·綜述·

帕金森病動(dòng)物模型評(píng)價(jià)及發(fā)病機(jī)制探討

張淑香，田偉，任燕冬，李玉萍，劉樹民

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)也稱震顫麻痹，是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。目前65歲以上人群患病率達(dá)1.2‰，隨年齡增高，男性稍多于女性。PD的主要臨床特征為靜止性震顫、動(dòng)作遲緩及減少、肌張力增高等，并呈進(jìn)行性加重[1]，嚴(yán)重限制病人的活動(dòng)能力及影響病人的生活質(zhì)量。其病理改變主要為黑質(zhì)和紋狀體多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性缺失，紋狀體DA遞質(zhì)減少，細(xì)胞內(nèi)嗜酸性路易小體(LB)形成。但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，因此，PD至今仍無有效的治療措施，而有效的帕金森病動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用是解釋其發(fā)病機(jī)制及新藥開發(fā)的關(guān)鍵。因此，本文就帕金森病動(dòng)物模型及其發(fā)病機(jī)制作一概述，為闡明帕金森病發(fā)病機(jī)制及藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1帕金森病動(dòng)物模型

1.1神經(jīng)毒素模型

1.1.16-羥多巴胺(6-OHDA)模型此模型是由Ungerstedt的團(tuán)隊(duì)首次建立，產(chǎn)生機(jī)制主要是6-OHDA在體內(nèi)是通過形成羥自由基和抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物I和IV，干擾ATP合成，選擇性引起DA能神經(jīng)元死亡而產(chǎn)生與PD臨床特征相近的癥狀。此模型不足之處在于操作復(fù)雜且模型動(dòng)物選擇上有一定的局限性，最適合大鼠。6-OHDA不能通過血腦屏障，因此造模時(shí)需麻醉、手術(shù)將其注入動(dòng)物腦內(nèi)，所以此模型不適合體積較小的動(dòng)物(例如小鼠)。模型成功率與注射部位及注射角度密切相關(guān)。注射部位主要有黑質(zhì)、前腦內(nèi)側(cè)束以及紋狀體，注射方法有單側(cè)單點(diǎn)注射[2]，還有雙側(cè)多位點(diǎn)注射[3]，尤以多位點(diǎn)注射效果更佳。另外是此模型不產(chǎn)生真正的Lewy體，故無法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其模型作用。多方綜合評(píng)價(jià)，此模型不是最理想的PD動(dòng)物模型。

1.1.2MPTP模型此模型與線粒體功能障礙密切相關(guān)。其機(jī)制是MPTP在腦內(nèi)與單胺氧化酶B結(jié)合，變成活性物質(zhì)甲基苯基吡啶離子(MPP+)。MPP+被DA神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)體主動(dòng)攝取到其線粒體內(nèi)，從而抑制線粒體復(fù)合物I的活性，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性、凋亡[4]。MPTP有高度脂溶性且易透過血腦屏障，所以此模型操作較簡(jiǎn)單(腹腔注射)，其指標(biāo)與臨床表征相似度較高。王茜等[5]采用腹腔注射MPTP方法建立了C57BL/6N小鼠PD模型，并運(yùn)用免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印跡等技術(shù)對(duì)紋狀體黑質(zhì)酪氨酸羥化酶、磷酸化P38、NF-κB和iNOS的表達(dá)進(jìn)行了考察，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)動(dòng)作緩慢、豎毛等典型的PD癥狀，黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元和蛋白水平也顯著減少。MPTP模型是目前最理想的PD動(dòng)物模型之一，已被廣泛的應(yīng)用于PD的實(shí)驗(yàn)研究中。

1.1.3魚藤酮模型魚藤酮是一種殺蟲劑，對(duì)中樞DA神經(jīng)系統(tǒng)有損傷作用，有實(shí)驗(yàn)采用背部皮下注射魚藤酮的方法建立PD動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)魚藤酮處理的大鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)變化，顯示出典型的帕金森病特征[6]。由于魚藤酮毒性較大，所以此模型存在制作復(fù)雜，死亡率高的缺點(diǎn)，可通過低劑量長(zhǎng)時(shí)間皮下注射魚藤酮，來成功建立PD大鼠模型。魚藤酮模型能較好地模擬PD的慢性進(jìn)行性病程和發(fā)病特點(diǎn)，已被廣泛用于PD發(fā)病機(jī)制和治療的研究[7-8]。

1.1.4其他除草劑(百枯草)模型因?yàn)槌輨┍┞斗绞脚c實(shí)際環(huán)境因素仍有一定的差距，故需對(duì)其進(jìn)一步研究。孫亞奇[9]利用載體PD95.86建立了秀麗線蟲PD模型，對(duì)α-synuclein過表達(dá)致使秀麗線蟲中毒的作用進(jìn)行考察。該研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較α-synuclein轉(zhuǎn)基因線蟲的壽命明顯縮短，運(yùn)動(dòng)能力顯著下降，生命活力減弱，出現(xiàn)PD病理特征，此模型的毒性效應(yīng)機(jī)制還不十分明確，仍需進(jìn)一步研究。

