郝天羽，劉海萍，唐 寧，仉 燕

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院生殖中心，山東 濟南 250000)

卵泡液和胚胎培養(yǎng)液LIF與IVF-ET結局的關系

郝天羽，劉海萍，唐 寧，仉 燕

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院生殖中心，山東 濟南 250000)

目的 探討卵泡液和胚胎培養(yǎng)液中白血病抑制因子(LIF)的表達水平與體外受精-胚胎移植(IVF-ET)結局的關系。方法 收集取卵日卵泡液、胚胎移植及冷凍后胚胎培養(yǎng)液，檢測卵泡液中LIF、雌二醇(E2)、孕酮(P)和胚胎培養(yǎng)液中LIF的水平，分析卵泡液和胚胎培養(yǎng)液LIF與卵子質量、胚胎質量及臨床結局的關系。結果 妊娠組胚胎培養(yǎng)液中LIF濃度顯著高于未妊娠組(t=5.785，P<0.05)，而妊娠組卵泡液P濃度顯著低于未妊娠組(t=4.475，P<0.05)。兩組卵泡液LIF、E2濃度差異無統(tǒng)計學意義(t值分別為1.305、0.680，均P>0.05)。卵泡液LIF濃度與獲卵數(shù)、成熟卵子率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率、E2均呈顯著正相關(r值分別為0.285、0.394、0.302、0.387、0.476，均P<0.05)，卵泡液LIF與受精率、卵泡液P無顯著相關性(r值分別為0.050、0.243，均P>0.05)。卵泡液LIF與移植胚胎胚胎培養(yǎng)液中LIF無顯著相關性(r=0.107，P>0.05)。優(yōu)質胚胎培養(yǎng)液中LIF水平顯著高于劣質胚胎培養(yǎng)液中LIF水平(t=8.334，P<0.05)。結論 卵泡液中LIF與E2、卵母細胞質量有關，可以根據(jù)卵泡液中LIF評估卵母細胞的質量。胚胎培養(yǎng)液中LIF可以作為預測胚胎質量和妊娠結局的依據(jù)。

體外受精-胚胎移植；白血病抑制因子；卵泡液；胚胎培養(yǎng)液

隨著輔助生殖技術的發(fā)展，越來越多的不孕癥患者通過體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)實現(xiàn)了妊娠生子的愿望。如何準確、客觀的評價胚胎質量，以此來選擇植入潛力較強的胚胎，提高IVF-ET的妊娠率，是需要深入研究的問題。本研究旨在通過檢測IVF-ET患者卵泡液及胚胎培養(yǎng)液中白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF)的表達，討論LIF與卵子質量、胚胎發(fā)育及IVF-ET結局的關系，并進一步探討卵泡液中LIF的表達與相應的移植胚胎培養(yǎng)液中LIF表達的關系，為臨床評估卵母細胞和移植胚胎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年5至10月在濟南軍區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心首次行IVF-ET的不孕患者共48人，年齡22～35歲，平均年齡29.40± 3.76歲，不孕年限3.58±1.61年，不孕原因為女方單純輸卵管梗阻或男方因素，女方性激素檢查正常，排除多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)，近3個月內未應用激素類藥物，無泌尿生殖系統(tǒng)感染性疾患，無嚴重的心血管、肝腎疾病，IVF-ET術前常規(guī)體格檢查均未見異常。

1.2 研究方法

1.2.1 超促排卵、取卵、移植

均采用長方案超促排卵(controlled ovarian hypersti￣mulation，COH)，于IVF-ET前1個月經(jīng)周期的黃體中期給予長效促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)，于月經(jīng)周期第3天檢查患者達到垂體降調節(jié)標準后開始每日肌注促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)，陰道超聲檢查當主導卵泡中有1個直徑達18mm或3個達17mm時，或者外周血的雌二醇(estradiol,E2)水平達每個主導卵泡200～300pg/mL時，于當日20:00至22:00肌注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)5 000～10 000IU，在注射hCG后36～38小時后經(jīng)陰道超聲顯像引導下行卵泡穿刺術，根據(jù)患者具體情況行體外受精，受精后2～3天，選擇形態(tài)學評分高的2個胚胎進行移植，其他多余的可移植胚胎進行冷凍保存。黃體支持從取卵日開始。在胚胎移植后的第14天，檢測hCG以判斷是否妊娠，如hCG陽性，則繼續(xù)黃體支持，2～3周后行陰道超聲檢查，宮腔內見孕囊、卵黃囊及原始心管搏動者確定為臨床妊娠。

