李強(qiáng)，張晶晶，2*

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東湛江 524001）

研究進(jìn)展

模式動物斑馬魚在組織屏障發(fā)育及功能研究中的進(jìn)展

李強(qiáng)1，張晶晶1，2*

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東湛江 524001）

斑馬魚作為一種新型的模式動物，以其獨特的優(yōu)勢，已經(jīng)成為現(xiàn)代遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究的重要模式生物。與人類及其他高等脊椎動物相似，斑馬魚同樣具有不同的組織屏障系統(tǒng)。近年來，此領(lǐng)域的研究者利用斑馬魚對血腦屏障等組織屏障的研究取得了重要的進(jìn)展。這對揭示諸多生理屏障相關(guān)的人類疾病的發(fā)病機(jī)制，以及探討通過調(diào)控組織屏障通透性來達(dá)到藥物有效投遞的可行性等研究具有重要的啟示作用。本文將介紹近年來斑馬魚作為模式動物在血腦屏障、血-視網(wǎng)膜屏障、皮膚表皮屏障、腸黏膜上皮屏障等組織屏障發(fā)育和功能研究中的最新進(jìn)展。

斑馬魚；組織屏障；血腦屏障；發(fā)育；疾病發(fā)生

斑馬魚起源于印度，屬輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼爾魚屬，是國際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)可的5種魚類實驗動物之一。斑馬魚繁殖能力強(qiáng)，能夠體外受精和發(fā)育，其胚胎發(fā)育速度快，繁殖周期短，且胚胎和幼魚身體透明，便于形態(tài)學(xué)觀察。1981年，Oregon大學(xué)的George Streisinger［1］首次介紹了斑馬魚實驗技術(shù)方法，為人類利用斑馬魚作為模式動物研究人類疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找疾病治療方法奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)過30余年的發(fā)展，斑馬魚已成為可運用于遺傳、發(fā)育、藥理和毒理學(xué)等多領(lǐng)域研究的重要模式生物。斑馬魚基因測序工程的完成，揭示其基因組與人類基因組的相似性高達(dá)87%，與人類有著相似的病理特征和信號傳導(dǎo)通路，同時斑馬魚大部分組織器官在解剖學(xué)、生理學(xué)和分子水平上已被證實與哺乳動物類似，這就意味著利用斑馬魚可以作為研究大多數(shù)人類疾病的模式生物。本文擬對近年來斑馬魚在血腦屏障、血-視網(wǎng)膜屏障、皮膚表皮屏障、腸黏膜上皮屏障等組織屏障中的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 組織屏障簡介

組織屏障是生物種系在長期進(jìn)化過程中形成的機(jī)體抵抗外來有害物質(zhì)（特別是細(xì)菌、病毒等微生物）入侵機(jī)體的重要結(jié)構(gòu)，對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、各器官的功能以及正常的生命活動具有重要的作用。在人體內(nèi)，組織屏障主要包括血腦屏障、血-視網(wǎng)膜屏障、皮膚上皮屏障、腸黏膜上皮屏障等。雖然這些屏障的功能各不相同，但主要都是由緊密連接（tight junction，TJ）、粘附連接（adhesion junction，AJ）和橋粒等結(jié)構(gòu)組成，這些結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系、相互作用，共同形成完整的屏障結(jié)構(gòu)，對機(jī)體發(fā)揮重要的保護(hù)作用。

