郭文波，田童童，童軍茂，張 建

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆棉籽油脫臭餾出物酶法甲酯化工藝研究

郭文波，田童童，童軍茂，張 建*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

以新疆棉籽油脫臭餾出物為研究對象，采用Novozyme435脂肪酶催化其中的游離脂肪酸進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，通過單因素試驗對影響酯化反應(yīng)的反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間，酶用量及酸醇比4個因素進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳的工藝參數(shù)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計確定最優(yōu)的棉籽油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化反應(yīng)的工藝參數(shù)。結(jié)果表明，棉籽油脫臭餾出物甲酯化最優(yōu)工藝條件是反應(yīng)溫度60℃，酶用量62.86 plu/g，反應(yīng)時間9 h和酸醇比1.00∶1.65（g∶mL），模型預(yù)測酯化率97.27%，實(shí)際試驗值為（97.09±0.09）%，基本與預(yù)測值一致。

棉籽油脫臭餾出物；固定化脂肪酶；甲酯化

棉籽油脫臭餾出物是棉籽油精煉脫臭時產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其主要由游離脂肪酸、甘油酯、甾醇、甾醇酯、維生素E和氧化副產(chǎn)物如醛、酮、烴等組成。近年來，隨著社會生產(chǎn)力及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，我國的油脂行業(yè)也在以驚人的速度向前發(fā)展，油脂精煉生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，脫臭餾出物作為其副產(chǎn)物也在不斷的積累。通過甲酯化的處理，游離脂肪酸可以轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，甲酯化可使植物甾醇從原料中析出，過濾后可進(jìn)一步提高生育酚的純度[1-6]。

目前，用于催化脂肪酸甲酯化的試劑主要有濃硫酸、濃鹽酸、離子交換樹脂及各類脂肪酶。利用濃硫酸、濃鹽酸進(jìn)行催化有反應(yīng)時間短，成本低，酯化率高等優(yōu)點(diǎn)，其酯化率高達(dá)95%以上，且在整個反應(yīng)過程中因反應(yīng)條件較為溫和，所以生育酚幾乎都被保留下來，但硫酸與鹽酸屬于強(qiáng)酸性化學(xué)試劑，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，對生產(chǎn)設(shè)備有很強(qiáng)的腐蝕性。為避免設(shè)備的腐蝕，可采用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂作為催化劑。這樣的交換樹脂可以重復(fù)利用，酸性強(qiáng)但對設(shè)備腐蝕性極弱，樹脂孔徑較大，活性好，但也存在反應(yīng)時間較長、價格昂貴，活化及再生處理繁瑣等缺點(diǎn)。近十幾年來，各種脂肪酶在甲酯化工藝中應(yīng)用較廣，如Novozyme 435，lipozyme TL IM等。生物酶催化反應(yīng)條件溫和，選擇性高，但反應(yīng)時間普遍較長，且成本較高[7-11]。

新疆是中國重要的優(yōu)質(zhì)商品棉生產(chǎn)基地，棉花年產(chǎn)量約占全國六分之一，出口量占到一半，2013年新疆兵團(tuán)棉花播種面積達(dá)882.78萬畝，相比往年增長7.1%[12-17]。在為國家提供大量優(yōu)質(zhì)棉花的同時產(chǎn)生大量的棉籽。棉籽的主要用途是加工成棉籽油，新疆棉籽油產(chǎn)量居于全國前列，以目前新疆棉籽油產(chǎn)量40萬t來計算，脫臭餾分按植物油處理量的0.3%計算，可利用的棉籽油脫臭餾出物為1 200 t。

目前新疆棉籽油廠家僅僅把脫臭餾出物作為廢料處理，造成了這一寶貴資源的巨大浪費(fèi)，因此如何合理利用棉籽油脫臭餾出物，提高其附加值，減少脫臭餾出物對環(huán)境的污染，是新疆棉籽油加工企業(yè)亟待解決的問題。