1.2.2 胚胎質量的評估

受精卵卵裂成4～8細胞階段的胚胎時，進行胚胎評分。

1級：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻、數(shù)目均等，細胞質均一、無空泡，碎片不超過5%;2級：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，細胞質均一、無空泡，碎片占5%～10%;3級：胚胎發(fā)育速度大致正常，卵裂球不均勻/均勻、數(shù)目不均等/均等，細胞質中有少量空泡，碎片少于15%;4級：胚胎發(fā)育速度異常，卵裂球不均勻、數(shù)目不均等，細胞質不均一、有大量空泡，碎片占10%～50%。

優(yōu)質胚胎為形態(tài)學評分為1級或2級的胚胎，劣質胚胎為形態(tài)學評分3級或4級的胚胎。

1.2.3 標本采集

1.2.3.1 卵泡液的收集 經(jīng)陰道超聲顯像引導下，負壓抽吸直徑≥15mm的卵泡，留取第1管無血且不含卵泡沖洗液的卵泡液，立即置于離心機中，3 000rpm，離心10min，吸取上清液裝入無菌試管，標記后貯存于-20℃冰箱保存，待測。

1.2.3.2 胚胎培養(yǎng)液的收集 收集每例患者移植后的胚胎培養(yǎng)液及冷凍后的優(yōu)質與劣質胚胎培養(yǎng)液各1份，分別裝入EPP管，標記后貯存于冰箱-20℃冰箱保存，待測。

1.2.4 標本檢測

1.2.4.1 卵泡液雌二醇和孕酮的檢測 采用化學發(fā)光法測定卵泡液中E2和孕酮(progesterone，P)，所有測定數(shù)據(jù)均由與其連接的計算機程序處理后得出結果。E2檢測靈敏度為20pg/mL，P檢測靈敏度0.1ng/mL。

1.2.4.2 卵泡液和胚胎培養(yǎng)液白血病抑制因子的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)雙抗體夾心法檢測卵泡液和胚胎培養(yǎng)液中LIF的濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 妊娠組與未妊娠組一般臨床資料的比較

根據(jù)IVF-ET妊娠結局分為妊娠組和未妊娠組。妊娠組與未妊娠組患者的年齡、不孕時間、Gn用藥天數(shù)、Gn用量、獲卵數(shù)、成熟卵子率、受精率方面無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。妊娠組的卵裂率顯著高于未妊娠組(χ2=3.778，P<0.05)。妊娠組的優(yōu)質胚胎率高于未妊娠組，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.195，P>0.05)，見表1。

2.2 妊娠組與未妊娠組白血病抑制因子及卵泡液性激素水平的比較

妊娠組胚胎培養(yǎng)液中LIF濃度顯著高于未妊娠組(t=5.785，P<0.05)，而妊娠組卵泡液P濃度顯著低于未妊娠組(t=4.475，P<0.05)。兩組卵泡液LIF、E2濃度差異無統(tǒng)計學意義(t值分別為1.305、0.680，均P>0.05)，見表2。

2.3 卵泡液白血病抑制因子與臨床指標的關聯(lián)性分析

卵泡液LIF濃度與獲卵數(shù)、成熟卵子率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率、E2均呈顯著正相關值(r值分別為0.285、0.394、0.302、0.387、0.476，均P<0.05)，卵泡液LIF與受精率、卵泡液P均無顯著相關性(r值分別為0.050、0.243，均P>0.05)。

2.4 卵泡液白血病抑制因子與胚胎培養(yǎng)液中白血病抑制因子的關聯(lián)性分析

卵泡液LIF與移植胚胎胚胎培養(yǎng)液中LIF無顯著相關性(r=0.107，P>0.05)。

2.5 優(yōu)質胚胎與劣質胚胎培養(yǎng)液中白血病抑制因子的比較

收集妊娠組與未妊娠組各級胚胎培養(yǎng)液共145份，分為優(yōu)質胚胎培養(yǎng)液(n=77)和劣質胚胎培養(yǎng)液(n=68)，優(yōu)質胚胎培養(yǎng)液中LIF水平為13.89±8.78pg/mL，顯著高于劣質胚胎培養(yǎng)液中LIF水平10.35±5.35pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.334，P<0.05)。

