陳大理 車國(guó)衛(wèi)

1889年，Stephen Paget提出腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子和土壤”學(xué)說(shuō)[1]。至今，作為“種子（seeds）”的腫瘤細(xì)胞在腫瘤演進(jìn)中的關(guān)鍵作用已得到深入的探討。而腫瘤微環(huán)境（土壤）作為另一重要組分在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后中的作用，只是在最近才被逐漸重視。腫瘤微環(huán)境主要包含細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular cell matrix,ECM）和各種細(xì)胞（如炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞等）。作為腫瘤微環(huán)境中主要的細(xì)胞種類，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）通過與腫瘤細(xì)胞的“cross-talk”影響腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后[2]。Martinez-Outschoorn等[3]提出“腫瘤代謝的間質(zhì)自噬模型（autophagic tumor stroma model of cancer metabolism）”，發(fā)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)（主要是CAFs）在不依賴血管增生的情況下，通過自噬為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移提供“燃料（battery）”。CAFs分泌的多種細(xì)胞因子與腫瘤預(yù)后相關(guān)，包括各種生長(zhǎng)因子（growth factors）[4]、促炎性因子（proinflammatory factors）[5]、基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteases）[6]等。然而，若要更加深入探索CAFs在腫瘤中的作用，我們必須著眼于CAFs的表型形成機(jī)制。本文將從以下三方面進(jìn)行系統(tǒng)的論述：CAFs表型一致性與起源多樣性；CAFs表型轉(zhuǎn)換的遺傳學(xué)基礎(chǔ)（genetic alterations）；CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)改變（epigenetic modifications）。

1 CAFs表型一致性與起源多樣性

作為一種特殊的腫瘤相關(guān)細(xì)胞，CAFs在病理學(xué)特征上與活化的成纖維細(xì)胞（activated fibroblasts）相似。研究發(fā)現(xiàn)，在不同組織來(lái)源的腫瘤中，CAFs擁有許多相同或相似的表型特征。因此，Shalom等[7]最近提出一個(gè)新定義——“CAFs狀態(tài)（CAFs state）”，認(rèn)為“CAFs”應(yīng)該是腫瘤間質(zhì)中一群保持動(dòng)態(tài)活性的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的成纖維樣細(xì)胞。

在內(nèi)在特征方面，CAFs與正常成纖維細(xì)胞有顯著差異。在細(xì)胞形態(tài)上，擁有更大紡錘形細(xì)胞形態(tài)；在細(xì)胞標(biāo)志物上，擁有一些與肌成纖維細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞相同的標(biāo)志物，如α-SMA。此外，CAFs的增殖、分裂能力較正常成纖維細(xì)胞顯著增強(qiáng)，且能分泌多種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)。然而，與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的外在特征被認(rèn)為是鑒別CAFs的更為重要的因素。首先，CAFs分泌多種因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)，包括血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（plateletderived growth factor,PDGFR）[8]、白介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）[9]等。其次，CAFs通過分泌賴氨酸氧化酶（Lysyl oxidase,LOX），對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行重構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲[10]。此外，Mani等[11]發(fā)現(xiàn)，CAFs可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲。研究[12]還發(fā)現(xiàn)CAFs與腫瘤耐藥性相關(guān)。

雖然不同腫瘤的CAFs間有表型共性，但是研究發(fā)現(xiàn)CAFs卻有不同的細(xì)胞起源，主要包括上皮細(xì)胞（epithelial cells）、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells）、間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）和局部的間質(zhì)細(xì)胞（local mesenchymal cells）。EMT使得上皮細(xì)胞成為CAFs的一種可能的起源。研究[13]發(fā)現(xiàn)，老鼠皮膚鱗癌細(xì)胞可通過激活Ras/TGF-β信號(hào)途徑而獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型特征。內(nèi)皮細(xì)胞可經(jīng)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial to mesenchymal transition,EndMT）過程而獲得間質(zhì)表型，進(jìn)而形成CAFs相關(guān)表型。Zeisberg等[14]即發(fā)現(xiàn)，在B16F10黑色素瘤模型和Rip-Tag2自發(fā)性胰腺癌模型中均能頻繁發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。間質(zhì)干細(xì)胞是一種被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞，亦被認(rèn)為可能是CAFs的一個(gè)起源。Worthley等[15]在曾接受骨髓移植患者的胃癌中，發(fā)現(xiàn)絕大部分CAFs起源于移植的骨髓細(xì)胞。此外，來(lái)自腫瘤周圍的局部間質(zhì)細(xì)胞也可能是CAFs重要起源。