鑒于此，本實(shí)驗以新疆棉籽油脫臭餾出物為研究對象，采用Novozyme 435脂肪酶作為催化劑，通過單因素及響應(yīng)面分析法對甲酯化的工藝參數(shù)優(yōu)化，以期棉籽油脫臭餾出物的綜合開發(fā)利用及增加其附加值提供有利的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉籽油脫臭餾出物：石河子市康龍油脂有限公司。Novozym 435酶（10 000 plu/g）（plu/g指的是每一克酶生成的月桂酸丙酯單位）：丹麥諾維信公司；無水甲醇、無水乙醇、氫氧化鉀等試劑均為分析純：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

10μL、100μL、1 000μL微量移液器：德國Eppendorf公司；FA1004電子天平：上海精科電子天平廠；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-1磁力攪拌器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3C精密酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BL-206-II高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠；1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶法甲酯化單因素試驗

稱取一定量的棉籽油脫臭餾出物樣品置于250 mL錐形瓶中，置于恒溫水浴鍋中預(yù)熱至預(yù)設(shè)溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，同時分別加入酸醇比為1∶1.00、1∶1.25、1∶1.50、1∶1.75、1∶2.00（g∶mL）及Novozym 435酶用量分別為20 plu/g、40 plu/g、60 plu/g、80 plu/g、100 plu/g以開始不同反應(yīng)時間分別是2 h、4 h、6 h、8 h、10 h的酯化反應(yīng)[13-14]。反應(yīng)過程中應(yīng)不斷的緩慢攪拌以使反應(yīng)更加充分，反應(yīng)結(jié)束后恒溫下靜置分層，然后棄去沉淀物，在真空狀態(tài)下脫水，最后測定樣品的的酸價并且計算酯化率。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

試驗對甲酯化反應(yīng)溫度，酶用量，反應(yīng)時間，酸醇比做了系統(tǒng)的單因素考察，然后利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化棉籽油脫臭餾出物甲酯化反應(yīng)的工藝參數(shù)。試驗采用Design-Expert8.0軟件的中心組合設(shè)計（centralcomposite design，CCD）原理，以反應(yīng)溫度（A），酶用量（B），反應(yīng)時間（C），酸醇比（D）4因素，以酯化率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計4因素5水平共29個試驗點(diǎn)，其中1～16為析因試驗，17～24為星點(diǎn)試驗，25～29為中心點(diǎn)試驗。星點(diǎn)試驗用來估算曲面的曲率，中心點(diǎn)試驗用來估算試驗的純誤差。所有的試驗隨機(jī)進(jìn)行，每組試驗至少重復(fù)3次。響應(yīng)面中心組合設(shè)計的因素與水平編碼如表1所示。

1.3.3 指標(biāo)測定

酸價測定方法參考GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響

將反應(yīng)溫度，酶用量和酸醇比分別設(shè)置為55℃，60 plu/g和1.00∶1.50（g∶mL），分析不同反應(yīng)時間對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著反應(yīng)時間的不斷延長，棉籽油脫臭餾出物酯化率也在不斷的增加，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到8 h時，酯化率為95.78%；10 h時酯化率為95.96%。這可能是因為酯化反應(yīng)是一個可逆的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)始終都不能進(jìn)行到底。盡管有脂肪酶的催化，但是隨著反應(yīng)時間的不斷的延長，反應(yīng)物不斷減少，產(chǎn)物不斷增加，從而使得酯化反應(yīng)受到一定程度的限制，甚至?xí)l(fā)生逆反應(yīng)。因此，棉籽油脫臭餾出物的酯化率在8 h到10 h時趨于動態(tài)平衡?？紤]到反應(yīng)效率及成本因素，反應(yīng)時間選取8 h為宜。

2.2 酶用量對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響

將反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度和酸醇比分別設(shè)置為8 h，55℃和1.00∶1.50（g∶mL），分析不同酶用量對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著酶用量的不斷增加，棉籽油脫臭餾出物的酯化率在不斷的上升，當(dāng)酶用量達(dá)到60 plu/g時，酯化率達(dá)到最高，91.62%。繼續(xù)增加脂肪酶的添加量，酯化率反而呈現(xiàn)下降的趨勢，當(dāng)酶用量為100 plu/g時，酯化率＜90%。這可能是因為酯化反應(yīng)在脂肪酶的催化作用下反應(yīng)加速，又因為該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，在正反應(yīng)增加的同時，逆反應(yīng)也在迅速增加，酶濃度過大，反應(yīng)總體系含水量過多，因此反應(yīng)向逆方向進(jìn)行，故酯化率呈現(xiàn)出下降的趨勢。綜上所述，60 plu/g為最佳酶用量。