3 討論

卵泡液中含有的調節(jié)卵母細胞生長發(fā)育的細胞因子在生殖系統(tǒng)中的作用引起了研究者的關注，LIF是其中之一。LIF是白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)家族中的一員，是一種有多種生物學活性的細胞因子。90年代以來，相繼發(fā)現(xiàn)其在胚胎的發(fā)育、分化、著床及卵泡的生長等方面起著關鍵作用，對于LIF在生殖的不同環(huán)節(jié)中的作用的研究越來越深入。

3.1 白血病抑制因子與卵子發(fā)育

卵泡液為卵母細胞成熟的微環(huán)境，其中含有調節(jié)卵母細胞生長發(fā)育的生長因子和細胞因子。Coskun等于1998年在人卵泡液中檢測到LIF，而同期外周血中卻難以檢測到。本研究結果發(fā)現(xiàn)，妊娠組胚胎培養(yǎng)液中LIF濃度顯著高于未妊娠組(P<0.05)，且卵泡液LIF濃度與獲卵數(shù)、成熟卵子率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率、E2均呈顯著正相關值(均P<0.05)，提示LIF在卵巢局部產(chǎn)生，可能通過自分泌和(或)旁分泌發(fā)揮作用，促進卵母細胞的發(fā)育、成熟和排卵，從而進一步提高卵裂率，增加優(yōu)質胚胎的數(shù)目。將山羊的卵巢組織體外培養(yǎng)，含LIF的培養(yǎng)液中的卵巢組織的始基卵泡減少而初級卵泡增多，證明LIF能促進始基卵泡的活化，并能維持竇前卵泡的發(fā)育[1]。De Matos等[2]研究證實LIF可以誘導體外培養(yǎng)的人和小鼠卵丘復合體的卵丘擴展，體外培養(yǎng)液中加入重組FSH和LIF能顯著提高小鼠卵母細胞的質量，提高小鼠胚胎的卵裂率、囊胚形成率和分娩率。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠LIF作為顆粒細胞和卵泡膜細胞的增殖因子能促進竇前卵泡的生長[3]。在IVF-ET取卵后，除肉眼評估卵母細胞質量外，還可根據(jù)卵泡液中LIF的含量客觀評價卵子質量，為評價卵子質量提供了要依據(jù)。

3.2 白血病抑制因子與胚胎發(fā)育和分化

Fukunaga等[4]在獼猴ESC分化培養(yǎng)液中加入LIF，發(fā)現(xiàn)LIF能抑制細胞減數(shù)分裂，增加堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的陽性細胞數(shù)目，表明體外分化培養(yǎng)液中加入LIF能促進獼猴ESC向生殖細胞的分化。Telugu等[5]研究發(fā)現(xiàn)依賴LIF的信號傳遞，豬囊胚內細胞團可以分化成多能干細胞。Neira等[6]在牛胚體外培養(yǎng)液中加入胰島素樣生長因子Ⅰ、Ⅱ(insulin-like growth，IGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)和LIF后，發(fā)現(xiàn)這些因子聯(lián)合作用后能促進受精后第9天牛胚的孵化。Mitchell等[7]將2細胞期鼠胚分成兩組進行體外培養(yǎng)，一組加入5 000IU/mL的抗多克隆抗體，另一組加入5 000IU/mL的LIF，當培養(yǎng)至擴張的囊胚期時，移植入假孕鼠的宮腔內，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，加LIF組的胚胎的植入率、妊娠率明顯增加。Choi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，豬卵母細胞和孤雌生殖胚胎的體外培養(yǎng)液中加入重組人LIF，能促進卵子的成熟和胚胎發(fā)育。本研究中，妊娠組胚胎培養(yǎng)液中LIF濃度顯著高于未妊娠組(P<0.05)，且優(yōu)質胚胎組的LIF水平也高于劣質胚胎組(P<0.05)，提示胚胎培養(yǎng)液中LIF的水平高，其所對應的胚胎質量好，同時該胚胎也具有更好的發(fā)育潛能，利于著床。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，卵泡液中LIF水平與胚胎培養(yǎng)液中LIF水平無顯著相關性(P>0.05)，可能因為采集卵泡液來自多個卵泡，其中的LIF反映的是多個卵泡液LIF的平均水平，胚胎培養(yǎng)液中LIF來自移植的2個胚胎，無法判斷移植的胚胎是否是由采集的卵泡液中的卵子發(fā)育而來。