CAFs起源的多種可能，向我們揭示了不同起源之間在表型轉(zhuǎn)換過程中存在著某些重要且共通的機(jī)制，而且這些機(jī)制可能與其周圍的腫瘤細(xì)胞存在著密切的關(guān)系，以至于不同腫瘤中CAFs擁有許多共通的表型特性。當(dāng)然，這過程中我們也需要重視他們之間的個(gè)性差異。目前的研究主要集中在CAFs基因改變和表觀遺傳學(xué)改變等兩方面。

2 CAFs表型轉(zhuǎn)換的遺傳學(xué)基礎(chǔ)

眾所周知，由一個(gè)受精卵分裂增殖而形成的生物有機(jī)體的不同細(xì)胞間共享一套遺傳信息（DNA），然而又表現(xiàn)出不同的表型特征和生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，決定一個(gè)細(xì)胞表型特征變化的因素除了DNA的改變之外，表觀遺傳學(xué)的改變亦在其中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。學(xué)界也試圖從此兩方面對(duì)CAFs表型轉(zhuǎn)換機(jī)制進(jìn)行探討。

研究首先是從基因?qū)用孢M(jìn)行，學(xué)者們對(duì)CAFs可能發(fā)生基因序列改變的情況進(jìn)行了相關(guān)研究。Kurose等[16]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的CAFs中存在PTEN和TP53體細(xì)胞突變（somatic mutation）。更多的研究[17-20]卻提示CAFs存在雜合性丟失（loss of heterozygosity,LOH）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability,MSI）和等位基因失衡（allelic imbalance,AI）等。Fukino等[18]對(duì)134例散發(fā)浸潤(rùn)性乳腺癌的上皮和間質(zhì)成分進(jìn)行全基因組LOH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)至少有57個(gè)LOH位點(diǎn)在上皮（n=19）和間質(zhì)（n=38）中均存在，腫瘤間質(zhì)LOH的多樣性可能與宿主間質(zhì)對(duì)侵襲性腺癌細(xì)胞的反應(yīng)的個(gè)體差異有關(guān)，Matsumoto等[19]對(duì)40例散發(fā)性結(jié)直腸癌的上皮和間質(zhì)成分進(jìn)行MSI研究，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)和上皮的MSI陽(yáng)性率分別為41%和34%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)MSI與上皮P53蛋白高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P=0.024,75）。此外，Tanwar等[20]發(fā)現(xiàn)，通過定向敲除小鼠子宮間質(zhì)細(xì)胞的結(jié)腸腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli,APC）后，小鼠子宮內(nèi)膜腺體出現(xiàn)異型增生，進(jìn)而發(fā)展出子宮內(nèi)膜原位腺癌及侵襲性腺癌。他們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)α-SMA，具有肌成纖維細(xì)胞樣的表型特征。進(jìn)而，研究者們提出了一個(gè)大膽的假說(shuō)，認(rèn)為CAFs和腫瘤細(xì)胞可能相互依存、共同演進(jìn)[21]。然而，另一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤間質(zhì)中的CAFs并不存在遺傳信息改變。例如，Karakas等[22]分別對(duì)81例原發(fā)侵襲性乳腺癌和25例乳腺癌CAFs標(biāo)本的PIK3CA基因的3個(gè)熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在CAFs中沒有體細(xì)胞突變。同樣的，Corver等[23]通過單核苷酸多態(tài)性芯片技術(shù)對(duì)57例宮頸癌CAFs的LOH、DNA異倍體等進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其DNA為二倍體，沒有體細(xì)胞突變的任何證據(jù)。這種基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同而產(chǎn)生的矛盾，將我們的目光拉回到那個(gè)假說(shuō)在理論層面更為深刻的矛盾上去。即，為何CAFs會(huì)屈尊以支持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而自身卻不進(jìn)展為肉瘤細(xì)胞；或是共同演進(jìn)而出現(xiàn)一個(gè)實(shí)體腫瘤中存在兩種腫瘤細(xì)胞（癌和肉瘤）？雖然癌肉瘤偶有病案報(bào)告，但是并不足以支持該假說(shuō)。近年來(lái)，研究者們將目光轉(zhuǎn)向另一方面——CAFs的表觀遺傳學(xué)改變。

