取是文庫構(gòu)建中最重要、最關(guān)鍵的一步，不僅要盡可能地將環(huán)境中所有微生物的DNA提取出來，還要保證一定的DNA片段長度、完整性以及純度。另外，環(huán)境樣品中都含有一些可抑制分子克隆中多種酶活性的雜質(zhì)（如土壤中的腐殖酸類物質(zhì)），這些物質(zhì)也必須除去。DNA提取方法的選擇[5-6]非常重要，不同土樣、不同提取方法所提DNA的量和片段大小及完整性會有很大不同。由于土壤微生物與其他組分結(jié)合緊密，所以提取土壤DNA的難度很大[7]。

根據(jù)提取樣品總DNA前是否需分離細胞，可將提取方法分為原位裂解法和異位裂解法[8]。原位裂解法又稱直接法，是將土樣直接懸浮在裂解緩沖液中處理，然后抽提純化。此法操作簡單，成本低、DNA提取率高，但由于機械剪切作用較強，所提DNA片段較?。?～50 kb），且腐殖酸類物質(zhì)也難以徹底去除。該法通常適用于構(gòu)建小片段插入文庫（質(zhì)?；颚耸删w為載體）的DNA提取[9]。異位裂解法又稱間接法，是先采用物理方法將微生物細胞從土壤中分離出來，然后采用較溫和的方法抽提DNA，此法可獲得大片段DNA（20～500 kb），且所提DNA純度較高，但操作繁瑣，成本高，有些微生物在分離過程中可能會丟失，且溫和條件下一些細胞壁較厚的微生物DNA抽提不出來。該法通常適用于構(gòu)建大片段插入文庫（柯斯質(zhì)?；蛘呒毦斯ぽd體為載體）的DNA提取[6]。

2.2 載體的選擇

目的基因能否被有效轉(zhuǎn)入宿主細胞，并在其中高效表達，在很大程度上取決于載體[10]。載體系統(tǒng)的選擇取決于目的基因的擴增和表達，提高和調(diào)控外源基因的拷貝數(shù)和表達量[11]。用于構(gòu)建宏基因組文庫的載體很多，大致可分為質(zhì)粒載體系列、噬菌體系列如早期的λ噬菌體、黏粒（cosmid）、P1噬菌體和F黏粒（fosmid）等和人工染色體系列如酵母人工染色體（yeast artificialchromosome，YAC）、細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）和P1派生人工染色體（P1-derived artificialchromosome，PAC）等[12]。常用的載體為柯斯質(zhì)粒（cosmid）和BAC，前者允許插入片段的長度為25～35 kbp，后者約200 kbp。

2.3 宿主菌株的選擇

選擇適宜的宿主細胞是重組基因高效克隆或表達的重要條件。目前，常用宿主菌株是大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈霉菌屬（Streptomyces）或假單胞菌屬（Pseudomonas）。一些缺陷型突變體也可以作為以功能驅(qū)動為篩選方法的宏基因組文庫的宿主菌株。宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、宏基因的表達、目標性狀（如抗藥性和缺陷型），以及是否對異源表達基因產(chǎn)物有較強的相容性等因素。原核基因的表達一般選用大腸桿菌作為宿主，而宏基因組DNA中也含有真核基因，故以真核生物如酵母菌屬（Saccharomyces sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）作為宿主。

2.4 載體克隆文庫的篩選

構(gòu)建載體克隆是研究未養(yǎng)微生物，尋找新功能基因和開發(fā)獲得新活性物質(zhì)的重要新途徑[13]。目前，載體克隆文庫篩選方法大致可分為五類：（1）序列驅(qū)動篩選法；（2）功能驅(qū)動篩選法；（3）底物誘導基因表達法；（4）穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法；（5）熒光原位雜交技術(shù)篩選法。

2.4.1 序列驅(qū)動篩選法

序列篩選法根據(jù)已知相關(guān)功能基因的保守序列設(shè)計探針或聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物，通過雜交或PCR擴增篩選陽性克隆，它是基于基因的序列特征，通過核酸雜交尋找目的基因或直接對目的基因進行擴增，在一定程度上克服了功能驅(qū)動篩選法需要表達產(chǎn)物的缺點。

2.4.2 功能驅(qū)動篩選法

功能篩選法是依據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進行篩選，可用于檢測編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)。功能驅(qū)動篩選不必依賴已知的基因信息，因此可能得到新的基因和產(chǎn)物；但其受制于外源基因在宿主細胞中的表達，且因檢測手段局限，篩選工作量大、效率低，往往分析大量克隆卻僅有幾個具有活性[14-15]。因此，在實際工作中，序列驅(qū)動和功能驅(qū)動可以結(jié)合使用。

