趙駿秀，王漢斌

肉毒中毒診斷與治療的研究現(xiàn)狀

趙駿秀，王漢斌

肉毒神經(jīng)毒素（BoNT）是毒性最劇烈的神經(jīng)毒素之一，它可通過食物、腸道感染、外傷、注射、作為生物化學(xué)戰(zhàn)劑等途徑中毒，其中食源性肉毒中毒最常見。隨著科技的進步，越來越多的人開始注重生活質(zhì)量，因而通過注射肉毒毒素消除皺紋、瘦臉、塑小腿等而導(dǎo)致肉毒中毒的病例越來越多，肉毒也因此被人們熟知。并且，因其具有極強的毒性、制備方便及抗毒素的缺乏，使BoNT已成為A類生物化學(xué)戰(zhàn)劑。重度肉毒中毒可因呼吸衰竭而死亡，故早期診斷與治療尤其重要，本文對近年來臨床上常用的診斷手段與治療方法作一綜述。

肉毒神經(jīng)毒素；診斷；治療

肉毒神經(jīng)毒素（BoNT）是能引起致命麻痹性的一種蛋白質(zhì)，分為7種血清型（A-G），其中自然存在的A、B、E和F型毒素能夠造成人類中毒，C、D型則常引起動物、禽類中毒，G型引起人類中毒的報道較少。根據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心公布，其具有極強的毒性，生產(chǎn)方便以及抗毒劑的缺乏使它成為一種A類生物威脅制劑[1]。BoNT通過抑制乙酰膽堿在胞外分泌的外周膽堿能，包括神經(jīng)肌肉接頭及副交感神經(jīng)突觸間的傳遞，從而導(dǎo)致肌肉麻痹[2]?，F(xiàn)將近年來對肉毒中毒診斷及臨床治療的進展作一綜述。

1 臨床診斷及實驗室檢查

1.1 具備以下條件即可臨床診斷[3]（1）可疑食物進食史，群體發(fā)??；（2）典型的眼部癥狀，口咽肌、四肢肌受累，呼吸肌無力，特別是序貫發(fā)生，無感覺神經(jīng)障礙；（3）排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病如吉蘭-巴雷綜合征、重癥肌無力、進行性肌營養(yǎng)不良等。

1.2 電生理檢查

1.2.1 腦電圖[4（]EEG）EEG可作為食物性肉毒中毒診斷的一項檢查手段，尤其在中度、重度中毒時EEG可出現(xiàn)明顯異常；隨著食物性肉毒中毒程度的加重，EEG異常率增高，劉燕敏[4]回顧性分析32例肉毒中毒患者有22例EEG異常，異常率為68.75%，主要表現(xiàn)為局限性或彌漫性慢波化、α波前移、背景活動呈低壓狀態(tài)。EEG可作為判斷食物性肉毒中毒嚴(yán)重程度的指標(biāo)，也可作為食物性肉毒中毒預(yù)后判斷的一種重要檢查手段。

1.2.2 肌電圖（EMG） 肌電圖的檢查有助于肉毒中毒的診斷，法國學(xué)者Zouari等[5]報道了本病肌電圖特點：肌肉動作電位波幅減低；高頻（20 Hz）重復(fù)刺激波幅遞增至少100%；低頻（3 Hz）重復(fù)刺激遞減至少10%。EMG可出現(xiàn)短暫的小振幅而密集的運動單位動作電位，這種圖形的出現(xiàn)與神經(jīng)損害持續(xù)時間相一致。臨床癥狀好轉(zhuǎn)后，肌電圖亦恢復(fù)正常。