雖然表觀遺傳現(xiàn)象早在1940年代即被發(fā)現(xiàn)，但是直到近期才被逐漸闡明。目前認(rèn)為，表觀遺傳學(xué)是研究可遺傳的、沒有基因序列改變的基因功能的改變（或是細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換）機(jī)制的學(xué)科[24]。當(dāng)DNA的奧秘被逐一解開之后，我們?cè)欢日J(rèn)為細(xì)胞若要改變其表型特征，相對(duì)應(yīng)的DNA序列必定要發(fā)生改變。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)的改變也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的父系表型發(fā)生變化，并可通過有絲分裂或減數(shù)分裂遺傳給子代細(xì)胞[25]。表觀遺傳學(xué)機(jī)制存在于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后mRNA修飾、翻譯等水平，通過對(duì)基因表達(dá)的不同水平進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響細(xì)胞表型。根據(jù)不同的基因表達(dá)水平，表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要包括DNA甲基化、基因印記、組蛋白修飾、RNA干擾等。研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤、自身免疫性疾病、遺傳性疾病等中發(fā)揮重要作用。

雖然腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究已很深入，但是目前對(duì)CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究仍偏少。表觀遺傳學(xué)的關(guān)鍵是不改變DNA核苷酸序列和可遺傳性[26]?；谶@種特性，表觀遺傳學(xué)為我們提供了一種觀點(diǎn)，使我們能夠初步理解CAFs的起源與表型特征之間的矛盾。因此，我們將總結(jié)目前關(guān)于CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展，為以后的研究提供參考。

3 CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)改變

我們將從DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修飾（histone modification）和microRNA干擾（miRNA interference）三方面對(duì)CAFs表型轉(zhuǎn)換與表觀遺傳學(xué)改變的研究進(jìn)展進(jìn)行全面論述。

3.1 DNA甲基化 DNA甲基化盡管在不同區(qū)域都可發(fā)生（如CpNpG甲基化），但是絕大部分都出現(xiàn)在5’-C端CpG島的胞嘧啶（cytosine,C）。對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生促進(jìn)或抑制的兩種效應(yīng)，多數(shù)情況下DNA甲基化抑制靶基因的表達(dá)。其機(jī)制主要為通過募集甲基化CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG-binding domain proteins）或直接抑制DNA結(jié)合蛋白（DNA binding proteins）的募集而抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程[27]。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞通過旁分泌IL-6對(duì)周邊的CAFs進(jìn)行表觀遺傳學(xué)調(diào)控，使TGFBR2基因表達(dá)下調(diào)。在前列腺癌中，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CAFs的GSTP1和TGFBR2基因的DNA甲基化將導(dǎo)致其DNA損傷和細(xì)胞的脆弱性增加[28]。眾所周知，CAFs的DNA損傷和細(xì)胞脆性將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，腫瘤細(xì)胞可通過表觀遺傳學(xué)途徑增加CAFs的DNA損傷和細(xì)胞脆性并促進(jìn)自身的生長(zhǎng)。盡管具體機(jī)制尚不清楚，有證據(jù)顯示其可能與TGF-β信號(hào)途徑受抑制以及DNA甲基化酶1（DNMT1）的穩(wěn)定性相關(guān)，但是在這方面仍需要更多深入的研究。

