解現(xiàn)星，張濤，趙爽，安星蘭，馬蘭芝，張廣州，劉源

（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071）

研究報(bào)告

蘇子油對(duì)肥胖大鼠肝臟極低密度脂蛋白合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

解現(xiàn)星，張濤，趙爽，安星蘭，馬蘭芝，張廣州，劉源*

（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071）

目的探究富含n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的蘇子油高脂飲食對(duì)肥胖大鼠肝臟極低密度脂蛋白（very low density lipoproteins，VLDL）合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。方法造模期：雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組（normal control group，NC）給予普通日糧，高脂組（high fat group，HF）給予高脂純合日糧誘發(fā)肥胖大鼠模型；干預(yù)期：將肥胖大鼠隨機(jī)分為4組：持續(xù)高脂組（consistent high fat group，CHF）和三個(gè)蘇子油（perilla oil，PO）替代組，根據(jù)PO替代CHF中豬油比例的不同將替代組分為20%PO、50%PO、100%PO，4周后測(cè)定大鼠血清甘油三酯（tryglyceride，TG）水平；western blotting方法檢測(cè)肝臟VLDL合成關(guān)鍵蛋白微粒體甘油三脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP）和載脂蛋白B（apolipoprotein B，APOB）蛋白表達(dá)；real-time PCR方法檢測(cè)肝臟Mtp、Apob mRNA表達(dá)。結(jié)果肥胖大鼠血清TG水平顯著高于NC組，并且有嚴(yán)重的脂肪沉積，肝臟MTP和APOB的mRNA、蛋白表達(dá)均有不同程度的降低；干預(yù)4周后，與CHF組相比，各PO替代組大鼠血清TG水平明顯降低，病理切片結(jié)果顯示肝臟脂肪沉積有明顯改善，并且肝臟MTP和APOB的mRNA、蛋白表達(dá)均有不同程度的升高。結(jié)論不同比例PO替代均能促進(jìn)肥胖大鼠肝臟VLDL合成與分泌，改善肝臟脂肪沉積，并且PO促進(jìn)Mtp mRNA、蛋白表達(dá)具有劑量依賴性。

nˉ3多不飽和脂肪酸；肥胖大鼠模型；極低密度脂蛋白

目前，肥胖癥已成為全球發(fā)病率迅速增加的一種流行性疾病，全球60億人口中13億超重和肥胖，其中半數(shù)為肥胖［1］。研究證實(shí)長期過量的脂肪（特別是飽和脂肪）能量攝入是導(dǎo)致肥胖的獨(dú)立誘發(fā)因素［2］。肥胖對(duì)人體健康的危害很大，可引起高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、脂肪肝、糖尿病等肥胖相關(guān)疾病，脂代謝的紊亂是這些疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)［3］。肝臟通過調(diào)節(jié)極低密度脂蛋白（very low density lipoproteins，VLDL）的組裝和分泌來控制肝臟內(nèi)甘油三酯（tryglyceride，TG）含量是防止脂代謝紊亂的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［4］。

有研究指出不同種類的脂肪酸對(duì)肝臟VLDL的合成和分泌有明顯不同的作用，這種作用的詳細(xì)機(jī)制仍然不清楚［5］。nˉ3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）系長鏈多不飽和脂肪酸，在抗炎、抗動(dòng)脈硬化、降血脂等方面有積極意義［6］。αˉ亞麻酸（ALA，C18：3）、二十碳五烯酸（EPA，C20：5）和二十二碳六烯酸（DHA，C22：6）同屬nˉ3PUFA，DHA和EPA主要來源于深海魚油，ALA在蘇子油、菜籽油里含量較高。相對(duì)于ALA而言，關(guān)于DHA和EPA的研究較多。為此，我們研究了在攝入總熱量不變的情況下，以ALA含量較高的蘇子油替代高脂日糧中飽和脂肪酸的熱量后，對(duì)肥胖大鼠肝臟VLDL合成關(guān)鍵蛋白APOB、MTP表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)雄性SD大鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXKˉ（軍）2012ˉ004】，5周齡，體重（160±10）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXKˉ（軍）2012ˉ 005】，明暗周期12 h（6：00～18：00），動(dòng)物可以自由采食、飲水，溫度控制在（23±1）℃，濕度為（40±5）%。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料

