王曉玲 高 翔 王秋月 張玲艷

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化亞貢多糖的脫蛋白工藝研究

王曉玲 高 翔 王秋月 張玲艷

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211

目的：篩選亞貢多糖的脫蛋白工藝。方法：采用酶法脫蛋白，應(yīng)用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳工藝，以多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白脫除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察溫度、反應(yīng)時(shí)間及酶濃度對(duì)指標(biāo)的影響。結(jié)果：最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)溫度為56.2℃，反應(yīng)時(shí)間為1.27 h，酶終濃度3.7%；多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)67.5%，蛋白脫除率為80.4%。結(jié)論：該工藝簡(jiǎn)單可行，可用于亞貢多糖的純化。

亞貢；多糖；脫蛋白；Box-Behnken 響應(yīng)面法

亞貢(yacon)為菊科多年生草本植物亞貢SmallanthussonchifoliusH.Robinson的塊根，又稱(chēng)雪蓮果、雪蓮薯、菊薯、亞龍果等。常用于加工為飲料、茶及蔬菜等各種產(chǎn)品，也可作為水果直接食用。研究表明，亞貢除作為營(yíng)養(yǎng)保健品外，還具有一定的藥用價(jià)值，具有降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、改善胰島素抵抗等藥理活性[1-5]。目前，亞貢的研究主要集中在根莖中的低聚果糖及葉片中多糖的提取分離及應(yīng)用，尚未見(jiàn)亞貢根莖中多糖的研究。而植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等作用，對(duì)亞貢多糖的研究具有一定意義。多糖在提取和純化的過(guò)程中常伴有大量植物蛋白，脫蛋白成為提高多糖純度的必備工藝。常用的脫蛋白方法包括：Sevage法(正丁醇與氯仿混合)、三氯乙酸法(TCA法)、酶法。Sevage法和TC法是應(yīng)用化學(xué)試劑使蛋白變性，反應(yīng)較為強(qiáng)烈，對(duì)多糖造成一定的損耗[6]，而酶法條件較為溫和，簡(jiǎn)單易行，專(zhuān)屬性強(qiáng)。研究選用酶法，以多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白脫除率為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)酶法提取的反應(yīng)溫度、時(shí)間和酶的濃度進(jìn)行優(yōu)化，為亞貢多糖的合理開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(天津科諾儀器設(shè)備有限公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 材料 牛血清白蛋白(美國(guó) Amresco 公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250(北京鼎國(guó)昌盛公司)；木瓜蛋白酶(8×105U/g，上海士鋒生物科技有限公司)；所用試劑均為分析純。

亞貢購(gòu)于天津市南開(kāi)區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張堅(jiān)老師鑒定為亞貢SmallanthussonchifoliusH.Robinson的塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 亞貢多糖的提取 將亞貢洗凈、切片，于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩，取亞貢干粉末500 g，加20倍量80%乙醇浸提2 h，溫度為90℃，過(guò)濾，提取液減壓濃縮至一定體積，加入適量95%乙醇，4℃冰箱過(guò)夜，8000 r/min 離心10 min，棄上清得沉淀[7]。冷凍干燥后得粗多糖，測(cè)定粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.4%。

2.2 葡萄儲(chǔ)備液的配置 稱(chēng)量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品2.86 mg至10 ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，放置4℃冰箱，為儲(chǔ)備液備用。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別吸取葡萄糖儲(chǔ)備液0、2、4、6、8、10 ml置于50 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度。依次吸取不同濃度的葡糖糖稀釋液1.0 ml，置干燥試管中，分別加5%苯酚1.0 ml，混勻，在沿試管壁緩緩加入濃硫酸5.0 ml，搖勻，室溫放置30 min后，以取蒸餾水1.0 ml作為空白對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，以葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：C=109.1A+ 2.997，相關(guān)系數(shù)r=0.9986。

2.4 蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液的配置 稱(chēng)取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品7.41 mg，移至50 ml棕色容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻，備用。

2.5 蛋白質(zhì)線(xiàn)性關(guān)系考察 分別吸取不同濃度蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置于10 ml的容量瓶中，依次向各試管中加入1 ml的各組稀釋液和3 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，以蒸餾水稀釋?zhuān)ㄈ葜量潭?；空白組加入1 ml的蒸餾水，室溫放置30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為595 nm。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)吸光度(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得方程為：C=181.3A+ 2.971，相關(guān)系數(shù)r=0.9982。

2.6 多糖測(cè)定 吸取樣品溶液1.0 ml，按“2.3”項(xiàng)測(cè)定方法操作，得到吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算樣品中多糖含量。

2.7 蛋白質(zhì)的測(cè)定 吸取樣品溶液1.0 ml，按“2.5”項(xiàng)定方法操作，得到蛋白質(zhì)吸光度值，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。

2.8 脫蛋白工藝優(yōu)化 精確配置0.8 g/ml的多糖溶液，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和木瓜蛋白酶濃度3作為考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件，設(shè)計(jì)3因素3水平分析方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1、2。