1.3 肉毒毒素檢測

1.3.1 小鼠生物學(xué)試驗法 國際上最早確立的檢測BoNT的標(biāo)準(zhǔn)方法是小鼠生物學(xué)試驗法。這種方法是迄今為止最敏感、最可靠的BoNT檢測方法，可以實現(xiàn)對皮克（腭）級毒素的定量檢測[7]。小鼠生物學(xué)實驗可以分為小鼠致死性實驗和小鼠非致死性實驗。小鼠致死性實驗常用于糞便、血清、腸道、創(chuàng)傷、食物樣本和細菌培養(yǎng)物上清中毒素的檢測。但小鼠致死性實驗價格昂貴、費力、耗時長且有倫理限制，故世界上僅有少數(shù)實驗室采用該法。此方法操作困難，需要較高的技術(shù)，故國內(nèi)較少采用。非致死性小鼠實驗與常規(guī)小鼠試驗敏感性相當(dāng)，且不會導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生不良反應(yīng)和運動損害。然而非致死性小鼠實驗旨在用于純化毒素的效價測定，故其用于復(fù)雜樣本的調(diào)查尚未經(jīng)過驗證[8]。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 用PCR方法檢測編碼神經(jīng)外毒素的肉毒梭菌基因快捷、可靠。1999年，王興民等[9]運用多重PCR方法成功檢測了C、D型肉毒梭菌，靈敏度分別為450 Pg和10 pg。2001年，Lindst rom等[10]運用多重PCR方法同時進行A，B，E和F型肉毒梭菌的檢測，目前國內(nèi)外廣泛采用這種方法[8]。

1.3.3 免疫學(xué)檢測方法 免疫學(xué)方法是利用BoNT特異性的診斷抗體而建立的一種檢測方法，也逐漸成為目前常用的一種檢測BoNT的重要手段，如免疫雙擴試驗（DD）、反向乳膠凝集試驗（RPLA）、協(xié)同凝集試驗（COA）等；與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的還有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、熒光抗體檢測技術(shù)（FIA）、放射免疫技術(shù)（RIA）和膠體金免疫層析（GICA）技術(shù)等[6]。ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的檢測方法，而GICA是操作簡單，發(fā)展最快，前景最廣的方法。

1.3.4 質(zhì)譜技術(shù) 可以直接檢測BoNT蛋白，該方法比小鼠生物學(xué)試驗快速，比ELISA靈敏，且沒有交叉反應(yīng)現(xiàn)象。但儀器昂貴，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，而且對樣品的前處理技術(shù)要求比較高[6]。

1.3.5 基因芯片技術(shù) 近幾年，有研究者將熒光技術(shù)與芯片技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了微流控裝置對生物毒素進行分析，已經(jīng)應(yīng)用于BoNT/A的檢測及其拮抗劑的篩選[6]。

1.3.6 生物傳感技術(shù) 針對BoNT的檢測，目前已經(jīng)發(fā)展的多是以光學(xué)檢測元件作為信號轉(zhuǎn)換器的生物傳感器，如時間分辨熒光光纖生物傳感器、光尋址電位傳感器、順磁珠電化學(xué)發(fā)光傳感器等。用時間分辨熒光分析法檢測A型和B型BoNT只需要2 h，靈敏度達到4～20 pg/ml[6，11]。

2 治療與預(yù)防

2.1 治療

2.1.1 馬血清抗體（多克隆抗體PAbs） 自1960年以來肉毒抗毒素已經(jīng)存在，并主要為馬血清免疫球蛋白產(chǎn)品[12]。雖然只有馬血清抗毒素應(yīng)用于臨床，但這種蛋白進入人體后屬于異源蛋白，易引起副作用，如引起血清病等。自2010年3月起，七價肉毒抗毒素（H-BAT）已取代已授權(quán)的A、B型二價肉毒抗毒素和實驗用E型肉毒抗毒素來治療非嬰兒肉毒中毒[13]。H-BAT可用于治療A-G七型肉毒中毒者。我國蘭州生物制品研究所已生產(chǎn)出A-G七型肉毒抗毒素。國內(nèi)有報道，診斷肉毒中毒后，根據(jù)田英平等[3]抗毒素治療方案應(yīng)用A型及B型肉毒抗毒素（蘭州生物研究所生產(chǎn)）取得較好療效。目前，針對是否在確定哪種類型肉毒神經(jīng)毒素前給予肉毒抗毒素，在接觸BoNT后多長時間給予抗毒素，仍有爭議。肉毒抗毒素只中和循環(huán)毒素，因此應(yīng)在完成實驗室測試之前盡快給藥[14]。肉毒抗毒素主要為被動免疫治療。在接觸到BoNT后很快給予抗體，有可能會完全防止中毒。如果間隔較長時間，將不會起到更完全的抵抗作用，但是疾病的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間可以被減少。如果間隔時間太長，將不會起到抵抗作用或其他用處[15]。