2.3 反應(yīng)溫度對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響

將反應(yīng)時間，酶用量和酸醇比分別設(shè)置為8 h，60 plu/g 和1.00∶1.50（g∶mL），分析不同反應(yīng)溫度對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響，結(jié)果如圖3所示。

溫度不但影響酶的催化活力、穩(wěn)定性，也影響底物的狀態(tài)，酶-底物絡(luò)合物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度，而且溫度的選擇將直接關(guān)系到反應(yīng)產(chǎn)物中維生素E的含量變化。由圖3可知，在40～55℃范圍內(nèi)，脂肪酸酯化率隨著溫度的升高而增大，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到55℃時，酯化率達(dá)到最高，為93.67%。但當(dāng)溫度＞55℃時，脂肪酸酯化率出現(xiàn)下降。該脂肪酶屬于高溫酶，溫度高時其催化活力大，但是由于甲醇沸點(diǎn)為64.7℃，當(dāng)反應(yīng)溫度上升到60℃時，甲醇部分轉(zhuǎn)化為氣體形式，雖然有回流但冷凝效果不明顯，從而導(dǎo)致底物比發(fā)生變化，酯化率下降。綜上所述，55℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.4 酸醇比對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響

將反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間和酶用量分別設(shè)置為55℃，8 h 和60 plu/g，分析不同酸醇比對棉籽油脫臭餾出物酯化率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著甲醇與棉籽油脫臭餾出物的游離脂肪酸比例的不斷增加，酯化率也在隨之不斷的升高，當(dāng)游離脂肪酸與甲醇的比例為1.00∶1.50（g∶mL）時，酯化率達(dá)到最大，為95.78%。繼續(xù)增加甲醇的比例，酯化率呈現(xiàn)出下降的趨勢。當(dāng)游離脂肪酸與甲醇的比例達(dá)到1.00∶2.00（g∶mL）時，酯化率下降到92.82%。這可能是因為隨著甲醇的不斷增加使得反應(yīng)物濃度不斷加大，從而促使反應(yīng)向正方向進(jìn)行，所以酯化率一開始呈現(xiàn)上升的趨勢。繼續(xù)向反應(yīng)體系中添加甲醇，酯化率呈現(xiàn)下降的趨勢，一方面可能是由于甲醇過量致使反應(yīng)體系不能充分有效的利用，反應(yīng)物濃度高可以促進(jìn)正向反應(yīng)的進(jìn)行，另一方面過量的甲醇很有可能會使脂肪酶的催化作用減弱從而導(dǎo)致酯化率的下降。因此，酸醇比為1.00∶1.50（g∶mL）最為合適。

2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面中心組合設(shè)計試驗結(jié)果及方差分析分別如表2、表3所示。以反應(yīng)溫度（A）、酶用量（B）、反應(yīng)時間（C）、酸醇比（D）為響應(yīng)變量，以棉籽油脫臭餾出物的酯化率（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面軟件對表2給出的試驗結(jié)果進(jìn)行多元擬合，得到的酯化率的多元線性回歸方程：

Y=96.66+0.066A+0.65B+0.29C+0.27D+0.054AB+0.027AC-0.02AD-0.3BC+0.097BD+0.14CD-0.019A2-0.41B2+0.021C2-0.38D2

回歸方程中各因素對酯化率影響的顯著性由表3方差分析中的F值與概率P值來判斷，F(xiàn)值越大，P值越小，說明該因素對指標(biāo)的影響越顯著。當(dāng)P＜0.05時，影響因素對響應(yīng)值影響為差異顯著，當(dāng)P＜0.001時為差異高度顯著，P＜0.000 1時為差異極顯著[17]。方差分析表中顯示模型的P＜0.000 1，失擬項的P＞0.05，說明試驗選取的模型表現(xiàn)出高度的顯著性，失擬項不顯著，表明響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計的模型與實(shí)際試驗擬合良好。