1.1 緊密連接

緊密連接主要由跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白兩種成分構(gòu)成，是構(gòu)成組織屏障的重要結(jié)構(gòu)，位于兩個相鄰內(nèi)皮或上皮細(xì)胞間，能夠封閉細(xì)胞間隙，使相鄰的細(xì)胞緊密貼合在一起，形成細(xì)胞間天然的物理屏障，起著選擇性通透、維持細(xì)胞極性和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。除此之外，最近的研究顯示，TJ還參與上皮細(xì)胞增殖分化、基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控等活動［2，3］。TJ跨膜結(jié)構(gòu)主要由跨膜蛋白o(hù)ccludin，claudin和連接黏附分子（junction adhesion molecules，JAMs）組成。其中claudin和occludin起主要作用，尤以claudin的功能最為重要，它是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白［4］，能與TJ的其他成分共同作用，形成TJ嵴線。1998年，日本的Shoichiro Tsukita研究團(tuán)隊首次發(fā)現(xiàn)并報道了claudin1和claudin2為TJ嵴線的整體成分［5］。之后的研究表明，claudin為多基因家族，至今，已有20多個claudin家族的成員在人類和小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［6］，50余個在斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)［7］。利用小鼠等哺乳動物細(xì)胞模型研究顯示，不同claudin成員在各種組織中的分布及功能不同。TJ中每一種claudin都有自己獨特的細(xì)胞間隙離子選擇性［8］，這種獨特的選擇性增加了緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，為不同組織類型屏障功能的多樣性提供了分子學(xué)依據(jù)。同時，同種或異種的claudin可形成聚合體并與鄰近的claudin相互作用構(gòu)成胞間連接骨架。不同的claudin亞型對細(xì)胞間隙滲透性的調(diào)控通常不同的，這可能是由于表達(dá)不同claudin的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的不同屬性決定的［9，10］。也有證據(jù)顯示某些claudin的亞型能夠形成特殊的孔或離子通道，用來調(diào)節(jié)離子的轉(zhuǎn)運［11，12］。在對模式動物斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn)，許多在人體和小鼠中表達(dá)的claudin蛋白也能夠在斑馬魚體內(nèi)檢測到，如claudin5a主要分布在斑馬魚腦腔內(nèi)，claudin-b在斑馬魚皮膚表皮屏障形成過程中起著重要的作用。除此之外，claudin-1，-2，7，-10，-11，-12，-h，-e，-d，-c等claudin家族的其他成員也先后在斑馬魚體內(nèi)被檢測到［13］，這使得斑馬魚成為研究細(xì)胞間緊密連接的重要模式動物，從而為我們進(jìn)一步研究組織屏障的功能和調(diào)節(jié)提供了一種很好動物模型。

1.2 粘附連接

粘附連接是相鄰細(xì)胞通過細(xì)胞膜蛋白相互連接，在Ca2+的參與下，由單次跨膜的cadherin介導(dǎo)，在細(xì)胞膜的胞質(zhì)區(qū)域通過多種蛋白與微絲相連接形成貫穿相鄰細(xì)胞的細(xì)胞連接，包括與鄰近上皮細(xì)胞形成的粘著帶以及與成熟成纖維細(xì)胞形成的粘著斑。AJ是不同類型細(xì)胞中均普遍存在的一種細(xì)胞與細(xì)胞之間連接的結(jié)構(gòu)［14］，在細(xì)胞與細(xì)胞的粘附中起著關(guān)鍵作用。AJ需要Ca2+的參與，由相鄰細(xì)胞通過細(xì)胞膜的表面蛋白相互連接。目前已發(fā)現(xiàn)參與粘附連接形成的蛋白主要包括鈣粘蛋白家族（cadherin family）、連接素家族（nectin family）以及與claudin、occludin和JAM一起構(gòu)成細(xì)胞粘附分子（cell adhesion molecules，CAMs）家族。其中形成粘附連接的鈣粘蛋白cadherin是鈣離子依賴性的介導(dǎo)同質(zhì)性細(xì)胞粘附的單次跨膜糖蛋白，主要包括E-cadherin，N-cadherin和P-cadherin三種，在粘附連接復(fù)合體中起著關(guān)鍵作用［15］。然而，E-cadherin是上皮細(xì)胞主要的鈣粘蛋白，廣泛分布于成熟組織和胚胎的上皮組織中，在組織形成、胚胎發(fā)育、細(xì)胞粘附和細(xì)胞間信息傳遞等多種生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)控作用；N-cadherin主要表達(dá)于神經(jīng)和肌肉組織的細(xì)胞內(nèi)；而P-cadherin則主要表達(dá)在胚胎細(xì)胞中。此外，鈣粘蛋白還存在很多種亞型，如K-cadherin（kidney-cadherin）和 R-cadherin（retinal-cadherin）等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人E-cadherin基因編碼882個氨基酸，分子量約100×103，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。其中胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上含有p120-catenin結(jié)合位點和β-catenin結(jié)合位點，可通過βcatenin等錨定蛋白與F-actin細(xì)胞骨架相連［16］；而胞外區(qū)含有5個由110個氨基酸組成的同源重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（EC1-EC5），每個重復(fù)序列均有獨立的鈣離子結(jié)合位點，能夠形成依賴鈣離子的同源二聚體，從而與鄰近細(xì)胞的同種分子形成特異的相互作用。在對斑馬魚的研究中也發(fā)現(xiàn)，如cadherin-6，在斑馬魚視網(wǎng)膜的形成過程中具有重要的作用［17］，這說明E-cadherin對調(diào)節(jié)細(xì)胞之間粘附的發(fā)生起著重要作用［18］。連接素家族蛋白是Ca2+非依賴的免疫球蛋白樣細(xì)胞粘附分子，包括四個成員，分別為nectin-1，nectin-2，nectin-3，nectin-4，其中，nectin-1，nectin-2，nectin-3又分別因剪切方式的不同而產(chǎn)生多種亞型［19］。

