史肖錦，屈洪黨

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽蚌埠 233000）

研究報(bào)告

脂多糖聯(lián)合MPTP誘導(dǎo)的小鼠慢性帕金森病模型的評價(jià)

史肖錦，屈洪黨*

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽蚌埠 233000）

目的建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的慢性小鼠帕金森病模型，探討其行為學(xué)和黒質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的變化情況。方法將20只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組和對照組，模型組每日腹腔注射LPS（0.25 mg/kg）一次，連續(xù)3 d，最后一次注射LPS 4 h后，每日腹腔注射MPTP（25 mg/kg）一次，連續(xù)2 d，對照組腹腔注射相同量的生理鹽水。8周后用步態(tài)分析和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評價(jià)小鼠的行為學(xué)能力，免疫組化法觀察黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）陽性細(xì)胞變化情況。結(jié)果模型組小鼠行為學(xué)變化較對照組差異有顯著性（P＜0.05），模型組小鼠中腦黒質(zhì)區(qū)顯示出嚴(yán)重的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。結(jié)論LPS聯(lián)合MPTP腹腔注射可成功誘導(dǎo)出慢性小鼠帕金森病模型，提示該模型可用于帕金森病的發(fā)病機(jī)制及藥物治療效果等相關(guān)研究。

LPS；MPTP；帕金森??；小鼠模型；酪氨酸羥化酶

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要的病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失和殘留的神經(jīng)元胞漿中路易小體形成［1］。最近的研究假設(shè)PD的發(fā)病機(jī)制可能涉及到多個(gè)起因，包括（但不局限于）暴露于環(huán)境的神經(jīng)毒素（如農(nóng)藥、重金屬）、遺傳學(xué)、生活習(xí)慣（如農(nóng)村生活環(huán)境）和氧化應(yīng)激，免疫炎癥反應(yīng)也涉及到PD病因?qū)W［2，3］。且炎癥不再被認(rèn)為僅僅是神經(jīng)退病變過程的一個(gè)附帶現(xiàn)象，相反它是一個(gè)活躍的貢獻(xiàn)者［4］。目前對PD病因和病理生理機(jī)制的認(rèn)知，主要來源于PD動物模型，因此模擬出一個(gè)能反映PD的發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)和行為學(xué)方面動物模型，是一個(gè)有待解決的問題。目前MPTP和6-OHDA等均是單一因素下誘導(dǎo)的PD模型，凋亡的多巴胺神經(jīng)元可在短時(shí)間內(nèi)自發(fā)恢復(fù)至正常，且僅僅一個(gè)因素并不能必然導(dǎo)致人類慢性多巴胺的耗竭［5］。細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng)，通過激活迷走神經(jīng)的傳入纖維及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等，進(jìn)而激活中樞炎癥過程［6］。研究表明，LPS預(yù)處理后應(yīng)用MPP+（MPTP，1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine的代謝毒物），結(jié)果顯示LPS預(yù)處理組動物模型的紋狀體DA持續(xù)性減少，超過單獨(dú)應(yīng)用MPP+組，且持續(xù)的時(shí)間也較長，表明LPS和MPTP共同作用可放大神經(jīng)退行性變的過程［7］。本實(shí)驗(yàn)通過注射LPS誘導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥后，繼續(xù)注射低劑量的MPTP誘導(dǎo)出慢性PD模型，觀察其行為學(xué)和黒質(zhì)多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞的改變情況，證實(shí)其更符合PD的緩慢進(jìn)行性發(fā)病的過程，可成為研究PD的可靠動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性12周齡的C57BL/6J小鼠，20只，體重25～27 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心【SCXK（蘇）2012-004】，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK（皖）2012-002】，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)盒內(nèi)飼養(yǎng)，每盒5只。溫度控制在18～22℃，自由飲水和攝食，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)。

1.1.2 試劑

脂多糖，MPTP，兔抗酪氨酸羥化酶抗體，生物素標(biāo)記的二抗，均購自Sigma（美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型

20只C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對照組和模型組，每組10只。模型組小鼠每日腹腔注射LPS（0.25mg/kg）一次，連續(xù)3 d。最后一天注射LPS 4 h后，繼續(xù)腹腔注射MPTP（25 mg/kg）一次，連續(xù)2 d，相當(dāng)于LPS注射3次，MPTP注射2次?？瞻讓φ战M腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.2.2 行為學(xué)檢測

（1）步長分析

自制一個(gè)長1 m、寬10 cm、高20 cm的單向通道，用同樣長寬的宣紙鋪在通道的底部，訓(xùn)練小鼠穿過通道以測量步長。將小鼠的兩后腳掌涂抹墨汁，放于通道的入口，到達(dá)另一端出口后其腳印便留在紙上，測量小鼠同側(cè)身體兩個(gè)腳印的距離，計(jì)算出平均步長。通道的開始和結(jié)束的步幅長度均不列入計(jì)算，因?yàn)樾∈笤陂_始行走時(shí)會加速步幅不規(guī)則，而出口小鼠為了逃離通道步幅會變小。

