蔣濤 周彩存

肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的疾病之一。2014年世界衛(wèi)生組織發(fā)布《World Cancer Report 2014》。該報告顯示，肺癌以每年180萬的新發(fā)病例和160萬的死亡病例，高居所有癌癥發(fā)病率和死亡率之首。報告同時指出，在我國，隨著空氣污染等問題的日趨嚴重，每年肺癌新發(fā)病例為67.6萬，死亡病例56.5萬，均居世界各國肺癌發(fā)病率和死亡率的第一位。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最為常見的組織學類型，約占總體的80%-85%[1-3]。近些年，隨著分子生物學和轉化醫(yī)學的快速發(fā)展，人們對NSCLC的認識已經(jīng)從組織水平深入到分子水平，越來越多的腫瘤驅動基因被陸續(xù)鑒定出來。而針對這些驅動基因的靶向藥物已經(jīng)取代傳統(tǒng)的化療，成為帶有這些驅動基因的晚期NSCLC的標準治療方案。在NSCLC中最具有代表性的靶向藥物是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）。相關的III期臨床試驗也證實了這些TKIs可以使帶有EGFR突變和（或）ALK融合基因的NSCLC患者得到明顯的緩解和生存獲益[4-6]。不幸的是，目前幾乎所有的TKIs在初始治療后的9個月-12個月都會出現(xiàn)耐藥問題[7,8]。耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為TKIs臨床應用最普遍也是最大的障礙，同時也是提高晚期NSCLC患者生存時間最亟待解決的問題。有關EGFR-TKIs的耐藥機制及其應對策略已經(jīng)有很多文章進行闡述[9-12]，而對于ALK TKIs治療后出現(xiàn)耐藥問題的機制和相應的治療策略還未曾有過詳細的綜述。因此，本文針對一代ALK TKI（克唑替尼）治療ALK融合基因陽性的NSCLC患者（ALK+ NSCLC）后，引起耐藥問題的機制和有關后續(xù)治療策略做一綜述。

1 克唑替尼治療后的耐藥機制

克唑替尼是一種口服型小分子ATP競爭性的ALK抑制劑，它可以抑制c-Met激酶，破壞c-Met的信號轉導通路，進而抑制ALK融合基因，達到抑制腫瘤細胞生長的效果[13,14]。ALK融合基因發(fā)生于3%-7%的NSCLC患者[15,16]，臨床上常見于不吸煙的年輕腺癌患者，通常與EGFR或KRAS突變的發(fā)生互相排斥[17]?？诉蛱婺岬某霈F(xiàn)顯著改善了該類亞型NSCLC患者的預后，其治療客觀緩解率（objective response rate,ORR）達60%，無進展生存期（progression free survival,PFS）達8個月-10個月，總生存期（overall survival,OS）顯著延長[18-20]。盡管ALK+ NSCLC患者的獲益明顯，但這部分患者往往在1年-2年內出現(xiàn)對克唑替尼耐藥，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復發(fā)進展較為常見[21]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐藥機制主要有以下幾種。

1.1 ALK繼發(fā)性耐藥突變 ALK+ NSCLC患者出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥問題，約37%歸因于ALK繼發(fā)性耐藥突變。這其中又可以分為ALK激酶區(qū)突變（28%）和ALK基因拷貝數(shù)擴增（9%）。ALK激酶區(qū)突變是最早明確的耐藥機制[22,23]。體外和基于患者標本的研究揭示ALK+ NSCLC繼發(fā)耐藥的患者存在數(shù)種ALK激酶區(qū)突變，包括：L1196M、L1152R、G1202R、G1269A、1151Tins、S1206Y、C1156Y、F1174C和D1203N。數(shù)量上微占優(yōu)勢的是L1196M，它是一種類似于T790M的看家基因[24,25]。在首例公開報道的克唑替尼耐藥的病例的同一個腫瘤標本中即發(fā)現(xiàn)了L1196M和C1156Y的突變。Doebele等[22]對14例經(jīng)克唑替尼治療后出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥的ALK+ NSCLC患者的標本進行熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）檢測，結果發(fā)現(xiàn)三分之一的患者出現(xiàn)了ALK激酶區(qū)的二次突變，主要為L1196M、G1269A和C1156Y。與之相似，Katayama等[23]對18例克唑替尼獲得性耐藥的ALK+ NSCLC患者進行了FISH和免疫組織化學法（immunohistochemistry,IHC）檢測，發(fā)現(xiàn)約四分之一的患者出現(xiàn)了ALK激酶區(qū)的二次突變，并且在體外實驗中證實了這些突變導致了ALK+腫瘤細胞對克唑替尼的耐藥。ALK融合基因拷貝數(shù)擴增首次是在ALK+細胞系出現(xiàn)對克唑替尼耐藥時發(fā)現(xiàn)的，隨后在對克唑替尼耐藥的ALK+ NSCLC患者標本中也發(fā)現(xiàn)了拷貝數(shù)增加。在Katayama等[23]的試驗中，F(xiàn)ISH檢測18例繼發(fā)性耐藥的患者的標本也發(fā)現(xiàn)了1例患者ALK融合基因拷貝數(shù)擴增。同樣，相應的體外實驗也證實了ALK融合基因拷貝數(shù)擴增可以導致ALK+腫瘤細胞對克唑替尼的耐藥。值得一提的是，當ALK融合基因激酶區(qū)突變或拷貝數(shù)擴增時，ALK信號通路往往會被保留，并在腫瘤的生存和耐藥過程中發(fā)揮一定的作用。因此，更加有效的第二代ALK抑制劑也許能夠克服這些機制引起的繼發(fā)性耐藥問題。該類型的耐藥也被稱為ALK占優(yōu)勢的耐藥。