純合日糧配方參照test diet 58Y2、58V8制作（主要成分為酪蛋白、麥芽糊精、玉米淀粉、蛋氨酸、脂肪、纖維素、礦物質(zhì)、蔗糖、維生素）。對(duì)照組日糧能量含量為15.7 kJ/g，其中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪能量比分別為20.2%、69.49%、10.31%。CHF組豬油所占比例為20.62%，三個(gè)替代組分別用PO替代CHF組豬油含量的20%（20%PO）、50%（50% PO）、100%（100%PO），能量含量均為19.35 kJ/g，其中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪能量比分別為19.67%、34.59%、45.73%。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將60只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組進(jìn)行肥胖造模：對(duì)照組（normal control group，NC）12只、高脂組（high fat group，HF）48只；10周后，將HF組中24只達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)（肥胖標(biāo)準(zhǔn)［7］：體重超過安靜對(duì)照組體重的平均值20%）大鼠隨機(jī)分為4組：CHF以及三個(gè)PO替代組20%PO、50%PO、100%PO，每組6只，干預(yù)4周后安樂死，取肝臟組織液氮冷凍保存。

1.1.4 主要儀器與試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa DRR037A，大連）；Bio-Rad IQ5 real-time PCR儀；Trizol（Invitrogen公司，美國）；BCA試劑（Beyotime）；RIPA裂解液（博邁德生物公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞二抗（中科英沐）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（中衫金橋）；蛋白酶抑制劑Cocktail Tablets（Roche公司，瑞士）；Western blotting發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Thermo，美國）；β-actin一抗（ab8227，Abcam，英國）；雞APOB一抗（ab117317，Abcam，英國）；小鼠MTP一抗（sc-135994，Santa Cruz，美國）；X光膠片、顯影液、定影液（Kodak，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR

取10～20 mg大鼠肝臟組織于離心管中，分別運(yùn)用Trizol法和TaKaRa試劑盒來提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄，操作均按照說明書進(jìn)行。1μg總RNA加入到20μL反轉(zhuǎn)錄體系中，37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s。實(shí)時(shí)定量PCR的引物（表1）由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。20μL反應(yīng)體系。30 s 95℃預(yù)變性，之后進(jìn)行包括95℃變性5 s，退火及延伸30 s的40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 測(cè)定各基因轉(zhuǎn)錄水平的引物Tab.1 Primers for analysis of transcription level of the gene expression

1.2.2 Western-blotting檢測(cè)

肝臟組織在低溫條件下與蛋白酶抑制劑、裂解液快速充分研磨成組織勻漿，14 440 r/min，4℃離心10 min，取上清用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。NC、CHF、20%PO、50%PO、100%PO五組總蛋白量一致的情況下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，采用濕轉(zhuǎn)的方法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉2 h，分別用BETA-ACTIN、MTP、APOB一抗孵育4℃過夜，用TBST洗膜，二抗孵育1 h，ECL法檢測(cè)。β ˉactin作為內(nèi)參。顯影片上的條帶用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，各組與actin蛋白量比值作相對(duì)含量計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 造模期大鼠體重

造模結(jié)束后，NC組大鼠體重平均值為551.5 g，挑選出的肥胖大鼠體重平均值為702.7 g。

2.2 干預(yù)后大鼠血清指標(biāo)

與NC組相比，CHF血清TG水平明顯升高（P =0.0008）；而經(jīng)過各水平PO干預(yù)之后，大鼠血清TG水平均顯著降低（P＜0.0001），且各替代組之間沒有明顯差異（P=0.4619），見圖1。