此外，宮頸癌CAFs的OPCML基因和前列腺癌CAFs的HIC1、N33和RARB2等抑癌基因也存在DNA甲基化。Fiegl等[29]用激光捕獲的顯微切割方法對(duì)143例乳腺癌間質(zhì)進(jìn)行DNA甲基化狀態(tài)研究，發(fā)現(xiàn)HER-2/neu陽(yáng)性患者的5個(gè)基因（包括MYOD1、HSD17B4、CDH13、PGR和BRCA1）的DNA甲基化顯著高于（P=0.011）HER-2/neu陰性患者。其中，MYOD1和CDH13與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)，而PGR基因甲基化則導(dǎo)致雌激素受體丟失。在對(duì)食管癌的腫瘤細(xì)胞和CAFs的COX-2基因（PTGS2）DNA甲基化進(jìn)行對(duì)比研究后，Dawsey等[30]發(fā)現(xiàn)存在DNA甲基化的CAFs均靠近同樣存在COX-2基因DNA甲基化的腫瘤細(xì)胞。他們猜測(cè)，腫瘤細(xì)胞可能通過相互作用影響周圍的間質(zhì)細(xì)胞，使之亦出現(xiàn)DNA甲基化并誘導(dǎo)CAFs表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。盡管在多種類型腫瘤CAFs中均發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的存在，但是仍缺乏有力的證據(jù)來(lái)對(duì)其與CAFs表型變化和腫瘤發(fā)生、進(jìn)展之間關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)說(shuō)明。

3.2 MicroRNA干擾 MicroRNA是一條由RNA聚合酶II（RNA polymerase II）轉(zhuǎn)錄并最終在胞質(zhì)成熟的約有22個(gè)核苷酸的RNA。它可以通過特異性結(jié)合mRNA而干擾其翻譯過程，進(jìn)而誘導(dǎo)基因表達(dá)沉默。根據(jù)miRNA與mRNA之間結(jié)合的緊密程度不同，其干擾機(jī)制也有所差異。當(dāng)miRNA與mRNA完全緊密結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性下降并最終被降解；反之，則僅是翻譯過程被抑制。在CAFs中，多種miRNAs與CAFs表型轉(zhuǎn)換相關(guān)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。

Mitra等[31]發(fā)現(xiàn)，相較于正常成纖維細(xì)胞，在卵巢癌CAFs中miRNA-31和miRNA-214表達(dá)下調(diào)，而miRNA-155則表達(dá)上升。通過在正常成纖維細(xì)胞中，用轉(zhuǎn)染miRNA和miRNA抑制等方法模擬CAFs中miRNAs表達(dá)失調(diào)過程時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)正常成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出許多與CAFs相同的表型特征，包括自身克隆形成率的上調(diào)、促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲、以及多種基因的表達(dá)上調(diào)（主要是細(xì)胞因子相關(guān)的基因）。更重要的是，在CAFs中逆向模擬miRNAs表達(dá)譜時(shí)，CAFs的表型特征向著正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。該研究提示，miRNA在CAFs表型形成過程中可能發(fā)揮著重要作用，并且，與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，正常成纖維細(xì)胞內(nèi)的miRNAs表達(dá)升高。研究[32]也發(fā)現(xiàn)miRNA-21能通過TGF-β1介導(dǎo)影響CAFs的表型轉(zhuǎn)換。在腫瘤代謝方面，Pavlides等[33]發(fā)現(xiàn)，miRNA-34c/-31參與CAFs的“反沃伯格效應(yīng)（Reverse Warburg Effect）”，使CAFs向腫瘤細(xì)胞提供增殖所必須的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究CAFs與腫瘤相關(guān)炎癥時(shí)，Olga等[34]發(fā)現(xiàn)，CAFs中miRNA-146a表達(dá)上調(diào)能夠通過激活NF-κB信號(hào)途徑進(jìn)而促進(jìn)腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)。此外，CAFs中的許多miRNAs表達(dá)異常均能促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，包括miRNA-148a[35]、miRNA-214/-221/-222[36]、miRNA-21[37]、miRNA-15/-16[38]、miRNA-320[39]等。盡管研究發(fā)現(xiàn)CAFs中多種miRNAs表達(dá)改變與表型轉(zhuǎn)換、促腫瘤生長(zhǎng)侵襲等相關(guān)，但是這些miRNAs的表達(dá)改變是否與腫瘤細(xì)胞相關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)CAFs中miRNAs的表達(dá)等，仍需進(jìn)一步的探索。

