劉倫倫，劉 焱1， *，瞿朝霞，羅 燦

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

抗菌肽（antibacterial peptides，ABP）是具有抗菌活性的肽類的總稱，抗菌肽不但具有廣譜的抗菌活性，而且還有抗癌、抗病毒、抗寄生蟲、促進(jìn)傷口愈合等作用，具有較大的藥用開發(fā)價(jià)值。天然抗菌肽通常是由12～100多個(gè)氨基酸殘基組成的堿性小分子多肽，水溶性好，有典型的兩親結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量大約4～10 ku。在近幾年中，抗菌肽逐漸成為免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，有望開發(fā)為新一代肽類抗菌、抗癌等藥物的來(lái)源。因此，為更好地了解抗菌肽的研究進(jìn)展和促進(jìn)抗菌肽的生產(chǎn)應(yīng)用，本文對(duì)抗菌肽的功能，純化鑒定方法，人工合成和基因工程表達(dá)進(jìn)行了綜述，以期為抗菌肽的純化鑒定、生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 抗菌肽的功能及作用機(jī)理

1.1 抗菌肽的抗菌功能

抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，大部分抗菌肽能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，其中還有一些具有抗真菌的效果。DE LATOUR F A等[1]從眼鏡蛇中提取的抗菌肽對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）具有抑菌活性；DOSLER S等[2]研究表明抗菌肽對(duì)綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗菌效果顯著且能抑制綠膿桿菌生物膜的形成，相比抗生素不易產(chǎn)生耐藥性，不同抗菌肽之間以及抗菌肽和抗生素可通過(guò)協(xié)同作用，提高抗菌效果。HWANG B等[3]從柑橘鳳蝶中提取的柑橘鳳蝶抗菌肽（papiliocin）通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧和羥自由基的積累控制白色念珠菌（Candida albicans）的凋亡。OUELLET M等[4]研究了分別由14個(gè)氨基酸和21個(gè)氨基酸組成的具有兩親性的合成抗菌肽，這兩種抗菌肽都含有亮氨酸和苯丙氨酸，但作用機(jī)理有所不同，由14個(gè)氨基酸組成的抗菌肽充當(dāng)細(xì)胞膜擾亂器的角色，引發(fā)鈣離子和鈉離子等的泄漏，而由21個(gè)氨基酸組成的抗菌肽主要是作為離子通道，且?；湹拈L(zhǎng)度和序列對(duì)抗菌活性都有影響。可以看出，不同抗菌肽的抗菌作用方式并不完全相同。到目前為止，抗菌肽的抗菌機(jī)理還不是很明確，主要被接受的理論是抗菌肽在靜電作用下吸附到病原微生物細(xì)胞膜的表面，改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞內(nèi)容物泄漏出來(lái)，從而起到了殺菌作用。

1.2 抗菌肽的抗癌功能

抗菌肽除了能抑制病原微生物生長(zhǎng)外，其抗癌活性也是研究的一個(gè)重點(diǎn)。CHEN H M等[5]合成的肽CA，CB，CB-1和CB-2不僅對(duì)大腸桿菌（E.coli）、肺炎桿菌（pneumobacillus）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）有抗菌活性，且CB-1和CB-2對(duì)HL-60血癌細(xì)胞（HL-60 leukemia）的抑制作用明顯。RIEDL S等[6]報(bào)道陽(yáng)離子型抗菌肽能通過(guò)與細(xì)胞上帶陰電荷的成分作用（磷脂酰絲氨酸、唾液酸等）識(shí)別腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞，而且腫瘤細(xì)胞上的微絨毛也能提高陽(yáng)離子型抗菌肽的識(shí)別能力，抗癌作用主要體現(xiàn)在穿透目標(biāo)細(xì)胞并破壞其細(xì)胞膜的完整性，在活體生物試驗(yàn)中，陽(yáng)離子型抗菌肽對(duì)血癌、前列腺癌、卵巢癌等癌細(xì)胞具有抗癌活性。LIN M C等[7]通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和蛋白印跡試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)從蝦中提取的一種抗菌肽（抗脂多糖因子）經(jīng)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶的激活和核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)的途徑來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞分泌前炎性細(xì)胞活素?？咕淖饔糜谀[瘤細(xì)胞，卻對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，這是非常重要的一點(diǎn)。但基于目前此類研究多集中在體外試驗(yàn)，相關(guān)基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)還不夠充實(shí)，因此還需進(jìn)一步研究。