2.1.2 單克隆抗體（monoclonal antibodies，MAbs） 重組的MAbs藥物是治療肉毒毒素中毒新的研究方向。眾多的MAbs已經(jīng)被純化，并且它的保護作用針對于不同類型的毒素[16]。高度保護單克隆組合是和馬源性多克隆抗體一樣，但是PAbs有一些局限性，MAbs可克服這一障礙，具有人性化的MAbs制成的單克隆抗體制劑，比目前的馬源性多克隆抗體藥物更安全更充足[17]。

2.1.3 藥物拮抗劑 目前無特效解毒藥，所以藥物拮抗劑仍處于研究發(fā)展階段。一些金屬蛋白酶抑制劑、鋅離子試劑可以抑制肉毒神經(jīng)毒素的輕鏈活性。藥物拮抗劑的主要好處是，它能進入神經(jīng)細胞溶質(zhì)和阻止輕鏈的催化活性[15]。

2.1.4 基因工程抗體BoNT基因抗體產(chǎn)量高安全性好，作為開發(fā)中的候選抗體具有廣闊的應(yīng)用前景，有取代馬血清抗毒素的潛力[2]。目前處于試生產(chǎn)階段，還未上市。

2.1.5 人類免疫球蛋白（BIG）1991年7月美國陸軍首次使用靜脈注射人類免疫球蛋白[18]。人類免疫球蛋白是從肉毒素免疫人血清中提取，應(yīng)用方法已很成熟，特別對嬰幼兒肉毒中毒已成為主要的解毒措施[19]。BIG半衰期為28天，通常給藥一次，抗毒效果可達半年[20]。

2.1.6 對癥治療 肉毒中毒常導(dǎo)致呼吸肌麻痹，所以保持呼吸道通暢及改善呼吸功能尤其重要，必要時可實施機械通氣。對于食源性肉毒中毒，應(yīng)早期進行催吐、洗胃、導(dǎo)瀉、灌腸，以排出尚未吸收的毒劑。對于外傷性肉毒中毒，應(yīng)盡早清理創(chuàng)口，合理使用抗生素。

2.2 預(yù)防——疫苗

2.2.1 類毒素疫苗 自1965年以來，五價（A-E）肉毒梭菌類毒素疫苗是唯一用于預(yù)防在公共衛(wèi)生實驗室工作的人員，以及在研究和生產(chǎn)設(shè)施處于危險之中的工作人員[21-22]。截至2011年11月，美國疾病控制和預(yù)防中心不再提供這種疫苗，因為其免疫原性已顯著下降，使得其對肉毒桿菌的抵抗不可靠[21-22]。類毒素疫苗也存在如下缺陷：天然肉毒梭菌產(chǎn)生的BoNT數(shù)量少，純化困難，在疫苗制備過程中直接接觸毒素的危險性高，需要多次加強免疫接種，并且接種后有一定副作用[2]。

2.2.2 二價重組亞單位疫苗 利用巴斯德畢赤酵母作為表達工程菌表達BoNT/A-HC和BoNT/B-HC亞單位疫苗的研究備受關(guān)注，已經(jīng)進入了臨床試驗階段。對A、B亞型的BoNT-HC抗原進行了組合，構(gòu)建的二價重組亞單位疫苗被命名為rBVA/B[2]。目前，美國國防部提供重組肉毒桿菌疫苗（rBV的A/B）來防止軍事人員感染生化武器肉毒神經(jīng)毒素A和B[22-23]。

BoNT引起遲緩性麻痹，如不及時治療可會致命[24]。而目前，除肉毒抗毒素外，肉毒中毒無特效解毒藥，藥物拮抗劑正處于研究發(fā)展階段。它可以進入神經(jīng)細胞溶質(zhì)和阻止輕鏈的催化活性，來抑制肉毒神經(jīng)毒素的輕鏈活性。因此，藥物拮抗劑將會成為肉毒中毒防治的新途徑?；蚬こ讨泻涂贵w是目前研發(fā)治療肉毒中毒的主攻方向，有取代馬血清抗毒素的趨勢，但仍處于實驗室研究或臨床前的中試生產(chǎn)階段，還未批準(zhǔn)上市。但這些已為肉毒中毒的治療提供了明確方向。

[1]Patel K，Cai S，Singh BR.Cur rent st rategies for designing antidotes against botul inum neurotoxins[J].Exper t Opin Drug Discov，2014，9（3）：319-333.