（2）轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

將小鼠置于直徑為3 cm的旋轉(zhuǎn)桿上，轉(zhuǎn)速調(diào)整為20 r/min，每次同時(shí)測定5只小鼠，每個(gè)隔室中1只。記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒開始轉(zhuǎn)動至掉離轉(zhuǎn)棒所經(jīng)歷的時(shí)間，測定時(shí)間為5 min，共測5次取平均值，同一只小鼠檢測間隔為30 min。

（3）游泳實(shí)驗(yàn)

將小鼠單獨(dú)放入一40 cm×25 cm×16 cm的有機(jī)玻璃箱中測試器游泳分?jǐn)?shù)，水深為12 cm，水溫為（27±2）℃。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：3分，3 min內(nèi)連續(xù)不斷的游泳；2分，大部分時(shí)間游泳偶爾漂?。?分，偶爾游泳；0分，四肢無活動。

1.2.3 免疫組化染色檢測小鼠黒質(zhì)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的表達(dá)

（1）制作中腦黒質(zhì)石蠟切片

對小鼠進(jìn)行水合氯醛麻醉，用生理鹽水灌流，4%多聚甲醛灌注內(nèi)固定，剝離出完整的腦組織浸入多聚甲醛中固定24 h。進(jìn)行梯度脫水、透明、石蠟包埋，在中腦黑質(zhì)區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片，選取5張切片行TH免疫組織化學(xué)染色。

（2）免疫組化步驟

烘片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L 3%過氧化氫室溫下反應(yīng)10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次×5 min，抗原修復(fù)，高火2 min，使其快速達(dá)到95℃左右，低火維持12～14 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min。5%羊血清37℃封閉，去掉多余羊血清，加入一抗4℃過夜，37℃復(fù)溫1 h，PBS沖洗3次，每次5 min。加入生物素標(biāo)記二抗，37℃室溫下反應(yīng)1 h，PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠步長分析、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)的比較

8周末進(jìn)行的行為學(xué)檢測，與對照組相比，模型組小鼠平均步長明顯減少、在轉(zhuǎn)棒上的時(shí)間明顯縮短、游泳分值明顯下降，P均＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 各組小鼠步長和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果比較（±s，n=10）Tab.1 The stride length and rotarod performance in the mice of each group

表1 各組小鼠步長和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果比較（±s，n=10）Tab.1 The stride length and rotarod performance in the mice of each group

組別G r o u p s游泳實(shí)驗(yàn)/ m i n S w i m m i n g對照組C o n t r o l 7 . 3 2 ± 0 . 6 3 6 1 8 3 . 1 0 ± 4 0 . 6 6 8 2 . 8 3 ± 0 . 4 0 8模型組M o d e l 5 . 4 1 ± 0 . 2 9 9 6 5 . 5 0 ± 2 1 . 7 5 2 1 . 5 0 ± 1 . 0 4 9步長/ c m S t r i d e l e n g t h轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)/ s R o t a r o d t e s t

2.2 黒質(zhì)酪氨酸羥化酶免疫組化結(jié)果

與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠中腦黒質(zhì)區(qū)顯示出嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷，多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，且表現(xiàn)出更多的神經(jīng)元細(xì)胞的萎縮和損壞，細(xì)胞體積變小，突起變短，纖維少而稀疏（見圖1）。

注：a：對照組；b：模型組。圖1 中腦黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)檢測（×100）Note.a：Control；b：ModelFig.1 Representative photomicrographs of TH-immunoreactive neurons in the substantia nigra ofmouse brain（×100）

3 討論

PD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，越來越多的研究顯示炎癥與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性［8］。尸檢報(bào)告顯示PD患者中腦黒質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡與小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和促炎因子的退化均有關(guān)［9］，但是其具體的機(jī)制仍未明確［10］。為了更好的研究PD的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)的治療策略，模擬出一個(gè)能反應(yīng)PD的發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)和行為學(xué)方面的慢性PD動物模型，是一個(gè)急需解決的問題。目前的6-OHDA和MPTP誘導(dǎo)的PD模型均為單一定點(diǎn)注射直接損毀小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺，不能很好的模擬PD慢性的發(fā)病過程。研究表明［11］，PD神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退化可能始發(fā)于黒質(zhì)以外的其他神經(jīng)系統(tǒng)，故利用神經(jīng)毒素聯(lián)合注入黒質(zhì)以外的部位誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型，引起越來越多的人關(guān)注。