1.3 抗菌肽的其他功能

抗菌肽不僅具有廣譜抗菌活性，且某些抗菌肽還有抗病毒活性，如哺乳動(dòng)物的防御素和兩棲動(dòng)物皮膚中提取的抗菌素。將美洲大蠊醇提物純化制成的藥物對(duì)燒傷、燙傷等外傷有較好的修復(fù)作用，目前已有多種臨床用途。據(jù)BARONI A等[8]的報(bào)道，蛙皮素也可能參與傷口的皮膚修復(fù)。α-螺旋抗菌肽除了具有抗菌等有益的活性外，也可能具有溶血活性等對(duì)機(jī)體的其他細(xì)胞毒性，POLYANSKY A A等[9]研究表明，α-螺旋抗菌肽的溶血活性與其N末端具有高度疏水性相關(guān)，因此可通過(guò)在不影響抗菌活性的前提下適當(dāng)調(diào)整N末端結(jié)構(gòu)，減少其溶血活性。

2 抗菌肽的生產(chǎn)

2.1 天然抗菌肽的分離純化

2.1.1 原料的選擇和預(yù)處理

提取首先考慮的是樣品的選擇和預(yù)處理的方法。根據(jù)大量的研究資料，抗菌肽在很多生物體內(nèi)廣泛存在，且在不同的生物中存在的部位也不一致，如哺乳動(dòng)物的血液和腸道，兩棲動(dòng)物的皮膚，魚的皮膚黏液、鰓和腸道，節(jié)肢動(dòng)物的腔體，軟體動(dòng)物的黏液和血淋巴，植物分泌液，微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物等能分離得到抗菌物質(zhì)；對(duì)于一些生物，抗菌肽自然存在于生物體內(nèi)，而在另一些生物中則需要誘導(dǎo)產(chǎn)生，如從昆蟲中提取抗菌肽，多數(shù)需要刺激，包括機(jī)械刺激，菌誘導(dǎo)刺激。

2.1.2 抗菌肽分離純化

抗菌肽一般的的分離純化步驟包括：a.溶劑提取或沉淀：包括用離心或超濾除去雜物；b.純化預(yù)處理：如排阻色譜（凝膠滲透色譜法和凝膠層析法）、離子交換層析、固相萃取等，除去鹽、陰離子的蛋白質(zhì)、脂肪物質(zhì)和其他干擾物質(zhì)；c.分析型分離：用反相高效液相色譜分離純化得到具有抗菌活性的肽。

（1）酸提法

乙酸是常用的溶劑，OVCHINNIKOVA T V等[10]用體積分?jǐn)?shù)為10%乙酸勻漿海洋底棲多毛類生物海蚯蚓（Arenicola marina），提取液4 ℃條件下25 000×g離心2 h，離心后上清液經(jīng)YM-10過(guò)濾器超濾，制備性連續(xù)酸性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳（continuous acid urea-polyacrylamide gel electrophoresis，CAU-PAGE）和反相液相色譜（reversed phase liquid chromatography，RPLC）分離出兩種亞型分子質(zhì)量為2 758.3 u的海蚯蚓抗菌肽-1（arenicin-1）和分子質(zhì)量為2 772.3 u的海蚯蚓抗菌肽-2（arenicin-2），對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有抗菌活性，其氨基酸序列為RWCVYAYVRVRGVLVRYRRCW和RWCVYAYVRIRGVLVRYRRCW，且含半胱氨酸。CHARLET M等[11]用乙酸從貽貝中提取抗菌肽貽貝屬防御素（mytilus defensins），貽貝抗菌肽（mytilins），貽貝抗真菌肽（mytimycin）。

（2）有機(jī)溶劑提取法

韓俊友[12]用體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液浸提牛蛙的皮膚，12 000 r/min 離心20 min，揮發(fā)甲醇，用Sephadex G-50凝膠層析，經(jīng)反相液相色譜純化得到2種抑菌活性肽；LI C等[13]用含0.1%三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)60%乙腈浸提綠海膽（Strongylocentrotus droebachiensis），經(jīng)反相液相色譜純化提取到了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌活性的陽(yáng)離子肽，分子質(zhì)量4.5 ku的centrocins 1和分子質(zhì)量4.4 ku的centrocins 2。KONNO K等[14]用含0.1%三氟乙酸的乙腈∶水=1∶1（V/V）的溶液從蛛蜂（Anoplius samariensis）的蜂毒中提取到了抗菌肽。STENSV?G K等[15]用同樣用含0.1%三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)60%乙腈浸提蜘蛛蟹血細(xì)胞，經(jīng)反相液相色譜純化提取到了由37個(gè)氨基酸組成抗菌肽，其N末端結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸和精氨酸，C末端結(jié)構(gòu)域含兩個(gè)雙硫鍵。