2.4.3 底物誘導基因表達法

底物誘導基因表達篩選（substrate-induced gene ex pression screening，SIGEX）是利用代謝相關(guān)基因或酶基因通常在有底物誘導的條件下才表達的原理進行篩選目的基因。底物誘導基因表達篩選用于檢測能利用各種底物誘導的分解代謝型基因，并結(jié)合生物發(fā)光技術(shù)用來篩選代謝相關(guān)基因及酶基因[16]。SIGEX篩選技術(shù)是一種高通量的篩選方法，不需要對底物進行修飾，快速經(jīng)濟，半自動化操作省時省力，適用于分離序列未知的新基因，可以檢測新型分解代謝型基因。SIGEX技術(shù)雖然能增強宏基因組文庫外源基因的表達能力，但是它也有其缺點：不能篩選組成型基因；對基因的結(jié)構(gòu)與表達方向敏感，當目的基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在基因組上相距較遠時，將不能被篩選到[17]；當活性克隆在目的基因和GFP基因之間有一個轉(zhuǎn)錄終止子時因不表達GFP而無法被流式細胞儀分析（flow cytometry analysis，F(xiàn)CAS）篩選到[16]。

2.4.4 穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法

具有相同原子序數(shù)、不同中子數(shù)目且不具放射性的元素稱為穩(wěn)定同位素（stable isotope probing，SIP）。隨著穩(wěn)定性同位素技術(shù)與分子生物學技術(shù)的結(jié)合及發(fā)展，SIP技術(shù)可以用于鑒定和分析復雜樣品中具有特定代謝功能的微生物。穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法可以對環(huán)境中某種活性微生物的核酸進行富集，進而構(gòu)建一個吸收了特定基質(zhì)而又執(zhí)行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫，極大地減少需要篩選的克隆數(shù)量[18]。

2.4.5 熒光原位雜交技術(shù)篩選法

熒光原位雜交（fluorescentin situ hybridization，F(xiàn)ISH）是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內(nèi)相應的靶DNA分子或核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下進行定量分析，以檢測特異微生物種群的存在與豐度。FISH技術(shù)可以進行樣品的原位雜交，已經(jīng)廣泛用于分子微生物生態(tài)領(lǐng)域。FISH技術(shù)已經(jīng)用于不同生態(tài)系統(tǒng)的研究中，應用穩(wěn)定同位素技術(shù)可以對環(huán)境中某些活性微生物的核酸進行富集，進而構(gòu)建宏基因組文庫，對于尋找未培養(yǎng)微生物的功能基因非常有利[19]。

3 宏基因組學在木聚糖酶基因資源研究中的應用

微生物來源的木聚糖酶由于其有良好的特性而在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上具有很大的應用潛力，因而被廣泛研究。表1為近年來國內(nèi)外利用宏基因組學篩選到新木聚糖酶的研究狀況。目前多數(shù)的木聚糖酶是來源于各類原始菌株的發(fā)酵產(chǎn)生，原始菌株產(chǎn)生的木聚糖酶優(yōu)勢在于其產(chǎn)生的是復合酶，對木聚糖的作用更為徹底。當然，運用基因工程手段來獲得木聚糖酶的研究越來越多，木聚糖酶基因在大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母等宿主中均有獲得表達，尤其是那些來自極端環(huán)境微生物的木聚糖酶，在日常條件下很難人為的培養(yǎng)并使其產(chǎn)酶，但通過基因工程的手段可以獲得目的基因并進行異源表達，在生產(chǎn)上具有很大價值，但是基因工程菌所表達的木聚糖酶較為單一，且與已知菌所產(chǎn)的木聚糖酶的同源性較高，很難獲得與常規(guī)木聚糖酶性質(zhì)相差較大、新穎性較好的木聚糖酶。而利用宏基因組學的方法可以獲得某一環(huán)境中所有微生物的基因組DNA、然后構(gòu)建基因組文庫并對文庫進行篩選，大大提高了尋找和發(fā)現(xiàn)新的木聚糖酶基因的概率。利用宏基因組學篩選木聚糖酶新資源已經(jīng)開始成為篩選研究的熱點方向。

