呼高偉，蔡 杰，余婉婷，馮朝興，王乃東，鄧治邦，王愛兵，楊 毅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128 ；2.天津市濱海新區(qū)漢沽茶淀畜牧獸醫(yī)站，天津 漢沽300480）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）是由病毒性抗原PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）引起的，臨床上以豬的呼吸和繁殖障礙為主要特征，如豬妊娠后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬死亡率升高，肥育豬生長(zhǎng)緩慢以及各年齡段豬的呼吸道疾病。目前，本病在全球范圍內(nèi)流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征列為二類動(dòng)物傳染病。

1 PR R S V 分子結(jié)構(gòu)特征

PRRSV 為不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，分子量大小約為15 kb，直徑為50～65 nm，有囊膜，包含9 個(gè)開放閱讀框（Opening Reading Frame，ORFs）（ORF1a，ORF1b 和ORF2-7）分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。關(guān)于PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的最新發(fā)現(xiàn)為研究者對(duì)PRRSV 生物學(xué)特性和疫苗的研制提供了全新的視野。PRRSV 具有高度的變異性，傳統(tǒng)疫苗效果不理想，導(dǎo)致本病愈演愈烈，危害也越來越嚴(yán)重。本文就目前有關(guān)抗PRRSV的不同類型新型疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)和設(shè)計(jì)策略進(jìn)行探討，以期為臨床實(shí)踐進(jìn)行抗PRRSV 疫苗有效選擇、對(duì)PRRSV 的控制和預(yù)防措施，提供理論指導(dǎo)。

2 新型疫苗的開發(fā)

2.1 基因工程疫苗 基因工程疫苗具有安全、可修飾性強(qiáng)、制作工藝簡(jiǎn)單、可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，針對(duì)PRRSV 的基因工程疫苗的研究的候選基因，主要是圍繞PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5 進(jìn)行的，因?yàn)镚P5 蛋白包含多個(gè)中和抗原表位。另外，GP5 是病毒的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子中存在的量多可以作為很好的免疫原。

2.1.1 DNA 疫苗 DNA 疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA（有時(shí)也可是RNA），它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，被宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。有研究證明，位于GP5 基因中和表位（表位B）上游的“誘餌”表位（表位A）明顯影響抗PRRSV 中和抗體的產(chǎn)生。Fang 等[2]通過人工修飾的方法，在GP5 基因中的“誘餌”表位（表位A）和中和抗體表位（表位B）之間插入通用型輔助性T 淋巴細(xì)胞表位（Pan DR T-helper cell epitope），以此削弱非中和表位的作用。將經(jīng)修飾后的GP5 基因制成DNA疫苗，免疫小鼠結(jié)果顯示，接種修飾GP5 基因后的DNA 疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的中和抗體水平要明顯高于野生型GP5 制成的DNA 疫苗，說明經(jīng)修飾后的GP5 的免疫原性明顯增強(qiáng)。有研究證實(shí)，將GP5 基因N-端胞外區(qū)中部分糖基化位點(diǎn)（Nlinked glycosylation site，NGS）進(jìn)行突變能增強(qiáng)體外病毒對(duì)中和抗體的敏感性和中和表位的免疫活性[3]。

2.1.2 活病毒載體疫苗 腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)可高效地傳遞和表達(dá)外源基因的能力，已得到充分證實(shí)。而且腺病毒具備病毒顆粒比較穩(wěn)定、基因組較少發(fā)生重排等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為最常用的病毒載體之一。研究者Jiang 等[4]結(jié)合上述結(jié)論，分別構(gòu)建了表達(dá)野生型GP5 和1～4 NGS 突變型：N44S、N44/51S、N30/44/51S、N30/33/44/51S 和N30/33S 的重組腺病毒。這6 種重組病毒分別接種小鼠，結(jié)果顯示，5 種表達(dá)突變型GP5 的腺病毒所誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)明顯強(qiáng)于表達(dá)野生型GP5 的腺病毒，但是它們所引起的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)卻沒有明顯差異。GP5 蛋白糖基化殘基的缺失能明顯增強(qiáng)GP5 蛋白的免疫原性，作者推斷這可能是因?yàn)樘腔瘹埢娜コ┞读薌P5 蛋白的某些中和表位。研究者Anbu K[5]利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生PRRSV 的包膜糖蛋白GP2a、GP3、GP4、GP5 蛋白，表達(dá)產(chǎn)生的抗原蛋白分子跟感染性的PRRSV 病毒顆粒極為相似。這些抗原蛋白分子能夠展示在桿狀病毒的表面，并且這種新型的桿狀病毒能將抗原分子轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入豬器官細(xì)胞內(nèi)。這種新型抗原分子，接種小鼠后，結(jié)果顯示，抗原分子能高效地誘導(dǎo)抗PRSSV 中和抗體的產(chǎn)生。

2.1.3 嵌合疫苗 主要是利用RNA 病毒反向遺傳操作系統(tǒng),構(gòu)建并拯救嵌合病毒和突變病毒來設(shè)計(jì)新型疫苗。Wang等[6]將疫苗株MLV 和強(qiáng)毒株MN184的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)互換，拯救的rMN184 和rMLV 均為致弱病毒，且rMN184 免疫接種的豬群能快速產(chǎn)生高水平抗體。