2 內(nèi)皮屏障系統(tǒng)

內(nèi)皮屏障系統(tǒng)主要是由內(nèi)皮細(xì)胞和基膜構(gòu)成。通過對小鼠等哺乳動物的研究顯示，血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，對機(jī)體具有重要的作用。通過對血管通透性的研究顯示，許多有害因素均可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其通透性改變，引起組織、器官水腫和功能障礙；通過對這些有害因素對內(nèi)皮屏障系統(tǒng)的損傷，能使我們對這些有害因素的損傷機(jī)制及藥物治療進(jìn)行更深入的研究。模式動物斑馬魚體內(nèi)的內(nèi)皮屏障系統(tǒng)主要包括血腦屏障及血-視網(wǎng)膜兩大內(nèi)皮屏障系統(tǒng)，下面就這兩大系統(tǒng)做主要介紹。

2.1 血腦屏障

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是位于血液與神經(jīng)細(xì)胞之間，系由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及基底膜所組成的一個細(xì)胞聯(lián)合體。它對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞沒有窗孔，缺少收縮性蛋白，彼此之間能夠形成較嚴(yán)密的緊密連接，從而構(gòu)成一個物理屏障，使蛋白質(zhì)分子及其他大分子物質(zhì)難以透過，也可限制離子和非電解質(zhì)通過。研究表明，TJ存在孔通道和滲漏通道，它們具有不同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制。其中孔通道為離子選擇性通道，主要由claudin胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)域決定其離子選擇性。滲漏通道則主要與大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)。兩種通道能夠通過各自的調(diào)節(jié)機(jī)制影響TJ對物質(zhì)的滲透性。因此，TJ被認(rèn)為是血腦屏障功能發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

近年來，斑馬魚逐漸成為研究血腦屏障形成和發(fā)育以及藥物滲透作用的一種理想的模式動物。Isogai等［20］利用微血管造影術(shù)研究注射Berlin-blue染料的1 dpf-7 dpf（受精后天數(shù)，days post fertilization，dpf）的斑馬魚，結(jié)果表明斑馬魚循環(huán)系統(tǒng)在24 hpf（受精后小時數(shù)，hours post fertilization，hpf）左右出現(xiàn)。此期間斑馬魚的血管形成過程是高度動態(tài)變化的，但又遵循相對固定的模式。Jeong等［21］利用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）進(jìn)行血管內(nèi)注射的觀察結(jié)果表明，斑馬魚同其他脊椎動物一樣，具有以內(nèi)皮細(xì)胞為基礎(chǔ)的血腦屏障。2.5 dpf之前，其頭部主要血管形成為血管發(fā)生方式，自此之后，一定數(shù)量的中央動脈開始刺入腦實質(zhì)，大量的微血管網(wǎng)開始形成。隨著血管網(wǎng)的逐漸形成，血腦屏障也開始發(fā)育，并逐漸形成。Claudin-5和ZO-1在表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）的微血管的內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到，這表明在3 dpf時斑馬魚已具備以TJ為基礎(chǔ)的血腦屏障，而斑馬魚的這種循環(huán)系統(tǒng)，能夠為其早期發(fā)育提供重要保障。