將結(jié)果輸入Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析和二項(xiàng)式擬合，以O(shè)D值為Y值，提取溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶終濃度為自變量，模型方程為：Y=73.89+5.27X1+6.90X2+17.21X3+5.71X1X2+2.73X1X3+1.53X2X3-15.14X12-12.41X22-11.52X32。R2=0.9925，擬合優(yōu)度較佳，可進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

經(jīng)過(guò)二項(xiàng)式方程模擬和工藝預(yù)測(cè)分析得出，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到68.4%，蛋白脫除率最大值為78.3%，最優(yōu)工藝條件溫度56.2℃，反應(yīng)時(shí)間1.27 h，酶終濃度3.7%。3個(gè)因變量對(duì)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白脫除率總評(píng)歸一值的影響效果圖見(jiàn)圖1。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 將“2.8”的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.5%，偏差為1.3%；蛋白脫除率為80.4%，偏差為-2.7%。

3 討論

多糖存在于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，是生命體的基本組成部分，參與多種生命功能活動(dòng)。多糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、延緩衰老、抗輻射、降血糖、降血脂等廣泛藥理活性。亞貢除作為營(yíng)養(yǎng)保健品外，還具有一定的藥用價(jià)值，有較為廣泛的開(kāi)發(fā)利用前景，且不同來(lái)源的多糖對(duì)機(jī)體的免疫功能具有不同程度的調(diào)節(jié)作用。亞貢多糖具有一定抗氧化活性[7]，而其他藥理活性有待發(fā)現(xiàn)。TCA法除蛋白的原理是沉淀蛋白質(zhì)，對(duì)蛋白的清除率比較大，但會(huì)導(dǎo)致多糖的大量降解[8]。酶法原理是水解蛋白質(zhì)，反應(yīng)條件溫和，避免了多糖的大量降解，無(wú)污染，使蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到理想狀態(tài)，而使多糖的損失率降至最低。實(shí)驗(yàn)通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)酶法水解蛋白條件進(jìn)行優(yōu)化分析，確定了最佳水解蛋白的工藝條件，產(chǎn)品也由黑色粉末轉(zhuǎn)變?yōu)榛野咨勰?，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由42.1%提高到67.5%，提高了亞貢多糖的純度，為亞貢多糖的綜合利用提供新的途徑。

[1] De Almeida Paula HA, Abranches MV, de Luces Fortes Ferreira CL. Yacon (Smallanthussonchifolius): a food with multiple functions [J]. Crit Rev Food Sci Nutr. 2015,55(1):32-40.

[2] Russo D, Malafronte N, Frescura D, Antioxidant activities and quali-quantitative analysis of differentSmallanthussonchifolius[(Poepp. and Endl.) H. Robinson] landrace extracts [J]. Nat Prod Res. 2014 ,23(12):1-5.

[3] Oliveira GO, Braga CP, Fernandes AA. Improvement of biochemical parameters in type 1 diabetic rats after the roots aqueous extract of yacon [Smallanthussonchifolius(Poepp.and Endl.)] treatment [J]. Food Chem Toxicol. 2013,59(11):256-260.

[4] Satoh H, Audrey Nguyen MT, Kudoh A. Yacon diet (Smallanthussonchifolius, Asteraceae) improves hepatic insulin resistance via reducing Trb3 expression in Zucker fa/fa rats [J]. Nutr Diabetes, 2013,27(5):70.

[5] Delgado GT, Thomé R, Gabriel DL, Yacon (Smallanthussonchifolius)-derived fruct polisaccharides improves the immune parameters in the mouse [J]. Nutr Res. 2012,32(11):884-92.

[6] 殷洪梅，尚強(qiáng)．金銀花多糖脫蛋白方法研究[J]．中草藥，2010，41(4)：585.

[7] 朱振元，連紅玉，陳婧，等. 雪蓮果水溶性粗多糖提取分離工藝優(yōu)化[J]．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2011，27(S1)：397-401.

[8] 何沂飛，劉平懷，黃良果，等．庫(kù)拉索蘆薈凝膠多糖脫蛋白方法研究[J]．食品工業(yè)科技，2014，35(17)：190-192.

Study on Deproteinization from Polysaccharides ofSmallanthussonchilius

WANG Xiaoling GAO Xiang WANG Qiuyue ZHANG Lingyan

The Second Hospital of Tianjin Medicine University, Tianjin 300211, China

Objective To optimum conditions for deproteinization form polysaccharides ofSmallanthussonchilius. Methods Box-Behnken Design-Response surface methodology was used to optimize the process of deproteinization and the method was evaluated by the ratio of protein removing and the mass fraction of polysaccharide. Results The better conditions for the deproteinization of crude polysaccharide fromSmallanthussonchiliuswere that the temperature was 56.2℃, the final concentration of enzyme was 3.7%(m/v) and the reaction time was 1.27 h. Under these conditions, the content of crude polysaccharide was 67.5% and percentages of protein removing of crude polysaccharide was 80.4%. Conclusion The method of enzyme effective method for removal of protein.

Smallanthussonchilius; Polysaccharides; removal of protein; Box-Behnken Design-Response surface methodology

王曉玲，本科，中藥師，從事中藥開(kāi)發(fā)研究。E-mail:lingling861209@126.com

R914.1

A

1007-8517(2015)18-0012-02

2015.06.15)