3.3 組蛋白修飾 組蛋白修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制、染色體濃縮等過程中發(fā)揮著重要作用。研究[40]發(fā)現(xiàn)，組蛋白的修飾主要發(fā)生在N-末端，主要有乙酰化（acetylation）、甲基化（methylation）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等形式。并且，Lachner等[41]發(fā)現(xiàn)不同組氨酸部位的賴氨酸甲基化作用亦各不相同。Tyan等[42]發(fā)現(xiàn)，在CAFs中EZH2（enhancer of zeste homologue 2）的丟失將導(dǎo)致組蛋白H3K27去甲基化（demethylation），進(jìn)而使ADAMTS1表達(dá)上調(diào)。CAFs中ADAMTS1表達(dá)上調(diào)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)。此外，Zheng等[43]發(fā)現(xiàn)，EZH2促進(jìn)組蛋白H3K27甲基化，進(jìn)而通過啟動(dòng)子的DNA甲基化使p16INK4a基因表達(dá)沉默。而EZH2到p16INK4a調(diào)控通路與MSCs的衰老和惡變等表型轉(zhuǎn)換相關(guān)。目前關(guān)于CAFs組蛋白修飾的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究仍較少，需要更多深入的探討以進(jìn)一步闡明組蛋白修飾在CAFs表型轉(zhuǎn)換中的作用。此外，組蛋白修飾與DNA甲基化可能存在相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)以改變CAFs表型。

4 問題與展望

在CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)研究主要集中在DNA甲基化、miRNAs和組蛋白修飾等三方面。雖然目前的研究提示CAFs表觀遺傳學(xué)改變?cè)谄浔硇娃D(zhuǎn)換及與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲等方面可能發(fā)揮著重要的作用，但是這些表觀遺傳學(xué)改變與CAFs表型轉(zhuǎn)換之間是何種關(guān)系，是否與腫瘤細(xì)胞存在必然的聯(lián)系，CAFs的表觀遺傳學(xué)改變對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲是否產(chǎn)生明確的影響等問題仍然有待更深入的研究。此外，CAFs表觀遺傳學(xué)機(jī)制多數(shù)只在一種腫瘤中發(fā)現(xiàn)或驗(yàn)證，由于不同類型的腫瘤之間既有共性也有個(gè)性，對(duì)在某一類腫瘤中可能有效的機(jī)制，因此還需要更進(jìn)一步的研究以探索相關(guān)機(jī)制的普適性。

綜上所述，CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)研究仍處于起步階段，多方面的深入研究等待我們跟進(jìn)，包括不同腫瘤之間是否存在相同或相似的表觀遺傳學(xué)機(jī)制（DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾等）；腫瘤細(xì)胞是通過何種具體的表觀遺傳學(xué)機(jī)制影響CAFs表型轉(zhuǎn)換；是否還存在其他的表觀遺傳學(xué)機(jī)制；CAFs的表觀遺傳學(xué)改變與基因序列的改變是否有關(guān)等等。通過闡明CAFs表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，有助于我們深入理解CAFs在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后中的作用。