Claudin-5是構(gòu)成血腦屏障緊密連接的重要蛋白，其在斑馬魚血腦屏障的形成過程中起著非常重要的作用。在斑馬魚體內(nèi)共檢測到兩種claudin-5，分別是claudin-5a和claudin-5b，且兩者具有高度的同源性。Xie等［22］通過建立雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lfabp：DBP-EGFP）模型，將熒光染料注入不同時期的斑馬魚胚胎，通過對斑馬魚胚胎期前4天claudin-5a和claudin-5b的檢測，進(jìn)一步證實斑馬魚血腦屏障開始發(fā)育是在3 dpf。Zhang等［23］通過對斑馬魚腦室形成和發(fā)育的研究，發(fā)現(xiàn)claudin-5a與腦室膨脹有密切關(guān)系，而腦室膨脹則是形成血腦屏障最至關(guān)重要的一步，claudin-5a缺失會影響斑馬魚神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞旁路的屏障功能，并導(dǎo)致緊密連接不完整和腦室膨脹障礙，從而導(dǎo)致血腦屏障的形成障礙。此外，claudin-5b能夠特異性的分布在脈管系統(tǒng)，有研究表明 claudin-5b在節(jié)間血管（intersegmental vessel，IVS）的生成過程中起著重要的作用［24］，但其在血腦屏障中的作用需進(jìn)一步研究。除了claudin-5之外，claudin家族的其他成員（如claudin-1，-j，-7，-10，-11，-12，-e，-d）也在斑馬魚腦內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，但在斑馬魚血腦屏障的發(fā)育形成過程的具體作用目前還需進(jìn)一步研究［13］。

ZO-1（zonula occludens-1）既是組成AJ的主要結(jié)構(gòu)，也是構(gòu)成TJ的重要成分之一，為TJ的許多跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺。有研究發(fā)現(xiàn)，由于ZO-1結(jié)構(gòu)和功能與緊密連接的其他成員密切相關(guān)，多數(shù)情況下只要ZO-1受到破壞，緊密連接的功能多隨之發(fā)生變化。通過對模式動物斑馬魚血腦屏障的研究發(fā)現(xiàn)，從3 dpf開始，在斑馬魚魚卵的大腦微血管中就可檢測到ZO-1蛋白，并且該蛋白伴隨血腦屏障成熟的整個過程這再一次證實斑馬魚血腦屏障開始發(fā)育是在3 dpf［21］。

Occludin是第一個被鑒定出來的跨膜蛋白［25］。目前認(rèn)為，其主要功能可能是參與調(diào)控TJs間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］。但其在斑馬魚血腦屏障中的作用尚需進(jìn)一步證實。

2.2 血-視網(wǎng)膜屏障

血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）由視網(wǎng)膜血管和視網(wǎng)膜色素上皮共同組成。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮則形成血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（blood-retinal inner barrier），視網(wǎng)膜色素上皮則形成血-視網(wǎng)膜外屏障（blood-retinal outer barrier）。屏障功能依賴于緊密連接，限制細(xì)胞間水溶性分子的運動，防止這些分子進(jìn)入視網(wǎng)膜。電子顯微鏡顯示圍繞視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮頂端有大量阻塞小帶，大分子和離子不能從循環(huán)中被動的擴(kuò)散進(jìn)入視網(wǎng)膜，但可與選擇性的主動運輸聯(lián)系起來。斑馬魚眼的發(fā)育與人類非常相似，經(jīng)過數(shù)十年的研究，已逐漸成為研究血-視網(wǎng)膜屏障的理想模式動物。Alvarez等通過對斑馬魚視網(wǎng)膜血管發(fā)育過程的研究發(fā)現(xiàn)，在透明血管發(fā)育成視網(wǎng)膜血管的過程中，血管并未退化。同時，成年斑馬魚的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍細(xì)胞具有緊密連接結(jié)構(gòu)［26，27］。有研究顯示，在斑馬魚受精后3 dpf，其眼內(nèi)的血管中即可檢測到緊密連接蛋白claudin-5，這表明斑馬魚BRB形成與BBB一樣，亦是在受精后3天（3 dpf），同時通過對ZO-1蛋白的檢測，發(fā)現(xiàn)ZO-1在眼內(nèi)的表達(dá)比claudin-5更早［22］。除了claudin蛋白之外，cadherin也在斑馬魚視網(wǎng)膜形成中具有重要作用。Liu等通過對斑馬魚視網(wǎng)膜的發(fā)育過程的研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚受精后32 h，便可在斑馬魚的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜前腹側(cè)區(qū)域檢測到cadherin-6，而此區(qū)域是視網(wǎng)膜細(xì)胞最早分化的區(qū)域，若阻止cadherin-6的表達(dá)，則會導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的形成障礙［19］。

3 上皮屏障系統(tǒng)

上皮屏障系統(tǒng)主要是由上皮細(xì)胞和基膜等結(jié)構(gòu)構(gòu)成，能夠通過相鄰細(xì)胞間的相互連接而形成屏障，使機(jī)體免受外來有害物質(zhì)的損傷，對維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的作用。目前在斑馬魚系統(tǒng)中研究較多的上皮屏障主要有皮膚表皮屏障及腸黏膜上皮屏障，下面就這兩種屏障做進(jìn)一步介紹。