[2]游哲榮，王景林.肉毒毒素疫苗及治療性抗體的研究進展[J].軍事醫(yī)學(xué)，2013，37：550-554.

[3]田英平，石漢文，佟 飛，等.肉毒中毒診療方案[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2010，19（4）：349-350.

[4]劉燕敏.食物性肉毒中毒患者的腦電圖改變及其意義[J].全科醫(yī)生技能發(fā)展，2011，14（IC）：335-337.

[5]Zouari N，Choyakh F，Triki C，et al.Impor tance of elect romyography in the diagnosis of botulism[J].Neurophysiol Cl in，1997，27（3）：220-226.

[6]康 琳，王景林.肉毒梭菌神經(jīng)毒素檢測技術(shù)的研究進展[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32（4）：386-389.

[7]彭小兵，蔣玉文，蔣 穎，等.肉毒中毒癥實驗室診斷的研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志，2009，43（3）：53-57.

[8]陳曉香，邱澤武.肉毒中毒的診斷與治療[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2008，10（10B）：1854-1855.

[9]王興民，孟筱琦，王成懷.多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測C、D型肉毒神經(jīng)毒素基因[J].中國人獸共患病雜志，1999，15（1）：14-16．

[10]Lindst r?m M，Keto R，Markkula A，et al.Mul tiplex PCR assay for detection and identif ication of Clostridium botul inum types A，B，E，and F in food and fecal material[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（12）：5694-5699.

[11]Peruski AH，Johnson LH 3rd，Peruski LF Jr.Rapid and sensitive detection of biological war fare agents using time-resolved f luorescence assays [J].J Immunol Methods，2002，263（1-2）：35-41.

[12]Hi l l SE，Iqbal R，Cadiz CL，et al.Foodborne botul ism t reated with heptavalent botulism antitoxin[J].Ann Pharmacother，2013，47（2）：e12.

[13]Centers for Disease Control and Prevention（CDC）. Investigational heptavalent botulinum antitoxin（HBAT）to replace licensed botulinum antitoxin AB and investigational botulinum antitoxin E[J]. MMWR Morb Mor tal Wkly Rep，2010，59（10）：299.

[14]Forss N，Ramstad R，B?cklund T，et al.Di f ficulties in diagnosing food-borne botul ism[J]. Case Rep Neurol，2012，4（2）：113-115.

[15]Simpson L.The li fe history of a botul inum toxin molecule[J].Toxicon，2013，68：40-59.

[16]Chow SK，Casadeval l A.Monoclonal antibodies and toxins--a perspective on function and isotype [J].Toxins（Basel），2012，4（6）：430-454.

[17]Diamant E，Lachmi BE，Keren A，et al.Evaluating the synergistic neut ralizing ef fect of anti-botul inum oligoclonal antibody preparations[J].PLoS One，2014，9（1）：e87089.

[18]Frankovich TL，Arnon SS.Cl inical t rial of botul ism immune globul in for infant botul ism[J]. West J Med，1991，154（1）：103.

[19]宮 玉，田英平.肉毒中毒研究現(xiàn)狀[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2011，29（11）：869-872.

[20]May ML，Corkeron MA，St ret ton M.Infant botul ism in Aust ralia：avai labi l ity of human botul inum antitoxin for treatment[J].Med J Aust，2010，193（10）：614-615.

[21]Centers for Disease Control and Prevention（CDC）. Notice of CDC's discontinuation of investigational pentavalent（ABCDE）botul inum toxoid vaccine for workers at risk for occupational exposure to botul inum toxins[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2011，60（42）：1454-1455.

[22]Rusnak JM，Smith LA.Botul inum neurotoxin vaccines：Past history and recent developments[J]. Hum Vaccin，2009，5（12）：794-805.

[23]Har t MK，Saviolakis GA，Welkos SL，et al.Advanced Development of the rF1V and rBV A/B Vaccines：Progress and Chal lenges[J].Adv Prev Med，2012，2012：731604.

[24]Webb RP，Smith LA.What next for botul ism vaccine development?[J].Exper t Rev Vaccines，2013，12（5）：481-492.

（收稿：2015-03-09修回：2015-05-08編校：齊 彤）

R 595.71

A

2095-3496（2015）03-0188-03

100071北京，解放軍第307醫(yī)院中毒救治科（趙駿秀，王漢斌）

王漢斌，E-mai l：hanbin62616@al iyun.com