（3）硫酸銨沉淀法

LóPEZ-ABARRATEGUI C 等[16]用 含0.1% HCl 的0.6 mol/L NaCl與海螺（Cenchritis muricatus）（2∶1）勻漿，提取液4 ℃條件下10 000×g離心30 min，上清液4 ℃條件下用飽和度為100%的硫酸銨溶液攪拌1 h，得到沉淀物，10 000×g離心30 min，沉淀用pH 8.0的10 mmol/L Tris-HCl復(fù)溶并脫鹽，再用Amicon Ultra-15 超濾離心管截留分子質(zhì)量＞10 ku的物質(zhì)，溶液經(jīng)反相液相色譜純化得到抑菌活性肽。

（4）離心沉淀法

DOLASHKA-ANGELOVA P 等[17]將 海 螺（Rapana venosa）的血淋巴先于4 ℃條件下5 000×g離心30 min，除去細(xì)胞內(nèi)容物，再于4 ℃條件下30 000×g離心4 h，除去血藍(lán)蛋白，上清液分別用截留分子質(zhì)量3 ku、10 ku和30 ku的微孔濾膜過(guò)濾，分子質(zhì)量在3～10 ku的濾液經(jīng)反相液相色譜純化得到抗菌肽。王雪鵬等[18]直接用注射器從貝類體內(nèi)采集血淋巴，在4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm孔徑無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得到的物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（E.coli）、白色念珠菌（Candida albicans）有抑制作用。

雖然，從生物體中分離純化抗菌肽的方法較多，但是，都需要注意的是要保持其抗菌活性，如大部分抗菌肽是陽(yáng)離子肽，在酸性條件下穩(wěn)定性較高；且因?yàn)樗请念愇镔|(zhì)，還應(yīng)避免發(fā)生不可逆性變性。

2.2 抗菌肽的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

抗菌肽的結(jié)構(gòu)分析包括肽鏈的末端分析，氨基酸組成和序列分析，二硫鍵定位和肽段的排序，輔助因子的定位等。分析N端殘基或C端殘基來(lái)確定不同肽鏈的數(shù)量，但N端的氨基和C端的羧基被封閉，或肽鏈為環(huán)肽，分析的難度會(huì)增大。N端可采用化學(xué)方法（如丹磺酰氯與N端反應(yīng)生成的丹磺?；被徇M(jìn)行色譜法檢測(cè)）和酶法分析。肽鏈的序列分析之前需要進(jìn)行氨基酸組成，氨基酸組成分析可使用氨基酸自動(dòng)分析儀。肽的梯度測(cè)序法、質(zhì)譜法和Edman降解法分析肽鏈的序列是比較有效的方法。

一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析有利于將不同生物體或同種生物體的不同抗菌肽進(jìn)行歸類，且有利于研究抗菌肽的抗菌機(jī)理。王三山等[19]將12種抗菌肽的氨基酸序列進(jìn)行分析，不變的氨基酸有Lys6、Gln9、Gly12和Arg16，稱為一級(jí)保守氨基酸，不同的氨基酸有特定的作用，如堿性氨基酸，與細(xì)菌膜的酸性磷脂作用可能相關(guān)，Trp2和Lys6處于兩親性螺親水面的中心部分，對(duì)抗菌肽的活性非常重要，C端疏水氨基酸較多可能與穿膜作用相關(guān)。

2.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元大多數(shù)由多重氫鍵穩(wěn)定，因此穩(wěn)定性較高，規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有螺旋（最常見的是α-螺旋）、β-折疊、環(huán)形及伸展結(jié)構(gòu)。無(wú)論抗菌肽是以α-螺旋、β-折疊還是環(huán)形形式出現(xiàn)，兩親結(jié)構(gòu)（具有兩個(gè)表面，一個(gè)親水、一個(gè)疏水）是其共同特征。圓二色譜是快速確定二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，α-螺旋構(gòu)象的特征是一般在222 nm和208 nm處出現(xiàn)負(fù)帶，在192 nm處出現(xiàn)正帶；β-折疊在216 nm出現(xiàn)負(fù)帶，在接近195 nm有一正帶；不規(guī)則構(gòu)象在200 nm以下有一強(qiáng)負(fù)帶。此外，黃金豐[20]通過(guò)圓二色譜分析，發(fā)現(xiàn)多肽分子在進(jìn)入細(xì)胞膜的疏水環(huán)境中，也將被誘導(dǎo)為螺旋結(jié)構(gòu)，且多肽中心位置的氨基酸替換對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更大。傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）主要用于估計(jì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的含量。周杰等[21]利用傅里葉變換紅外光譜等方法分析出一種中國(guó)林蛙抗菌肽的主要組成是酪氨酸，天冬酰胺（天冬氨酸）和谷氨酸（谷氨酰胺）。二維核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜也是現(xiàn)在較廣泛的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)之一。夏順霞[22]對(duì)S24多肽的二維核磁共振光譜研究表明，其在水中應(yīng)該是以無(wú)規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)存在的。

