徐愛平，蔣　勇，湛淋麗（.重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校，重慶九龍坡4039；.重慶市巴南區(qū)花溪街道畜牧獸醫(yī)站，重慶巴南400045）

納米鋁佐劑禽流感疫苗（H5N1）免疫反應(yīng)性試驗(yàn)

徐愛平1，蔣勇1，湛淋麗2
（1.重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校，重慶九龍坡401329；2.重慶市巴南區(qū)花溪街道畜牧獸醫(yī)站，重慶巴南400045）

摘要：通過自制納米氫氧化鋁佐劑,免疫肉雞。檢測發(fā)現(xiàn)初期油苗吸收不良，隨著日齡的增加，油苗逐漸被吸收形成淡黃色的痕跡，而后逐漸被吸收；納米佐劑組疫苗在初期吸收良好，淡黃色的痕跡很快被吸收、肌肉表現(xiàn)潮紅。49 d時，納米組炎性細(xì)胞已經(jīng)被吸收殆盡，僅在毛細(xì)血管周圍殘存尚未被完全吸收的炎性細(xì)胞；常規(guī)鋁組的炎性細(xì)胞也明顯減少，而油苗組仍有大量炎性細(xì)胞未被吸收，炎灶明顯，說明與油苗相比，納米疫苗可以降低佐劑的副作用。

關(guān)鍵詞：禽流感；納米鋁佐劑疫苗；反應(yīng)性；免疫

高致病性禽流感（HPAI）是由A型流感病毒引起的一種禽類感染疾病的綜合征，它分布廣，傳播快，國際動物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列為必須報(bào)告疫?。╪otifiable disease），我國也將其列為一類動物疫病。該病流行已有數(shù)百年歷史，其造成的損失數(shù)不勝數(shù)。自1997年我國香港地區(qū)暴發(fā)禽流感，并發(fā)生H5N1亞型AIV致人死亡之后，該病毒致人死亡的事件頻頻發(fā)生。目前，我國防控HPAI的有效途徑是注射油乳劑滅活疫苗。但油佐劑刺激性大、不易被機(jī)體吸收，容易在注射部位形成腫塊，影響生產(chǎn)性能。另外，有研究表明，對于生長周期較短的肉雞，在其宰殺銷售之時仍有部分油佐劑殘留于機(jī)體，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此尋找副作用小的禽流感免疫保護(hù)的新型疫苗佐劑，具有重要的應(yīng)用前景。目前，納米顆粒多用作藥物載體，增加藥物的靶向性和緩釋效應(yīng)，但用做疫苗佐劑的相關(guān)報(bào)道不多。1981年Kreuter等首次將納米材料應(yīng)用于疫苗佐劑發(fā)現(xiàn)，流感病毒抗原與多聚甲基丙烯酸酯納米顆粒聚合制作的流感病毒疫苗可保護(hù)小鼠免受鼠流感病毒侵襲。1995年Kossovsky等證明，表面修飾的納米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同時使抗原結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，并能促進(jìn)淋巴集結(jié)的攝取，在兔體內(nèi)能引起強(qiáng)烈的、特異的免疫反應(yīng)。在國內(nèi)，湯承，呂風(fēng)林等將納米氫氧化鋁佐劑用于獸醫(yī)疫苗也發(fā)現(xiàn)，納米材料是一種很好的新型免疫佐劑。本文就納米疫苗的制作做簡要闡述，以及肉雞注射疫苗后的反應(yīng)進(jìn)行了觀察和檢測。

1　材料與方法

1.1主要材料禽流感標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；納米AI（OH）3佐劑；常規(guī)AI（OH）3佐劑；油佐劑啇品疫苗；滅活病毒尿囊液；禽流感病毒H5亞型熒光PCR檢測試劑盒；常用外科手術(shù)器械；數(shù)碼相機(jī)；病理實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器械（組織切片機(jī)，天平等）。

1.2納米AI（OH）3佐劑的研制采用W/O型微乳液制備納米氫氧化鋁佐劑粒子即微乳液法。配置相應(yīng)濃度與規(guī)格的試劑，在恒溫磁力攪拌器上置水浴缸，使水溫升高到50℃。調(diào)整鐵架臺。向水浴缸中燒杯依次加入：環(huán)己烷10 mL，丙三醇1 mL，無水三氯化鋁1 mL，苯扎溴銨0.3 mL；通過事先固定在鐵架臺上的分液漏斗滴加氨水（約30 滴/min，盡量緩慢滴入氨水），并用攪拌子對燒杯中的混合液進(jìn)行攪拌。再向其中加入50 mL高純水，攪拌2 h后，并逐步降低水溫。最后將做好的樣品注入高壓均質(zhì)機(jī)中，10 000 psi處理，5個循環(huán)后的處理液即為制備的納米氫氧化鋁佐劑。用激光粒度儀對其粒徑進(jìn)行測定，并用常規(guī)氫氧化鋁作為對照，最后用絡(luò)合滴定法測定納米氫氧化鋁的含量，使得鋁的含量不超過國家的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3納米AI（OH）3佐劑滅活疫苗的研制