1.2遺傳基因模型

1.2.1轉(zhuǎn)基因模型高寧等[10]建立了α-synuclein野生型和突變型兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，通過顯微鏡注射的方法制備α-synuclein基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并且鑒定其轉(zhuǎn)基因首代和子代的基因型，最終得出結(jié)論：在轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦的海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)了α-synuclein陽性標(biāo)記的細(xì)胞，雖未出現(xiàn)特征性的Lewy體聚集，但出現(xiàn)行為學(xué)上的改變，說明轉(zhuǎn)基因模型建立成功。此模型在探索PD發(fā)病機(jī)制上有著重大應(yīng)用前景。

1.2.2基因剔除模型目前已經(jīng)明確Parkin、PINK1、Nurr1、DJ-1、HtrA2/Omi等基因與PD發(fā)病相關(guān)[11-12]，并且這些類型的基因模型與人類PD的病理特征表現(xiàn)上相似度極高，并且操作簡(jiǎn)便，因此可以作為藥物篩選的良好模型，具有很好的研究?jī)r(jià)值。

1.3藥物模型利血平屬于腎上腺素能神經(jīng)抑制藥，對(duì)多巴胺神經(jīng)元有抑制作用，而多巴胺神經(jīng)元可以分泌大量的多巴胺，利血平可與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行不可逆結(jié)合，導(dǎo)致囊內(nèi)多巴胺降解代謝出毒性物質(zhì)，致使細(xì)胞內(nèi)p53高度表達(dá)，并損傷細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡，最終出現(xiàn)靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等與PD相似癥狀[13]。但大量服用利血平會(huì)產(chǎn)生藥物毒性，因此不是PD的常見模型。

2帕金森病發(fā)病機(jī)制

2.1遺傳因素

2.1.1α-突觸核蛋白基因α-synuclein是一種構(gòu)成Lewy body的蛋白質(zhì)，主要在中樞神經(jīng)突觸前表達(dá)，它主要位于突觸前神經(jīng)末梢和細(xì)胞核內(nèi)，在腦內(nèi)許多部位均有表達(dá)，由于α-synuclein基因會(huì)與Fe2+等離子發(fā)生交互作用，產(chǎn)生α-synuclein家族性點(diǎn)突變，從而誘發(fā)常染色體顯性遺傳家族性帕金森病。劉鵬等[14]建立了α-synuclein基因動(dòng)物模型，并采用Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組小鼠與空白組小鼠相比其GRK5的mRNA和蛋白水平均有所增加，α-synuclein基因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)有明顯的作用，進(jìn)而推論α-synuclein基因與帕金森病發(fā)病有著密切的聯(lián)系。

2.1.2帕金森蛋白(parkin)基因Parkin基因主要分布于正常大腦組織的黑質(zhì)區(qū)，是常染色體隱性遺傳性少年型帕金森病的致病基因，Parkin蛋白是其主要產(chǎn)物，具有E3泛素-蛋白連接酶活性的作用，并且可阻斷泛素—蛋白水解酶復(fù)合體通路。其導(dǎo)致帕金森病的發(fā)病機(jī)制可能是由于Parkin的過度表達(dá)，增強(qiáng)了底物蛋白的泛素化，使其加速降解，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元的正常功能受損[15-16]。

2.1.3泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)基因UCH-L1屬于去泛素化酶家族，是腦內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)降解的作用。研究表明UCH-L1基因突變可抑制UCH-L1的活性，使中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性，蛋白水解通路及泛素循環(huán)通路發(fā)生異常，細(xì)胞內(nèi)泛素大量聚集，從而導(dǎo)致神經(jīng)元受損甚至變性。

2.1.4DJ-1基因DJ- 1基因是肽酶C56蛋白質(zhì)家族的一員，主要參與機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激過程，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激的影響。當(dāng)DJ- 1基因發(fā)生突變后，可增加氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元的損害作用。DJ- 1基因突變會(huì)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森癥。孫雙勇等[17]通過建立MPTP小鼠模型，采用側(cè)腦室注射的方法，觀察DJ- 1對(duì)MPTP致帕金森病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果表明側(cè)腦室注射DJ-1蛋白后，PD小鼠的行為學(xué)有明顯改善。從而說明DJ-1對(duì)PD小鼠神經(jīng)系統(tǒng)有一定保護(hù)作用。