由表3可知，4個因素中除了反應(yīng)溫度P=0.265 9＞0.05，對酯化率的影響不顯著之外，其他3個因素的P值均＜0.001，說明酶用量、反應(yīng)時間和酸醇比對酯化率都表現(xiàn)出差異高度顯著。從兩兩因素交互作用來看，從表3中還可以得出酶用量和反應(yīng)時間的交互作用（P=0.000 8＜0.001）差異高度顯著。這表明對棉籽油脫臭餾出物甲酯化影響最顯著的兩因素為酶用量和反應(yīng)時間。

2.6 響應(yīng)曲面圖

響應(yīng)面分析方法的圖形是特定的響應(yīng)面（Y）與對應(yīng)的因素X1、X2、X3、X4構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，每個響應(yīng)面對其中的兩個因素進(jìn)行分析，另外兩個因素固定在零水平?；貧w的優(yōu)化響應(yīng)曲面及等高線如圖5所示。

圖5A表明，隨著酶用量不斷增加，酯化率也在逐漸升高，然而反應(yīng)溫度則對其影響不是很顯著。圖5B明顯表現(xiàn)出酯化率增減的趨勢圖5C可以明顯看出反應(yīng)溫度對酯化率的影響是呈現(xiàn)出線性關(guān)系，而酸醇比則顯示出二次影響。隨著反應(yīng)溫度不斷升高，酯化率沒有表現(xiàn)明顯的變化，而隨著酸醇比的不斷上升，酯化率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，這說明酸醇比對酯化率有較顯著的影響。圖5D可以看出曲面的坡度比較陡，說明二者之間的交互作用對酯化率的影響特別顯著，該結(jié)果在表2方差分析中也得到驗證。圖5E可以看出酶用量和酸醇比對酯化率都表現(xiàn)出二次效應(yīng)，這個結(jié)果表明隨著酶用量和酸醇比的增加，酯化率也在不斷的上升，說明酶用量和酸醇比交互作用對酯化率的影響是非常顯著的。圖5F顯示的是反應(yīng)時間和酸醇比對酯化率的影響。結(jié)果表明，反應(yīng)時間對于酯化率沒有顯著性的影響，但是隨著酸醇比的增加酯化率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

通過響應(yīng)面軟件的優(yōu)化程序模塊對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在反應(yīng)溫度60℃，酶用量62.86 plu/g，反應(yīng)時間9 h和酸醇比1.00∶1.65（g∶mL）的條件下，模型預(yù)測酯化率可以達(dá)到97.27%。

2.7 驗證試驗

應(yīng)用響應(yīng)面軟件本身自帶的最優(yōu)工藝參數(shù)統(tǒng)計模塊，由軟件給出的最優(yōu)甲酯化工藝條件為：反應(yīng)溫度60℃，酶用量62.86 plu/g，反應(yīng)時間9 h和酸醇比1.00∶1.65（g∶mL）的條件下，模型預(yù)測酯化率可以達(dá)到97.27%。按照軟件給出的最優(yōu)工藝參數(shù)，進(jìn)行多次重復(fù)試驗，得到的酯化率為（97.09±0.09）%，說明模型預(yù)測值與試驗實(shí)際值相對偏差較小，說明本實(shí)驗所選模型具有很高的擬合性。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化棉籽油脫臭餾出物甲酯化工藝條件是反應(yīng)溫度60℃，酶用量62.86 plu/g，反應(yīng)時間9 h和酸醇比1.00∶1.65（g∶mL），模型預(yù)測酯化率97.27%，實(shí)際試驗值為（97.09±0.09）%，基本與預(yù)測值一致。

[1]朱定和，方 濤.不同來源脫臭餾出物的組成分析[J].食品科技，2010，35（7）：188-191.

[2]ISSO B,RYAN D.Extraction of a-tocopherolquinone from vegetable oil deodorizer distillate waste[J].Eur J Lipid Sci Technol,2012,114(8): 927-932.