1.3.1尿囊液抗原的測定用血凝（HA）試驗(yàn)測定尿囊液效價、熒光實(shí)時RT-PCR測定禽流感病毒陰陽性、單向放射免疫擴(kuò)散技術(shù)檢測血凝素含量，具體方法略。

1.3.2抗原離心沉降率測定分批取解凍混勻后的禽流感滅活尿囊液于離心管中，分別以6 000、7 000、8 000、9 000、12 000、15 000、18 000、20 000 r/min，離心30 min后，取上清液，用血凝試驗(yàn)（HA）方法檢測其效價。

1.3.3納米氫氧化鋁離心沉降率測定分批取0.8 mg/mL納米氫氧化鋁于離心機(jī)中，分別以600、700、800、6 000、7 000、8 000、14 000、15 000 r/min離心30 min后，取上清液，用絡(luò)合滴定法測定其鋁濃度。

1.3.4溫度、時間、鋁濃度影響吸附率的測定參照現(xiàn)行油苗抗原與佐劑配比，取解凍混勻后的滅活病毒尿囊液1份，分別加入納米氫氧化鋁液和常規(guī)氫氧化鋁液2份（鋁終濃度0.600～1.000 mg/mL），分別置25℃和4℃中搖床振蕩吸附2 h 和4 h，經(jīng)7 000 r/min離心30 min后取上清液，分別用HA試驗(yàn)、熒光RT-PCR檢測抗原，用絡(luò)合滴定法檢測鋁的濃度。

1.3.5納米和常規(guī)氫氧化鋁佐劑輔佐疫苗的制備在以上步驟篩選的最佳條件下，以尿囊液與佐劑1∶2的體積比配制疫苗，最后加入0.01%防腐劑硫柳汞，制成本試驗(yàn)中所用的疫苗。

1.4試驗(yàn)動物分組及處理500只1日齡健康榮昌青腳肉雞購自重慶市榮昌縣廣順養(yǎng)殖場，觀察并飼養(yǎng)于西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物基地。至雛雞10日齡時，逐只按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18936-2003）中血凝抑制(HI)試驗(yàn)方法檢測其AIV抗體滴度。選用母源抗體一致的動物240只，每組60只。14日齡時，第1組接種自制納米鋁佐劑禽流感H5N1滅活疫苗0.5 mL/只；第2組接種禽流感H5N1亞型油佐劑啇品疫苗0.5 mL/只；第3組接種自制常規(guī)鋁佐劑禽流感H5N1滅活疫苗0.5 mL/只；第四組注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。21日齡，35日齡時，油苗組、納米組和常規(guī)鋁佐劑組隨機(jī)抽取2只雞，脫頸處死，剝離皮膚，選取試驗(yàn)部位與對照部位進(jìn)行肉眼觀察，剖開疫苗注射部位肌肉（左側(cè)）與右側(cè)未注射疫苗部位進(jìn)行肉眼對比，并拍攝照片。另外，21、35、49日齡分別選取試驗(yàn)部位典型部分取肌肉組織塊進(jìn)行常規(guī)切片。

2　結(jié)果與分析

2.1眼觀檢查見中插彩版圖1～3。

由圖1～3可知，納米組疫苗吸收很快，21日齡能看見少許未吸收的疫苗，但35日齡時疫苗基本吸收，注射部位無明顯可見的殘余物；常規(guī)鋁組21日齡可見吸收不完全的淡黃色殘余物，35日齡時油苗組疫苗才基本吸收，只見少量剩余的淡黃色殘余物；而油苗組21日齡注射部位可以看到明顯沒有吸收的油苗，剖開之后乳白色未吸收油苗清晰可見，甚至是35日齡肉雞注射部位仍然可見沒有吸收的淡黃色殘余物。

2.2病理組織學(xué)觀察見中插彩版圖4～6。

常規(guī)H.E.染色表明，在21日齡時納米組、常規(guī)鋁組和油苗組炎性細(xì)胞浸潤劇烈，肌纖維間充滿炎性細(xì)胞，肌纖維扭曲變形明顯，注射部位形成炎灶。35日齡時，納米組炎灶逐漸縮小，而油苗組和常規(guī)鋁組仍表現(xiàn)很強(qiáng)炎性細(xì)胞浸潤。49日齡時，納米組炎性細(xì)胞已經(jīng)被吸收殆盡，僅在毛細(xì)血管周圍殘存尚未被完全吸收的炎性細(xì)胞；常規(guī)鋁組的炎性細(xì)胞也明顯減少，而油苗組仍有大量炎性細(xì)胞未被吸收，炎灶明顯。對照組沒有明顯變化，肌纖維完整。