3.1 皮膚表皮屏障

斑馬魚表皮為其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外界環(huán)境提供了一個必要的屏障結(jié)構(gòu)，在胚胎期14 hpf，表皮即可完全包裹胚胎［28］，隨著胚胎的發(fā)育，其角質(zhì)形成細(xì)胞也逐漸增殖，可在成魚時分化形成三層：外層，中間層及基底層［29］，但各層間相互粘連，形成TJ。Raymond等使用反向遺傳法阻止斑馬魚幼魚claudin-b蛋白的翻譯，發(fā)現(xiàn)claudin-b敲低后導(dǎo)致斑馬魚幼魚皮膚表皮細(xì)胞間隙的滲透性增加，Na+丟失，使整個機(jī)體的Na+減少，但Clˉ并未發(fā)生明顯改變，從而證明了claudin-b在調(diào)節(jié)斑馬魚皮膚上表皮細(xì)胞滲透性和Na+轉(zhuǎn)運中起著重要的作用［30］。Zhang等［31］利用僅含194到319位氨基酸的產(chǎn)氣莢膜梭菌內(nèi)毒素（cCPE194ˉ319）肽段來調(diào)控斑馬魚幼魚表皮的滲透性，發(fā)現(xiàn)cCPE194ˉ319能夠特定的從上皮細(xì)胞移走claudin-b，使單層細(xì)胞的緊密連接中斷。通過4 kDa熒光染料擴(kuò)散實驗分析發(fā)現(xiàn)表皮屏障的滲透性增加主要是因為cCPE194ˉ319導(dǎo)致的，電子顯微鏡結(jié)果顯示移除cCPE194ˉ319能夠使上皮細(xì)胞間的TJs結(jié)構(gòu)恢復(fù)。以上結(jié)果表明使用cCPE194ˉ319能夠調(diào)控claudin-b從而控制表皮屏障的瞬時開關(guān)，這就使得斑馬魚可以作為新的模式動物，來研究借助cCPE提高藥物通過組織屏障的可能性。除此之外，Kiener等［32］通過對斑馬魚胚胎期表皮屏障形成過程的研究發(fā)現(xiàn)，Tjp/ZO-3首先是在其胚胎的周圍層（enveloping layer，EVL）被檢測到，阻止Tjp/ZO-3的表達(dá)，將會導(dǎo)致EVL的發(fā)育缺陷，從而導(dǎo)致胚胎對滲透壓力的敏感性增加。因此Tjp/ZO-3在斑馬魚胚胎期表皮屏障的功能也具有重要作用。

3.2 腸黏膜上皮屏障

人體腸道內(nèi)棲息著大量的微生物，這些微生物在長期進(jìn)化過程中和宿主形成了共生關(guān)系。正常情況下并不損害機(jī)體健康，這完全依賴機(jī)體完整的腸道黏膜屏障功能。在正常情況下，腸道的屏障作用可有效的阻擋腸道內(nèi)500多種、濃度高達(dá)1012個/g的腸道內(nèi)寄生菌及其毒素向腸腔外組織、器官移位，防止機(jī)體受內(nèi)源性微生物及其毒素的侵害。腸道黏膜屏障主要是由機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障四部分組成，其中以機(jī)械屏障及免疫屏障最為重要。成年斑馬魚沒有胃，其腸道分為前腸、中腸和后腸，通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)其腸道上皮結(jié)構(gòu)主要由柱狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及內(nèi)分泌細(xì)胞等組成，細(xì)胞之間由TJs、AJs組成物理屏障以限制腸腔內(nèi)容物進(jìn)入機(jī)體。斑馬魚的消化系統(tǒng)的快速發(fā)育大約是在18 hpf［33］，其腸管逐漸形成，隨著腸道與外界環(huán)境相通，微生物也逐漸進(jìn)入斑馬魚腸道內(nèi)。Wallace等［34］通過對斑馬魚腸道形成及發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚50 hpf時，大多數(shù)腸道上皮細(xì)胞即可觀察到散亂的ZO-1，在74 hpf，ZO-1更加明顯。在這個時期，通過電子顯微鏡可觀察到上皮細(xì)胞間的橋粒。有研究表明［35］，由免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），若其分泌過多，可導(dǎo)致斑馬魚腸上皮屏障功能障礙，從而導(dǎo)致炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）的發(fā)生。該結(jié)果說明，TNF對維持腸道的屏障功能具有重要的作用。