近年來國內(nèi)外利用宏基因組學篩選到的木聚糖酶中，MO X C等[28]構(gòu)建了含約12 000個克隆子的水稻秸稈降解富集培養(yǎng)物的宏基因組文庫，從中篩選到一個新的木聚糖酶基因umxyn10A，將其導入大腸桿菌中異源表達，重組木聚糖酶Umxyn10A最適反應溫度是75℃，最適反應pH值是6.5，在65℃以下穩(wěn)定，酶活剩余80%以上，大多數(shù)的金屬離子幾乎都不會降低其酶活力，該木聚糖酶是對樺木木聚糖比較敏感的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶，具有較寬的底物特異性，能夠有效降解各種組分中含有的雜聚木聚糖，是一種多功能酶。此外，重組木聚糖酶Umxyn10A能夠徹底地將低聚木糖水解為木二糖或者木二糖和木糖的混合物，因此最終產(chǎn)物木二糖不會抑制重組木聚糖酶Umxyn10A的酶活力。二糖對人體健康和營養(yǎng)有益，OKAZAKIM等[29]發(fā)現(xiàn)木二糖是對維持人體腸道菌群有益的雙歧桿菌的選擇性生長刺激物。DEGNANBA等[30]研究表明，木二糖對雙歧桿菌的作用效果比其他低聚糖的作用效果好。而JIANG Z Q 等[31]研究表明，木二糖的生產(chǎn)成本很高，因此，利用木聚糖酶Umxyn10A制備木二糖具有應用潛力。CHENG F S等[32]從黑白花牛瘤胃宏基因組文庫中獲得的木聚糖酶Xyln-SH1在單獨存在并且高劑量2 000 U的條件下能夠有效提高小麥稈釋放阿魏酸的含量即每100 g小麥稈釋放（57.94±5.52）mg阿魏酸，Xyln-SH1的這種特性在生物降解和工業(yè)應用上具有很大潛力。NACKE H等[33]構(gòu)建了3種大片段的牧場土壤基因組文庫，功能驅(qū)動篩選到1個新的纖維素酶基因cel01 和2個新的木聚糖酶基因xyn01和xyn02，它們對應的酶在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)具有較高的酶活，特別是纖維素酶Cel01具有高酶活、pH穩(wěn)定以及較高的耐鹽性，具有工業(yè)應用價值。

4 結(jié)束語

利用宏基因組技術(shù)篩選新型木聚糖酶制劑基因資源是一種效率高、具有廣闊前景的篩選方法。環(huán)境微生物總體是一個巨大的基因資源庫，而現(xiàn)有的傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)僅僅能對其中小部分微生物基因資源進行探索，而宏基因組技術(shù)則可發(fā)掘環(huán)境中潛在生物催化劑。利用宏基因組技術(shù)從文庫中開發(fā)出高效催化及各類優(yōu)良性質(zhì)的木聚糖酶制劑，將進一步拓展該類酶制劑在食品工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、飼料、造紙等領(lǐng)域的廣泛應用。

雖然宏基基因組技術(shù)具有廣闊前景，但作為一種新興的技術(shù)手段，但宏基因組學技術(shù)并非完美無缺，還存在著一些問題有待解決。例如，基于功能的序列篩選和基于序列PCR的方法均屬于宏基因組技術(shù)。二者的共同優(yōu)點是無需依賴微生物的純培養(yǎng)；缺點是土壤基因組DNA提取過程中會有部分基因序列丟失。同時宏基因技術(shù)篩選工作量大，效率低，并且易受檢測手段的局限。在宏基因組DNA的提取方面已經(jīng)取得了一些成果，但是在宏基因組文庫的高通量篩選方面仍存在一定的難度，文庫的構(gòu)建以及載體和感受態(tài)細胞的選擇都直接影響對文庫的篩選率，而序列驅(qū)動篩選雖然獲得了大量不同種屬蛋白酶的片段，但較難獲得木聚糖酶基因全長。因而根據(jù)不同的研究目的，選擇不同的文庫構(gòu)建方法和篩選方法會比較成功獲得木聚糖酶基因。這些都仍需科研工作者對其進行不懈地深入發(fā)展和廣泛應用，使其能夠更為有效地用于探索新的微生物資源。

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Application of metagenomics in novel xylanase genes development

XIONG Ke1,2,YANGYuhuan1,2,LIXiuting1,3*

(1.BeijingLaboratoryofFoodQualityandSafety,Beijing100048,China; 2.BeijingHigherInstitutionEngineeringResearchCenterofFoodAdditivesandIngredients,Beijing100048,China; 3.BeijingKeyLaboratoryofFlavorChemistryBeijingTechnologyandBusinessUniversity(BTBU),Beijing100048,China)

Xylanase is an important industrial enzyme.It mainly originates from a variety of organisms,especially from microorganisms isolated by cultivation.Through conventionalmeans ofcultivation can only exploitabout1%xylanase genes resources of microbes in nature,making excellent xylanase enzyme encounters limiting bottleneck.Metagenomics is an advanced methodology on extracting allmicrobialgenomic DNAs directly from environmentalsamples,constructing and screening metagenomic libraries to seek novelgenes and bioactive compounds.This methodology has broken the limitation of the traditional microbe cultivation,and geta lotof 99%uncultured microbialgenes from certain environment,greatly broaden the space of microbial resource utilization.The unique advantage of metagenomics is developing functionalgenes which have importantapplication value in sociallife.This paper reviewed the conceptofmetagenomics and the library construction,meanwhile,discussed the gene screening methods and the applications ofmetagenomics in developmentof novelxylanase genes.

metagenomics;construction;screening;xylanase;novelgene resources

Q819

A

0254-5071（2015）02-0001-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.001

2015-01-06

國家自然科學基金資助項目（31371723）；北京市自然科學基金（5144026）；食品科學創(chuàng)新團隊（IDHT20130506）

熊 科（1981-），男，講師，博士，研究方向為食品生物化學。

*通訊作者：李秀婷（1970-），女，教授，博士，研究方向為微生物與酶工程。