2.3 肝臟病理切片

大鼠肝臟分別做了油紅O染色分析和HE染色分析（圖2）。從病理檢測(cè)結(jié)果來看，CHF組比NC組有更多的脂肪泡聚集，大部分肝細(xì)胞內(nèi)可見油紅O染色陽性脂滴，大部分肝細(xì)胞內(nèi)存在脂肪空泡；經(jīng)PO干預(yù)后，三個(gè)替代組部分肝細(xì)胞內(nèi)可見油紅O染色陽性脂滴，部分肝細(xì)胞內(nèi)存在脂肪空泡。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析M tp和Apob表達(dá)差異

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，肥胖大鼠肝臟Mtp、Apob mRNA表達(dá)量均降低，但只有Mtp mRNA顯著降低（P=0.0126）。干預(yù)后，與CHF組相比，20%PO替代組大鼠肝臟Mtp mRNA表達(dá)量有所升高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差（P=0.1501），50%PO、100%PO替代組大鼠肝臟Mtp mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.0001），且隨著PO替代比例的增加，Mtp mRNA表達(dá)量隨之升高；各PO替代組大鼠肝臟Apob mRNA表達(dá)量均顯著升高（P=0.0001），且各替代組之間沒有明顯變化（P=0.3183），見表2。

注：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，每組有6只大鼠。圖中“#”（P＜0.05）代表與NC組差異有顯著性，“*”（P＜0.05）代表與CHF組差異有顯著性。a.對(duì)照組；b.持續(xù)高脂組；c. 20%PO替代組；d.50%PO替代組；e.100%PO替代組。圖1 血清甘油三酯水平Note.Data aremean±standard deviation（SD），n=6 rats per diet.“#”（P＜0.05）means it is significantly different compared with the NC group and“*”（P＜0.05）means it is significantly different compared with the CHF group.a.NC；b.CHF；c.20% PO；d.50%PO；e.100%PO.Fig.1 Serum TG levels in the rats

2.5 Western blotting檢測(cè)MTP和APOB蛋白表達(dá)

結(jié)果表明，與NC組相比，肥胖大鼠肝臟APOB蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.0156）；經(jīng)PO干預(yù)后，大鼠肝臟APOB蛋白表達(dá)量均顯著升高（P= 0.0024），且各替代組之間無明顯差異（P= 0.2673）。與NC組相比，CHF組大鼠肝臟MTP蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.0290）；經(jīng)PO干預(yù)后，大鼠肝臟MTP蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.0001），且各替代組之間有明顯差異（P=0.0011）。見圖3。

注：第一行是大鼠肝臟脂肪油紅O染色和細(xì)胞核蘇木精染色結(jié)果，×200。第二行是大鼠肝臟蘇木精ˉ伊紅染色，×100。圖2 各組大鼠肝臟組織學(xué)切片Note.The top row shows oil-red-O staining（red）for lipids，and hematoxylin staining（blue）for cell nuclei.×200.The bottom row of images displays hematoxylin and eosin stained liver tissues，×100.Fig.2 Histology of rats fed with diets containing different fat contents

表2 肝臟VLDL合成基因相對(duì)表達(dá)量（±s，n=6）Tab.2 Relative expression levels of genes of hepatic VLDL synthesis

表2 肝臟VLDL合成基因相對(duì)表達(dá)量（±s，n=6）Tab.2 Relative expression levels of genes of hepatic VLDL synthesis

注：字母相同表示差異無顯著性。Note.The same lettesmean nonsignificant difference.

分組G r o u p s M t p A p o b對(duì)照組N C 1 . 1 7 9 ± 0 . 2 6 7B1 . 0 0 0 ± 0 . 2 3 9A持續(xù)高脂組C H F 0 . 7 7 5 ± 0 . 1 2 1Aa0 . 7 9 7 ± 0 . 1 1 5Aa2 0 % P O替代組2 0 % P O 0 . 8 9 6 ± 0 . 0 9 7a1 . 2 4 3 ± 0 . 0 9 8b5 0 % P O替代組5 0 % P O 1 . 1 1 1 ± 0 . 1 6 7b1 . 3 7 6 ± 0 . 1 3 9b1 0 0 % P O替代組1 0 0 % P O 1 . 5 0 7 ± 0 . 1 7 7c1 . 4 7 7 ± 0 . 3 2 5bP＜0 . 0 0 0 1 0 . 0 0 0 1