4 利用斑馬魚進(jìn)行其他組織屏障的研究

斑馬魚作為研究組織屏障結(jié)構(gòu)和功能的理想模式動物，除上述幾種組織屏障外，斑馬魚體內(nèi)還存在腎小球濾過屏障，能夠為腎臟發(fā)育和功能的研究提供一個適用的生物模型。斑馬魚腎臟結(jié)構(gòu)較為簡單，其幼魚的前腎僅由2個腎單位組成，并通過2個腎小管連接其腎小球與前腎導(dǎo)管，前腎導(dǎo)管在尾部匯合通到泄殖腔。斑馬魚的腎小球由有孔的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管基底膜（GBM）、足細(xì)胞等組成，具有與高等脊椎動物腎臟一樣的細(xì)胞組成。Kramer等［36］學(xué)者通過對斑馬魚腎小球電子顯微鏡觀察，結(jié)果表明，斑馬魚足細(xì)胞在足狀凸起部分形成的隔膜類似于哺乳動物腎臟足細(xì)胞，并已證明，斑馬魚在24 hpf時期的同源基因podocin和nephrin均能夠特異表達(dá)于足細(xì)胞中，且該基因在腎臟足細(xì)胞隔膜的形成中是必不可少的。

Majumdar等研究發(fā)現(xiàn)，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF受體和其早期標(biāo)志物flk-1，而flk-1陽性的內(nèi)皮細(xì)胞能夠侵入腎小球上皮細(xì)胞形成腎小球毛細(xì)血管袢。但是當(dāng)背脊動脈發(fā)育發(fā)生缺陷而無法形成正常的腎小球脈管系統(tǒng)時，足細(xì)胞仍然能夠繼續(xù)表達(dá)WT1和VEGF，從該結(jié)果推斷，足細(xì)胞似乎能夠從附近的靜脈俘獲flk-1陽性的內(nèi)皮細(xì)胞以形成具有功能的腎小球。可見，足細(xì)胞通過表達(dá)VEGF在吸引和聚集腎小球毛細(xì)血管叢的形成中起著重要作用［38］。此外，Serluca等［37］研究表明，血管流量及腎小球基底膜的降解與再塑［38］也是毛細(xì)血管形成過程中的兩個必需因素。

5 總結(jié)

人體時刻都與外界接觸并進(jìn)行物質(zhì)交換，為了防范外界不良因素對機(jī)體的侵犯，人體具有數(shù)重天然保護(hù)性“墻”―組織屏障，作為阻止外來有害物質(zhì)入侵機(jī)體的重要結(jié)構(gòu)。斑馬魚各組織屏障的發(fā)育形成過程及結(jié)構(gòu)功能同哺乳動物相似，這就使得斑馬魚成為研究組織屏障結(jié)構(gòu)、功能的理想模型。通過電鏡技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚組織屏障主要是由TJ、AJ、橋粒等結(jié)構(gòu)組成，而這些結(jié)構(gòu)主要是由occludin，claudin，cadherin，ZO等蛋白組成，這些蛋白伴隨著各組織屏障發(fā)育形成的全過程。對這些蛋白形成過程、結(jié)構(gòu)和功能的研究，使得我們對早期發(fā)現(xiàn)疾病、研究疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物如何通過這些屏障到達(dá)靶器官提供了重要的基礎(chǔ)。隨著免疫熒光技術(shù)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的建立，世界各國科學(xué)工作者在研究組織屏障中也取得了重大的成果。盡管如此，由于各連接蛋白家族數(shù)量眾多且功能不盡相同，各組織屏障所表達(dá)的連接蛋白又各不相同，這就為我們?nèi)绾伟l(fā)現(xiàn)各組織屏障中的關(guān)鍵蛋白帶來難題。雖然有的屏障結(jié)構(gòu)研究日漸清晰，但其與疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系仍需進(jìn)一步探究.如何利用這些研究成果，使藥物能夠更加容易通過這些屏障結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到治療疾病的目的仍待解決。且這些研究成果都是通過動物模型研究所得，在應(yīng)用于人類時是否具有差異性，仍需繼續(xù)研究。

［1］ Streisinger G，Walker C，Dower N et al.Production of clones of homozygous diploid zebrafish（Brachydanio rerio）［J］.Nature. 1981，291（5813）：293ˉ296.