3.3 卵泡液中白血病抑制因子與雌二醇和孕酮的調控關系

動物實驗證明，切除卵巢的兔體內檢測不到LIF的表達，但是P可使LIF表達上調，而雌孕激素同時作用時則產(chǎn)生輕度的下調作用[9]。在人類，Piccinni等[10]研究發(fā)現(xiàn)P能誘導T細胞產(chǎn)生LIF，而LIF也受IL-4的調控，但Sawai等于1997年研究認為E2能促進LIF的產(chǎn)生，LIF的量隨E2劑量的增加而增加，呈劑量依賴關系，而P和皮質類固醇激素沒有這種作用。本研究結果發(fā)現(xiàn)，卵泡液中LIF水平與卵泡液中E2呈顯著正相關(P<0.05)，與卵泡液中P無顯著關聯(lián)性(P>0.05)。推測在IVF-ET周期COH過程中，根據(jù)患者外周血E2水平判斷卵子的成熟度，外周血的E2是由卵巢合成及分泌的，卵泡液中的E2水平隨卵泡的發(fā)育而增加，于排卵前達高峰，卵泡液中的E2也反映卵子的成熟程度，研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中LIF水平與卵子質量呈正相關[2]，提示卵泡液中LIF水平與E2有關。目前關于E2和P調節(jié)人LIF表達尚存在許多爭議，不同物種間E2和P對LIF的作用有不同，推測可能為E2和P對LIF的表達的調節(jié)機制在不同分子水平、不同效應水平有差異，其機制需要進一步研究。

綜上所述，本研究證實IVF-ET患者卵泡液和移植胚胎培養(yǎng)液中均表達LIF，卵泡液中LIF可以反映卵母細胞的質量，而胚胎培養(yǎng)液中LIF反映了胚胎的發(fā)育和種植潛能，預示著較好的妊娠結局。采用ELISA雙抗夾心法檢測卵泡液和胚胎培養(yǎng)液中LIF的表達情況可以為臨床工作中優(yōu)選卵母細胞和移植胚胎的提供一種新的、有效的非侵入性途徑。

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[專業(yè)責任編輯：呂淑蘭]

Relationship between the level of LIF in follicular fluid and embryo culture media and IVF-ET outcomes

HAO Tian-yu, LIU Hai-ping, TANG Ning, ZHANG Yan

(ReproductiveMedicineCentre,GeneralHospitalofJinanMilitaryArea,ShandongJinan250000,China)

Objective To explore the relationship between the level of leukaemia inhibitory factor (LIF) in follicular fluid and embryo culture media and the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). Methods Follicular fluid on the day of oocyte retrieval and embryo culture media after transfering and freezing were collected. The level of LIF, estradiol (E2), progesterone (P) in follicular fluid and level of LIF in embryo culture media were measured to analyze the relationship among LIF with the quality of oocyte, embryo and the outcomes of IVF-ET. Results The level of LIF in embryo culture media was significantly higher and the level of P in follicular fluid was lower in the pregnant group than in non-pregnant group (tvalue was 5.785 and 4.475, respectively, bothP<0.05). But there was no significant difference in the levels of LIF and E2in follicular fluid between two groups (tvalue was 1.305 and 0.680, respectively, bothP>0.05). The level of LIF in follicular fluid was positively correlated with the number of retrieval oocyte, the rate of mature oocyte, cleavage rate, high quality embryo rate and E2(rvalue was 0.285, 0.394, 0.302, 0.387 and 0.476, respectively, allP<0.05), but it was not correlated with fertility rate and P (rvalue was 0.050 and 0.243, respectively, bothP>0.05). There was no obvious correlation between LIF in follicular fluid and LIF in embryo culture media after transferring (r=0.107,P>0.05). The level of LIF in embryo culture media of high quality was significantly higher than poor quality (t=8.334,P<0.05).Conclusion The level of LIF in follicular fluid is correlated with E2and the quality of oocyte, and the quality of oocyte can be assessed according to the level of LIF. The LIF in embryo culture media can be used to predict the quality of embryo and outcomes of IVF-ET.

in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET); leukaemia inhibitory factor (LIF); follicular fluid; embryo culture media

2014-08-22

郝天羽(1963-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事不孕癥和輔助生殖技術的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.011

R711.7

A

1673-5293(2015)01-0027-04