3 討論

注：圖中“#”（P＜0.05）代表與NC組差異有顯著性，“*”（P＜0.05）代表與CHF組差異有顯著性。a.對(duì)照組；b.持續(xù)高脂組；c.20%PO替代組；d.50%PO替代組；e.100%PO替代組。圖3 MTP和APOB的蛋白表達(dá)量Note.“#”（P＜0.05）means that it is significantly different compared with the NC group and“*”（P＜0.05）means that it is significantly different compared with the CHF group.a.NC；b.CHF；c.20%PO；d.50%PO；e.100%PO.Fig.3 MTP and APOB protein expressions

超重和肥胖是許多慢性?。ㄈ缣悄虿?、心血管疾病等）發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，也是嚴(yán)重影響生命質(zhì)量和增加財(cái)政負(fù)擔(dān)的全球性公共衛(wèi)生問題，而“糖尿病肥胖”更是表達(dá)了肥胖為2型糖尿病獨(dú)立危險(xiǎn)因子和主要病因這一觀點(diǎn)［8ˉ10］。建立可行的動(dòng)物模型是開展肥胖研究的關(guān)鍵。本研究中經(jīng)過長期的高脂飲食，SD大鼠產(chǎn)生肥胖。

隨著人們生活水平的日益提高，肥胖伴高血脂癥的發(fā)病率變得愈來愈高，而血液中TG過高，是誘發(fā)多種心血管疾病的因素之一。相關(guān)研究顯示通過改變膳食脂肪酸構(gòu)成可以降低血脂濃度［11ˉ12］。我們的造模結(jié)果也顯示，高脂飲食誘發(fā)大鼠肥胖，血清TG水平明顯升高，產(chǎn)生高血脂。而PO高脂飲食干預(yù)后能夠顯著降低血清TG水平，這提示富含nˉ3PUFA的PO代替飽和脂肪酸提供的熱量后，雖然攝入的能量相等，但同樣具有降低肥胖大鼠血清TG水平的作用。

VLDL是以APOB為主要骨架的大分子脂蛋白，它將肝內(nèi)多余的能量以TG為主要形式運(yùn)輸出肝臟，因此VLDL的裝配和分泌與載脂蛋白含量密切相關(guān)，因此，任何影響肝內(nèi)APOB含量的因素都會(huì)對(duì)VLDL的裝配和分泌產(chǎn)生影響［13］。MTP是繼APOB之后發(fā)現(xiàn)參與TG轉(zhuǎn)運(yùn)及VLDL組裝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白，是一種重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［14］。MTP參與脂蛋白組裝中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，使新合成的APOB與被MTP轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的TG結(jié)合，并且將合成的含APOB的脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外［15］，主要作用是加快膜間甘油三酯、膽固醇和磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞和亞細(xì)胞膜的組成，對(duì)含有APOB的脂蛋白的組裝分泌起限速作用［4］。有研究指出，DHA可以降低細(xì)胞內(nèi)APOB的表達(dá)，而飽和脂肪酸則會(huì)抑制Caco2細(xì)胞中MTP活性［16］。那么，富含ALA的PO又是如何影響肝臟內(nèi)MTP、APOB表達(dá)的呢？通過我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，ALA展現(xiàn)出與DHA不一樣的生物學(xué)作用，PO干預(yù)后，模型大鼠肝臟MTP、APOB基因及蛋白水平均有不同程度的升高，所以PO不但對(duì)VLDL的分泌沒有抑制作用，反而能促進(jìn)VLDL的合成與分泌。此外，我們的病理檢查結(jié)果顯示，CHF組大鼠肝臟MTP、APOB基因及蛋白表達(dá)均受到抑制，肝臟內(nèi)脂肪沉積比NC組更為嚴(yán)重，而各干預(yù)組大鼠肝臟脂肪沉積卻有所改善，這可能是模型大鼠肝臟內(nèi)VLDL分泌作用增強(qiáng)，進(jìn)而減少肝臟內(nèi)TG聚集［17］。肝臟脂肪沉積改善最明顯的20%PO替代組，對(duì)模型大鼠Mtp mRNA沒有明顯影響，卻能明顯升高Apob mRNA表達(dá)量，具體機(jī)理需要進(jìn)一步研究。而Whitney等［18］肝臟病理結(jié)果顯示，ALA比例占13.8%的菜籽油與豬油一樣可以使C57BL/6小鼠肝臟產(chǎn)生明顯的脂肪聚積，這可能菜籽油中所含ALA較低有關(guān)。