［2］ Schneeberger EE，Lynch RD.The tight junction：amultifunctional complex［J］.Am J Physiol Cell Physiol.2004，286（6）：C1213ˉ1228.

［3］ Shin K，F(xiàn)ogg VC，Margolis B.Tight junctions and cell polarity［J］.Annu Rev Cell Dev Biol.2006，22：207ˉ235.

［4］ Turksen K，Troy TC.Barriers built on claudins［J］.JCell Sci. 2004，117（Pt12）：2435ˉ2447.

［5］ Nitkunan A，LanfranconiRA，Charlton RA，etal.Brain atrophy and cerebral small vessel disease：a prospective follow-up study［J］.Stroke.2011，42（1）：133ˉ138.

［6］ Wada M，Nagasawa H，Kawanami T，etal.Cystatin C as an index of cerebral small vessel disease：results of a cross-sectional study in community-based Japanese elderly［J］.Eur JNeurol. 2010，17（3）：383ˉ390.

［7］ Wardlaw JM，Doubal FN，Valdes-Hernandez M，et al.Bloodbrain barrier permeability and long-term clinical and imaging outcomes in cerebral small vessel disease［J］.Stroke.2013，44（2）：525ˉ527.

［8］ Williams LA，Martin-Padura I，Dejana E et al.Identification and characterisation of human junctional adhesion molecule（JAM）［J］.Mol Immunol.1999，36（17）：1175ˉ1188.

［9］ Tsukita S，F(xiàn)uruse M，Itoh M.Multifunctional strands in tight junctions［J］.NatRev Mol Cell Biol［J］.2001，2（4）：285–293.

［10］ Van Itallie CM，Anderson JM.Claudins and epithelial paracellular transport［J］.Annu Rev Physiol.2006，68：403ˉ429.

［11］ Amasheh S，Meiri N，Gitter AH et al.Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells［J］.JCell Sci.2002，115（Pt24）：4969ˉ4976.

［12］ Hou J，Gomes AS，Paul DL，et al.Study of claudin function by RNA interference［J］.JBiol Chem.2006，281（47）：36117ˉ 36123.

［13］ Kolosov D，Bui P，Chasiotis H，et al.Claudins in teleost fishes［J］.Tissue Barrier.2013，1（3）：e25391.

［14］ Meng W，TakeichiM.Adherens junction：molecular architecture and regulation［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol.2009，1（6）：a002899.

［15］ Adams CL，Nelson WJ.Cytomechanics of cadherin-mediated cell-cell adhesion［J］.Curr Opin Cell Biol.1998，10（5）：572 ˉ577.

［16］ Hogan C，Serpente N，Cogram P，et al.Rap1 regulates the formation of E-cadherin based cell-cell contacts［J］.Mol Cell Biol. 2004，24（15）：6690ˉ6700.

［17］ Liu Q，Londraville R，Marrs JA，et al.Cadherin-6 function in zebrafish retinal development［J］.Dev Neurobiol.2008，68（8）：1107ˉ1122.

［18］ Takeichi M.Self-organization of animal tissues：cadherin-mediated processes［J］.Dev Cell.2011，21：24ˉ26.

［19］ Cocchi F，Lopez M，Dubreuil P，et al.Chimeric nectin1-poliovirus receptor molecules identify a nectin1 region functional in herpes simplex virusentry［J］.JVirol.2001，75（17）：7987ˉ 7994.

［20］ Isogai S，Horiguchi M，Weinstein BM.The vascular anatomy of the developing zebrafish：an atlas of embryonic and early larval development［J］.Dev Biol.2001，230（2）：278ˉ301.

［21］ Jeong JY，Kwon HB，Ahn JC et al.Functional and developmental analysis of the blood brain barrier in zebrafish［J］.Brain Res Bull.2008，75（5）：619ˉ628.

［22］ Xie J，F(xiàn)arage E，Sugimoto M，etal.A novel transgenic zebrafish model for blood-brain and blood-retinal barrier development［J］. BMC Dev Biol.2010，10：76.

［23］ Zhang JJ，Piontek J，Wolburg H，et al.Establishment of a neuroepithelial barrier by claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion［J］.Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107（4）：1425ˉ1430.