2.1.4 DIVA 疫苗 DIVA 疫苗又叫標(biāo)記疫苗，能將接種疫苗的動(dòng)物能與野毒感染的動(dòng)物區(qū)分，這有利于病原流行的監(jiān)測(cè)，也有利于豬場(chǎng)的疫病的控制和根除。Lima 等[7]首先鑒定了美洲型PRRSV NVSL 97-7895 的Nsp2 和結(jié)構(gòu)蛋白中的B 細(xì)胞抗原表位，隨后在感染性克隆中分別對(duì)Nsp2 上兩個(gè)抗原表位編碼序列進(jìn)行缺失，并拯救出突變病毒。其中一個(gè)突變病毒FLdNsp2/44 接種豬只的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變病毒也能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且檢測(cè)不到缺失表位對(duì)應(yīng)的抗體。而在親本病毒接種的豬血清中，可檢測(cè)到明顯的缺失表位對(duì)應(yīng)的抗體。因此作者認(rèn)為，該方法可用于PRRSV DIVA 疫苗的研發(fā)。

2.1.5 病毒樣顆粒亞單位疫苗 病毒樣顆粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。病毒樣粒子不含有遺傳物質(zhì)，安全性好，所以成為一種理想的預(yù)防病毒病的候選疫苗。研究者Nam等[8]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將PRRSV 的GP5 和M蛋白進(jìn)行共表達(dá)，構(gòu)建成一種VLPs。免疫接種小鼠后發(fā)現(xiàn)針對(duì)GP5 的IgG 滴度水平明顯高于對(duì)照組。接種VLPs 3 d 后進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)免疫接種4.0 μg VLPs 后的小鼠產(chǎn)生的r 干擾素水平（Interferon-gamma，IFN-r），IL-4、IL-10 細(xì)胞因子水平較對(duì)照組明顯增高。VLPs 候選疫苗的開發(fā)與研制為抗PRRSV 的疫苗研究提供了新的嘗試和思路。

2.1.6 表位疫苗 表位疫苗（Epitope Vaccine）是以抗原表位為基礎(chǔ)制備的疫苗，是近期發(fā)展起來的一種獨(dú)特的新型疫苗設(shè)計(jì)思路。研究者Chen 等[9]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白GP96 能夠增強(qiáng)PRRSV 亞單位疫苗的免疫原性。隨后，研究者Chen[10]以GP96作為免疫佐劑，人工合成PRRSV B、T 細(xì)胞表位肽段構(gòu)建成表位疫苗，研究其免疫原性。結(jié)果顯示，抗PRRSV 的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)。而且，細(xì)胞因子IL-12 和腫瘤壞死因子α分泌水平提高。高致病性藍(lán)耳病JXwn06 株攻毒接種后，豬只的臨床癥狀、病毒血癥、病理性器官損傷程度得到明顯改善。但是，這種表位疫苗卻無法針對(duì)高致病性藍(lán)耳病毒感染提供有效地持續(xù)性保護(hù)。

2.1.7 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenie plant vaccine）或植物疫苗（plant-based vaccine）是借助植物遺傳轉(zhuǎn)化載體將抗原基因?qū)胫参铮弥参锉旧砩顒?dòng)，使其在植物中表達(dá)，生產(chǎn)出能使機(jī)體獲得特異抗病能力的疫苗。Hu 等[11]將玉米愈傷組織經(jīng)過遺傳學(xué)改造，表達(dá)PRRSV 的M 蛋白，將轉(zhuǎn)基因植物提取物口服接種小鼠后結(jié)果顯示，在血清和腸道黏膜都有針對(duì)抗原的特異性中和抗體的產(chǎn)生。最后一次免疫刺激接種后，血清中中和抗體滴度達(dá)到6.7。在小鼠脾細(xì)胞中檢測(cè)出針對(duì)PRRSV 的IFN-γ的分泌。研制成功的食用疫苗，接種機(jī)體后能刺激機(jī)體黏膜免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，因此在一定程度上可以抵御經(jīng)消化道傳播的疾病，而且可以簡(jiǎn)化免疫方法，節(jié)約成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 問題與展望

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外針對(duì)PRRS 的疫苗研究非?；钴S，但PRRSV 仍然是當(dāng)今危害養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，這是值得每位研究者思考的問題。另外，針對(duì)各種不同的疫苗的免疫效果沒有一個(gè)統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研制成功的疫苗免疫原性參差不齊。PRRSV 由于其生物學(xué)特性、免疫逃避、抗原性、基因型存在廣泛的變異性等特征，導(dǎo)致其在豬群中持續(xù)性感染。這些問題，大大增加了PRRSV 疫苗研究的難度，但同時(shí)也使得更加高效、安全的疫苗研制與開發(fā)顯得得更加迫切。開發(fā)新的抗PRRSV 疫苗的新的策略和需要努力的方向是：（1）設(shè)計(jì)的疫苗以豬樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）作為靶標(biāo)，來增強(qiáng)疫苗的免疫原性[12]；（2）解決抑制協(xié)調(diào)性T 細(xì)胞的作用[13]；（3）強(qiáng)烈誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[14]，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力。另外PRRSV 存在抗體依賴性增強(qiáng)現(xiàn)象，所以不僅要能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，更重要的是能夠有效刺激豬體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，達(dá)到對(duì)豬體形成完全保護(hù)的目的。這將需要對(duì)PRRSV 的分子結(jié)構(gòu)和功能，免疫逃避機(jī)制進(jìn)行深入研究，徹底弄清其致病機(jī)理。

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