nˉ3PUFA的生物學(xué)作用與其劑量有關(guān)。例如，與DHA/EPA相同，ALA具有改善胰島素抵抗的作用，但是，在我們之前的研究中，當(dāng)給SD大鼠長時(shí)間飼喂大量ALA，也會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗［19］。而從本實(shí)驗(yàn)中可以看出，PO促進(jìn)模型大鼠肝臟Mtp mRNA、蛋白表達(dá)具有劑量依賴性，Mtp mRNA、蛋白表達(dá)量會(huì)隨著PO添加比例的增加而升高。此外，PO能促進(jìn)Apob mRNA、蛋白表達(dá)，但是均沒有劑量依賴性。

綜上所述，不同比例PO均能促進(jìn)肥胖大鼠肝臟VLDL合成與分泌，改善肝臟脂肪沉積，并且PO促進(jìn)Mtp mRNA、蛋白表達(dá)具有劑量依賴性。

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Fffects of perilla oil on the key gene expression regulating hepatic v LDL synthesis in obese rats

XIE Xian-xing，ZHANG Tao，ZHAO Shuang，AN Xing-lan，MA Lan-zhi，ZHANG Guang-zhou，LIU Yuan
（Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China）

ObjectiveThis study aims to investigate the effects of high-fat diet rich in perilla oil on the expression of key genes that regulate hepatic VLDL synthesis in obese rats.M ethodsSixty healthy male 5-week old SD rats were randomly divided into 2 groups.The rats in the normal control group（NC，n=12）were given normal diet，and the rats in the high fatgroup（HF，n=48）were given a pure high fat diet in order to induce ratmodels of obesity.In the intervention period，the obesitymodel ratswere randomly divided into 4 subgroups including consistenthigh fatgroup（CHF）and three intervention groups depending on perilla oil substitution rate of lard in CHF：20%PO，50%PO and 100%PO.The serum triglyceride（TG）of the rats wasmeasured after 4 weeks.Real-time PCR was applied to measure microsomal triglyceride transfer protein（Mtp）and apolipoprotein B（Apob）mRNA，and western blotassay was used for detecting the expression of MTP and APOB in the liver.ResultsCompared with the NC group，the CHF rats exhibited significantly high fat deposition.The serum TG wasmarkedly higher and the MTP and APOB were decreased at gene and protein levels in the CHF group compared with the NC group.After the intervention，PO remarkably reduced the level of serum TG and decreased hepatic fat deposition as it showed by pathological examination.At the gene and protein levels，MTP and APOBwere upregu-lated by PO to different degrees.ConclusionsAll the three PO intervention can promote VLDL synthesis and secretion，and decrease the hepatic fat deposition in the obese rats.Furthermore，PO upregulates the expression of MTP at gene and protein levels in a dose-dependentmanner.

n-3 polyunsaturated fatty acid；Obesity，animalmodel；Very low density lipoproteins；Rats

Q95ˉ33

A

1005-4847（2015）05-0474-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.006

2015-05-28

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（NO.31272386）。

解現(xiàn)星（1990ˉ），男，碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營養(yǎng)及代謝異常動(dòng)物模型。E-mail：xxx_ryl@163.com。［通訊作者］劉源，研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營養(yǎng)及代謝異常動(dòng)物模型研究。E-mail：bj_liuyuan@163.com。