［24］ Hassan A，Hunt BJ，OˊSullivan M，et al.Markers of endothelial dysfunction in lacunar infarction and ischaemic leukoaraiosis［J］.Brain.2003，126（Pt2）：424ˉ432.

［25］ Furuse M，Hirase T，Itoh M，et al.Occludin：a novel integral membrane protein localizing at tight junctions［J］.J.Cell Biol. 1993，123（6 Pt2）：1777ˉ1788.

［26］ Alvarez Y，Cederlund ML，Cottell DC，et al.Genetic determinants of hyaloid and retinal vasculature in zebrafish［J］.BMC Dev Biol.2007，7：114.

［27］ Santoro MM，Pesce G，Stainier DY.Characterization of vascular mural cells during zebrafish development［J］.Mech Dev.2009，126（8ˉ9）：638ˉ649.

［28］ Raible DW，Wood A，Hodsdon W，et al.Segregation and early dispersal of neural crest cells in the embryonic zebrafish［J］. Dev Dyn.1992，195（1）：29ˉ42.

［29］ Le Guellec D，Morvan-Dubois G，Sire JY.Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish（Danio rerio）［J］.Int J Dev Biol. 2004，48（2ˉ3）：217ˉ231.

［30］ Raymond W，Kwong M，Perry SF.The tight junction protein claudin-b regulates epithelial permeability and sodium handling in larval zebrafish，Danio rerio［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2013，304（7）：R504ˉ513.

［31］ Zhang J，Ni C，Yang Z，et al.Specific binding of Clostridium perfringens enterotoxin fragment to claudin-b and modulation of zebrafish epidermal barrier［J］.Exp Dermatol，2015，24（8）：605ˉ610.

［32］ Kiener TK，Selptsova-Friedrich I，Hunziker W.Tjp3/zo-3 is critical for epidermal barrier function in zebrafish embryos［J］. Dev Biol.2008，316（1）：36ˉ49.

［33］ Ng AN，de Jong-Curtain TA，Mawdsley DJ，et al.Formation of the digestive system in zebrafish：III.Intestinal epithelium morphogenesis［J］.Dev Biol.2005，286：114ˉ135.

［34］ Wallace KN，Akhter S，Smith EM，et al.Intestinal growth and differentiation in zebrafish［J］.Mech Dev.2005，122：157ˉ 173.

［35］ Marjoram L，Alvers A，Deerhake ME，et al.Epigenetic control of intestinal barrier function and inflammation in zebrafish［J］. Proc Nat Acad Sci U SA.2015，112（9）：2770ˉ2775.

［36］ Kramer-Zucher AG，Wiessner S，Jensen AM et al.Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires nephrin，podocin and the FERM domain protein mosaic eyes［J］Dev Biol.2005，285：316ˉ329.

［37］ Serluca FC，Drummond IA，F(xiàn)ishman MC.Endothelial signaling in kidney morphogenesis：a role for hemodynamic forces［J］. Curr Biol.2002，12（6）：492ˉ497.

［38］ Drummond IA.Kidney development and disease in the zebrafish［J］.JAm Soc Nephrol.2005，16（2）：299ˉ304.

Research progress on the development and functions of tissue barriers using zebrafish model

LIQiang1，ZHANG Jing-jing1，2
（1.Department of Neurology；2.Clinical Research Center，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang Guangdong 524001，China）

Zebrafish has been widely used as an importantmodel system in research fields of genetic and developmental biology over the past20 years.Similar to themammalians and other vertebrate animals，zebrafish also has various tissue barriers.In recent years，more and more important progress of tissue barrier studies have been achieved using zebrafish as in vivo model，such as blood-brain barrier.These findings contribute to the understanding of themechanisms of diseases caused by the disorders of physiological barriers.Italso helpswith themodulation of the permeability of tissue barriers for drug delivery.This review summaries recent progress of zebrafish applications in the study of tissue barriers，such as blood-brain barrier，blood-retina barrier，epidermal barrier，etc.

Zebrafish；Tissue barrier；Blood-brain barrier；Development；Pathogenesis.

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0523-06

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.016

2015-08-07

國家自然科學(xué)基金（31370824，81102524）；廣東省“培養(yǎng)高層次人才特殊支持計劃”專項基金（粵人才辦〔2015〕8號）。

李強(qiáng)，男，碩士研究生，研究方向：腦組織屏障，E-mail：330938901@qq.com。

張晶晶，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)。E-mail：gdmccrc@163.com。