[3]林 文，丁朝中，陳樂清，等.大豆油脫臭餾出物甲酯化工藝研究[J].化工時刊，2013，27（8）：1-4.

[4]劉博軒，郝小紅，王錦秀，等.棕櫚仁油脫臭餾出物甲酯化研究[J].中國油脂，2014，39（3）：58-60.

[5]PANPIPAT W,XU X B,GUO Z.Towards a commercially potentialprocess:enzymatic recovery of phytosterols from plant oil deodoriser distillates mixture[J].Process Biochem,2012,47(8):1256-1262.

[6]LIU Y,WANG L,YAN Y J.Cogeneration of biodiesel and tocopherols by combining from pretreatment with supercritical carbon dioxide extraction from soybean oildeodorizerdistillate[J].Chem Tech Fuels Oils, 2010,46(2):79-86.

[7]李 玲，代 斌，周振華.棉籽油脫臭餾出物中脂肪酸甲酯化工藝[J].中國油脂，2007，32（1）：46-47.

[8]雷 鵬.從棉籽油脫臭餾出物中提取維生素E[D].天津：天津大學(xué)碩士論文，2009.

[9]史學(xué)偉.棉籽油脫臭餾出物中甾醇的提取及純化研究[D].石河子：石河子大學(xué)碩士論文，2010.

[10]MEYER F,EGGERS R,OEHLKE K,et al.Application of short path distillation for recovery of polyphenols from deodorizer distillate[J]. Eur J Lipid Sci Technol,2011,113(11):1363-1374.

[11]LIU Y,WANG L.Biodiesel production from rapeseed deodorizer distllate in a packed column reactor[J].Chem Eng Process,2009,48(6): 1152-1156.

[12]谷克仁，王秀華.脫臭餾出物提取VE的酶預(yù)處理[J].中國油脂，2006，31（2）：41-43.

[13]WANG Y,WU H,ZONG MH.Improvementofbiodieselproduction by lipozyme TL IM-catalyzed methanolysis using response surface methodology and acyl migration enhancer[J].Bioresource Technol,2008, 99(15):7232-7237.

[14]潘 偉，楊德剛，楊 莉，等.新疆棉花種植面積的時空變化及適度規(guī)模研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，19（2）：415-420.

[15]楊 莉，楊德剛，張豫芳，等.新疆棉花種植面積時空格局演變特征及驅(qū)動機(jī)制研究[J].中國沙漠，2011，31（2）：476-484.

[16]王其猛.新疆棉花生產(chǎn)布局優(yōu)化研究[D].石河子：石河子大學(xué)碩士論文，2013.

[17]唐年初.豆油脫臭餾出物酶法甲酯化純化VE的研究[D].無錫：江南大學(xué)博士論文，2008.

Technology optimization of enzymatic methyl esterification of Xinjiang cottonseed oil deodorizer distillate

GUOWenbo,TIAN Tongtong,TONG Junmao,ZHANG Jian*

(College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Xinjiang cottonseed oildeodorizerdistillate was used as the material,and the Novozyme 435 lipase was employed to catalyze methylesterification of free fatty acids.The effect of different reaction temperature,reaction time,enzyme addition and acid-alcoholratio on esterification rate was optimized by single factor experiment.On the basis of single factor results,with the application of response surface methodology,the optimal process parameters of methyl esterification were optimized as follows:reaction temperature 60℃,enzyme addition 62.86 plu/g,reaction time 9 h and acid-alcoholratio 1.00∶1.65(g∶ml).The modelpredicted the esterification rate was up to 97.27%,the actualexperimentalvalue was(97.09±0.09)%, which was similarto the predicted value.

cottonseed oildeodorizerdistillate;immobilized lipase;methylesterification

TQ645.6

A

0254-5071（2015）02-0109-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.025

2015-01-01

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)工業(yè)科技攻關(guān)計劃（2014GY07）

郭文波（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品生物化學(xué)。

*通訊作者：張 建（1979-），男，副教授，博士，研究方向為食品生物化學(xué)。