2.2環(huán)境致病因素許多研究表明與MPTP相似的一些毒性物質(zhì)可能對(duì)PD發(fā)病有一定影響。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)入人體內(nèi)的毒素原MPTP經(jīng)B型單胺氧化酶(MAO-B)的催化可轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物—MPP+，MPP+將破壞線粒體呼吸鏈上的復(fù)合體及電子傳遞，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞至凋亡[18]。有研究采用MPTP為PD動(dòng)物模型，探究猴腦內(nèi)葡糖代謝情況，發(fā)現(xiàn)葡萄糖代謝顯著降低，此外隨MPTP濃度增大其毒性增強(qiáng)[19]。

2.3細(xì)胞功能障礙

2.3.1氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激在帕金森病中起著重要作用，實(shí)驗(yàn)表明帕金森病大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)抗氧化物質(zhì)的活性顯著降低，其機(jī)制可能是脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)的結(jié)果[20]。程偉平等通過建立MPTP小鼠PD模型的方法，觀察帕金森病小鼠腦內(nèi)GSH及GSH-PX的影響及行為學(xué)變化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在PD小鼠黑質(zhì)GSH含量增加，GSH-PX活性增強(qiáng)，并且出現(xiàn)PS行為學(xué)特征[21-22]。

2.3.2線粒體功能障礙線粒體是細(xì)胞中主要產(chǎn)生能量(ATP)的細(xì)胞器，被稱為“細(xì)胞動(dòng)力工廠”，大量研究發(fā)現(xiàn)帕金森病患者腦組織內(nèi)的線粒體酶復(fù)合體功能出現(xiàn)障礙，線粒體酶復(fù)合體I活性降低，從而產(chǎn)生PD樣癥狀[23]。目前發(fā)現(xiàn)的致病基因有DJ-1基因和PINK1基因，PINK1基因通過磷酸化Parkin并維持其連接酶活性，從而與PD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[24]。

2.3.3蛋白質(zhì)表達(dá)異常α-synuclein在腦組織中的含量最多，它的異常聚集是Lewy體形成的主要標(biāo)志，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠中腦的α-synuclein水平升高時(shí)，中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體多巴胺有缺失和下降的趨勢(shì)，α-synuclein在帕金森患者體內(nèi)異常增多可能導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元失活甚至凋亡。此外，α-synuclein還可以與Parkin相互作用，但其作用結(jié)果尚無定論[25]。

2.4興奮性神經(jīng)毒性作用興奮性氨基酸(EAA)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性病理機(jī)制已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，特別是在腦缺血、腦外傷、癲癇的病理過程中起著重要作用，L-谷氨酸和L-天門冬氨酸作為興奮性氨基酸的主要代表物，研究表明其毒性作用可能與DA能神經(jīng)元受損有關(guān)。如果興奮性氨基酸將產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒性。它們的主要毒性機(jī)制可能與紋狀體內(nèi)谷氨酸的變化和多巴胺分泌有關(guān)[26]。

2.5年齡老化的協(xié)同促進(jìn)作用年齡的老化是PD發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。研究發(fā)現(xiàn)隨年齡不斷增長(zhǎng)，人類腦內(nèi)的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元、紋狀體DA遞質(zhì)將逐年減少，DAD1和D2受體密度逐漸減低。但老年人患PD的人數(shù)并不是很多，說明正常生理性的DA能神經(jīng)元退變不足以引起PD。耿全現(xiàn)[27]將84例非癡呆帕金森病患者分成早期患者(年輕、老人)和晚期患者(年輕、老人)兩個(gè)段，測(cè)定他們的認(rèn)知障礙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡大的患者認(rèn)知障礙有所下降，疾病晚期患者的認(rèn)知障礙也有所下降，但是下降趨勢(shì)并不十分明顯。因此我們得出結(jié)論，年齡老化在PD的發(fā)病中只是一個(gè)協(xié)同因素，其可能與其他因素共同導(dǎo)致PD發(fā)病。

3結(jié)語

綜上所述，以上帕金森病動(dòng)物模型能夠較全面地反映PD病因及發(fā)病機(jī)制、病理特點(diǎn)，使我們對(duì)PD的發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的了解，但目前所發(fā)現(xiàn)的PD動(dòng)物模型與人類PD發(fā)病特征還有一定的差距，尤其在震顫方面，以上模型均不能較好體現(xiàn)，因此建立理想的PD動(dòng)物模型還有待進(jìn)一步的探索。就目前的研究發(fā)現(xiàn)PD發(fā)病機(jī)制是多因素、多基因相互協(xié)同的作用，至今仍沒有明確的解釋，但隨著人們對(duì)PD模型的不斷的開發(fā)與探索，相信PD的病理機(jī)制及其臨床治療研究將會(huì)有重大進(jìn)步。

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(收稿日期:2015-02-06)

通信作者：劉樹民，博士，教授，博士生導(dǎo)師，Email：keji-liu@163.com

作者簡(jiǎn)介：張淑香，博士，副研究員，Email：zsxiang1010@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81303249)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531637)；黑龍江省博士后資助項(xiàng)目(LBH-Z11017)

中圖分類號(hào)：R742.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.04.041