LPS是一種內(nèi)毒素［12，13］，對神經(jīng)元無毒性作用，但它可誘導(dǎo)強(qiáng)大的先天免疫反應(yīng)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放一系列的細(xì)胞炎癥因子，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路損害和帕金森病行為學(xué)癥狀。MPTP［14］為高親脂性化合物，能有效的通過血腦屏障，主要被小膠質(zhì)細(xì)胞識別，被單胺氧化酶氧化成MPDP+，隨后自氧化成毒素MPP+。MPP+被DA神經(jīng)元攝取，阻斷線粒體復(fù)合酶I的活性，大幅度增加氧化應(yīng)激的水平，從而導(dǎo)致紋狀體多巴胺水平下降，并逐漸導(dǎo)致中腦黒質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的死亡。研究表明LPS可能會影響血腦屏障，從而影響大腦中MPTP的濃度，系統(tǒng)性注射LPS可以提高M(jìn)PTP的毒性［15］。且Gao等［16］認(rèn)為注射LPS后繼續(xù)注射MPTP會產(chǎn)生一種協(xié)同作用，后Byler等［5］利用LPS聯(lián)合MPTP腹腔注射成功誘導(dǎo)出慢性帕金森病小鼠模型，然而這種模型在國內(nèi)并未引起廣泛關(guān)注。

本研究利用LPS聯(lián)合小劑量的MPTP作用于C57BL/6J小鼠誘導(dǎo)慢性帕金森模型，8周末行為學(xué)檢測顯示模型組小鼠步長、轉(zhuǎn)棒時(shí)間和游泳分值較對照組均下降，TH免疫組化結(jié)果顯示模型組中腦黒質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組減少，且神經(jīng)元細(xì)胞體積變小，突起變短，纖維少而稀疏。提示LPS聯(lián)合小劑量的MPTP腹腔注射可成功誘導(dǎo)出PD小鼠模型，且更符合PD的緩慢發(fā)病過程，說明此種模型可用于帕金森病的病因、病理生理機(jī)制及藥物治療效果的研究。

研究表明［17］，6-OHDA和MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型僅導(dǎo)致紋狀體多巴胺短時(shí)的減少，可很快恢復(fù)至正常水平，且缺乏相應(yīng)的行為學(xué)改變，而LPS聯(lián)合MPTP模小鼠型步長縮短及黒質(zhì)紋狀體多巴胺減少至少可持續(xù)4個(gè)月。本研究結(jié)果與這一觀點(diǎn)相符合，LPS聯(lián)合MPTP小鼠模型步長縮短及黒質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷較嚴(yán)重，持續(xù)時(shí)間較長，且該模型未出現(xiàn)小鼠死亡或者誘導(dǎo)運(yùn)動功能減退失敗的情況。步長縮短是帕金森病患者身上的主要特征［18，19］，故利用步長測定進(jìn)行行為學(xué)檢測，更能反應(yīng)帕金森小鼠模型的行為學(xué)改變情況。

總之，LPS聯(lián)合MPTP腹腔注射可成功誘導(dǎo)出帕金森病小鼠模型，該模型可用于PD的發(fā)病機(jī)制和病理生理變化的研究，也可為研究藥物的治療效果提供合適的動物模型。以后可以對小膠質(zhì)細(xì)胞增生、促炎因子的表達(dá)以及突觸核蛋白的聚集的情況做出進(jìn)一步研究。

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Evaluation of a mouse model of Parkinson’s disease induced by lipopolysaccharide plus MPTP

SHIXiao-jin，QU Hong-dang
（the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China）

ObjectiveThe aim of this study was to establish a mouse model of chronic Parkinson’s disease induced by systemic administration of lipopolysaccharide plus1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP），and to study the changes of behavioral manifestation，numbers of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta.M ethodsTwenty C57BLmice were randomly divided into 2 groups：the saline control group and model group.Themice in themodel group received three intraperitoneal（i.p.）injections of LPS（0.25mg/kg），once daily for three consecutive days.Four hours following the final LPS injection，the mice received one subcutaneous injection of low-dose MPTP（25 mg/kg）.Themice of controlgroup were injected with the same volume of saline.Eightweeks later，themotor ability of the mice was evaluated by footprint test and rotarod test.The tyrosine hydroxylase（TH）-positive cellswere observed by immunohistochemical analysis.ResultsCompared with the control group，the scores of behavioral testwere significantly lower，numbers of TH immunoreactive cells were significantly less in the Parkinson’smodel group（P＜0.05）.ConclusionsBehavioralmanifestation，number of dopaminergic neurons in the substantia nigra are significantly changed in the mouse models of Parkinson’s disease produced by repeated injection of LPSplus MPTP，suggesting that this chronic animalmodel can be used in the experimental study for pathogenesis and therapy of Parkinson’s disease.

Lipopolysaccharide，LPS；MPTP；Parkinson’s disease（PD）；Ratmodel；Tyrosine hydroxylase

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0513-04

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.014

2015-05-20

蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（Byycx1406）；教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2014A163）。

史肖錦（1988ˉ），女，蚌埠醫(yī)學(xué)院碩士研究生，研究方向：神經(jīng)病學(xué)。Email：137481290@qq.com

屈洪黨，男，主任醫(yī)師， 研究方向：神經(jīng)病學(xué)的臨床、科研和教學(xué)工作。Email：qhd820@souhu.com