2.3 抗菌肽的合成

抗菌肽的人工合成，基于對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)的了解。目前抗菌肽的結(jié)構(gòu)分類基本是：線性抗菌肽，包括α-螺旋型，β-折疊型，富含脯氨酸、精氨酸、亮氨酸和甘氨酸或組氨酸樣抗菌肽等；含分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)狀抗菌肽；多亞基抗菌肽。

基于大部分抗菌肽的特征，合成的抗菌肽一般帶陽(yáng)離子，具有兩親性（螺旋輪法），氨基酸的替換在不改變兩親性的前提下進(jìn)行，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，可截取天然抗菌肽的部分組合形成雜合肽[24-25]。

李國(guó)棟等[26]通過(guò)固相合成多肽的方法用一個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸（glycine -isoleucine-glycine，GIG）將抗菌肽cecropin A1的N端1-8序列KWKLFKKI和一段α-螺旋結(jié)構(gòu)序列相連，合成的抗菌肽抗菌活性提高了100倍。CHEN H M等[5]用肽合成儀合成肽CA，CB，CB-1和CB-2，再用樹脂，凝膠層析，反相液相色譜分離純化，純度達(dá)95%。肽CA的抗菌活性低于CB，CB-1和CB-2。CB-1和CB-2對(duì)HL-60血癌細(xì)胞（HL-60 leukemia）的抑制作用優(yōu)于CB。SHIN S H等[27]將富含亮氨酸的紅海鞘抗菌肽HG1（具有廣譜抗菌活性，但在人的血清中抗菌活性不高）替換兩個(gè)氨基酸殘基，新的異構(gòu)紅海鞘抗菌肽（haloganan）在人的血清和傷口的液體中抗菌活性高。

2.4 抗菌肽的基因工程表達(dá)

抗菌肽在生物活體中含量少，分離純化困難且也存在一些安全性問(wèn)題，人工化學(xué)合成抗菌肽的成本高，因此，研究抗菌肽的基因工程表達(dá)，有利于降低抗菌肽的生產(chǎn)成本和去除不期望的生理活性，擴(kuò)大抗菌肽的應(yīng)用價(jià)值[28]。

抗菌肽的基因工程表達(dá)一般包括三個(gè)重要內(nèi)容：抗菌肽的基因結(jié)構(gòu)分析，抗菌肽的基因表達(dá)調(diào)控及互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，Cdna）編碼，抗菌肽的基因表達(dá)系統(tǒng)。相關(guān)研究者通過(guò)融合蛋白的方法將抗菌肽的基因在大腸桿菌（E.coli）中表達(dá)，巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。張果蘋等[29]克隆了背角無(wú)齒蚌抗菌肽（theromacin）基因的cDNA 全序列，其編碼的抗菌肽的氨基酸序列與背角無(wú)齒蚌抗菌肽（theromacin）的氨基酸序列相似度達(dá)73%，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chainreaction，PCR）分析，發(fā)現(xiàn)該基因在外套膜的表達(dá)中最高。冷明壘[30]通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒，將蒼蠅抗菌肽SK84在大腸桿菌（E.coli）中表達(dá)，表達(dá)的抗菌肽對(duì)蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有一定的抗菌活性。

3 展望

抗菌肽在生物體中的含量極微，提取成本較高；抗菌肽的化學(xué)合成比較困難，基因工程雖是生產(chǎn)抗菌肽的可行方法，但是在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因，可能會(huì)造成宿主微生物死亡而不能獲得表達(dá)產(chǎn)物，以融合蛋白的方式表達(dá)抗菌肽基因，則有表達(dá)效率低的問(wèn)題等。除生產(chǎn)環(huán)節(jié)存在困難外，分離純化也存在產(chǎn)品純度不高，抗菌肽穩(wěn)定性較差等問(wèn)題。在應(yīng)用方面，抗菌肽的藥理、藥效、毒理方面的研究，還沒(méi)形成具體的理論體系，需做進(jìn)一步的研究。

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