3　討論

從表觀觀察結(jié)果分析，21日齡、35日齡各組的肌肉注射部位反應(yīng)不同。初期油苗吸收不良，隨著日齡的增加，油苗逐漸被吸收形成淡黃色的黏稠狀物痕跡，而后逐漸被吸收；納米佐劑組的初期吸收良好，淡黃色的痕跡很快被吸收、肌肉表現(xiàn)潮紅。常規(guī)鋁組的吸收情況略遜于納米組，21日齡只有吸收不完全的殘余物，35日齡時，基本吸收完全。以上說明納米氫氧化鋁用做HPAI H5N1的免疫佐劑可以使疫苗更好的被機(jī)體吸收。

肉雞注射油苗后，因礦物油不能完全代謝，故可在組織中長時間存在，一但被人食用，則有致癌的可能性，隨著人們生活水平的日益提高，對動物產(chǎn)品質(zhì)量安全也提出了更高的要求，為了保證養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展和健康安全的畜禽產(chǎn)品的正常供應(yīng)，油佐劑的缺點(diǎn)越來越有待于解決。目前，使用納米氫氧化鋁佐劑輔佐HPAI H5N1免疫肉雞對胴體品質(zhì)的研究還未見報(bào)道，但與油佐劑相比，納米佐劑無疑可以排除礦物油殘留的可能，改善生長期短的肉雞的胴體品質(zhì)。

從肌肉組織H.E.染色切片來看，隨著日齡不同，各組炎癥出現(xiàn)時間與輕重不同，免疫后隨著日齡的增加炎癥反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，由于佐劑的不同炎癥反應(yīng)逐漸消退的時間有很大差異：納米組在21日齡表現(xiàn)很強(qiáng)的炎性反應(yīng)，炎灶形成，炎灶附近肌纖維間充滿炎性細(xì)胞，至35日齡炎性反應(yīng)即降低，炎灶局限，至49日齡時炎灶基本消除殆盡，肌纖維恢復(fù)，僅在毛細(xì)血管周圍尚存部分未被吸收的炎性細(xì)胞，毛細(xì)血管管壁結(jié)構(gòu)恢復(fù)，游離炎性細(xì)胞散在。油苗組和常規(guī)鋁組在21日齡也表現(xiàn)很強(qiáng)的炎性反應(yīng)，炎性細(xì)胞浸潤，炎灶形成，35日齡時在注射位點(diǎn)附近炎灶肌纖維間充滿炎性細(xì)胞，隨著時間的推移至49日齡時油苗組仍然有很多炎性細(xì)胞未被吸收，肌纖維間炎性細(xì)胞基本消失，炎灶仍清晰可見，常規(guī)鋁組炎性細(xì)胞明顯減少。從整個炎癥過程看，符合炎癥基本過程，初步證實(shí)為免疫介導(dǎo)性肌炎，只是時間上有所不同。

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Theimmunoreactivity research of AIV H5N1 Subtype Vaccine Assissting by Nanoparticulated Aluminum Hydroxide Adjuvant

XU Ai-ping1，JIANG Yong1，ZHAN Lin-li2
（1.Chongqing Municipal Agricultural School，Chongqing 401329，China；2.Chongqing Huaxi District of Animal Husbandry and Veterinary Station，Chongqing 400045，China）

Abstract：Using the self-made Nano aluminum hydroxide as adjuvant，we immunized broilers with H5N1 vacine. As age in?creased，oil-adjuvant vaccine was absorbed，which left yellow traces. Nano adjuvant was absorbed quickly，and there were no yel?low traces left. After 49 days，no inflammatory cells were observed in the nano adjuvant injected area except some around the blood capillarie. Inflammatory cells in the conventional aluminum group were also significantly reduced, while the oil group still had a lot of inflammatory cells observed in the injection area. Compared with oil adjuvant，nano adjuvant can reduce the side effects.

Key words：Avian influenza；Nanoparticulated Aluminum Hydroxide Adjuvant；Immunity Reactivity

作者簡介：徐愛平（1983-），女，講師，碩士，從事畜牧獸醫(yī)教學(xué)工作，E-mail：tracy520927@163.com

收稿日期：2014-04-18

中圖分類號：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0084- 03