1.2 驅動基因轉換 ALK+腫瘤細胞主要通過ALK及其下游信號通路來控制腫瘤細胞的生長和遷移。當使用克唑替尼阻斷該信號通路時，腫瘤細胞會通過另外一些機制（如轉換驅動基因）來激活其他信號通路，取代腫瘤細胞對ALK及其下游信號的依賴，導致克唑替尼不能有效地抑制腫瘤細胞的生長。該類型的耐藥又被稱為ALK不占優(yōu)勢的耐藥。這些轉換驅動基因中最為常見的是EGFR突變或磷酸化、KRAS突變和c-KIT擴增。Doebele等[22]和Katayama等[23]的研究均發(fā)現(xiàn)，在未接受和已經(jīng)接受克唑替尼治療的ALK+NSCLC患者的標本中均發(fā)現(xiàn)激活的EGFR或KせS的突變。Katayama等[23]對18例克唑替尼耐藥的標本進行IHC檢測，發(fā)現(xiàn)有17例標本出現(xiàn)EGFR磷酸化，提示存在不同程度的EGFR通路激活。在細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR磷酸化可以恢復耐藥細胞株對克唑替尼的敏感性。另外，上述研究中，18例標本經(jīng)FISH檢測發(fā)現(xiàn)了2例高水平的c-KIT擴增，IHC檢測也證實了這一結果。同時通過IHC檢測還發(fā)現(xiàn)在這些c-KIT擴增的耐藥標本的間質細胞中，c-KIT的配體干細胞因子（stem cell factor,SCF）也存在高表達現(xiàn)象。體外實驗證實了c-KIT擴增介導的克唑替尼耐藥現(xiàn)象需要高表達的SCF的參與，而克唑替尼聯(lián)合伊馬替尼則可以有效抑制這種機制導致的耐藥現(xiàn)象。

1.3 腫瘤異質性 NSCLC是基因和細胞異質性最大的腫瘤之一。盡管最近幾十年分子生物學技術的發(fā)展，讓我們對NSCLC的認識從組織病理的水平深入到分子和遺傳甚至單細胞水平，但是，對于腫瘤異質性及其導致有關的耐藥問題，我們仍然缺乏更深入的了解[8]。事實上，我們已經(jīng)在多種耐藥腫瘤中觀察到腫瘤異質性的存在。比如，對同一個ALK+ NSCLC患者的耐藥腫瘤標本進行檢測，分別鑒定出了兩種不同的激酶區(qū)突變，而一些被鑒定的腫瘤細胞不存在這些突變。另一個患者的耐藥標本則同時檢測出了基因拷貝數(shù)擴增和突變[26,27]。但是目前并不知道這些變異是否都存在于相同的細胞內。2014年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology,ASCO）會議上報道了一個關于多發(fā)肺結節(jié)的NSCLC患者驅動基因的分布情況。研究納入35例雙肺多發(fā)肺結節(jié)的NSCLC患者，分別檢測其驅動基因分布情況，結果發(fā)現(xiàn)不同結節(jié)的突變驅動基因的不一致率達到68.6%。這些結果都表明：對于NSCLC患者而言，在不同時間和不同空間其腫瘤細胞可能存在不同的驅動基因突變。那么，一塊很小的活檢組織的分子檢測結果能否代表整個腫瘤組織？有限的檢測能否顯示所有的細胞耐藥的類型？腫瘤細胞異質性的存在讓耐藥問題更加錯綜復雜，要徹底解決耐藥問題，首先需要更多地了解腫瘤異質性的起源等問題。

2 克唑替尼耐藥后的治療策略

2.1 二代ALK抑制劑 第二代ALK抑制劑的結構和克唑替尼有很大的不同，因而能夠抑制ALK繼發(fā)性耐藥突變。臨床前研究也已經(jīng)證實，第二代ALK抑制劑不僅對存在ALK融合基因陽性的腫瘤細胞具有活性，而且對已經(jīng)鑒定出來的多種ALK激酶區(qū)耐藥突變均具有活性。這些藥物包括：alectinib（CH5424802）、ceritinib（LDK-378）和AP26113。

2.1.1 Alectinib Alectinib是一種強效的選擇性ALK抑制劑，其效力比克唑替尼強10倍，能有效對抗大多數(shù)的ALK激酶區(qū)突變[28]。在日本進行的一項多中心、單臂開放的I期/II期研究對未接受克唑替尼治療的晚期NSCLC患者進行的劑量遞增試驗，試驗中患者每日口服alectinib兩次[29,30]。I期試驗納入的24例患者每日口服20 mg-300 mg的alectinib兩次。在最高最大劑量耐受組未觀察到劑量限制性毒性，也未見4級不良事件的報告。因此II期臨床研究選取了每次300 mg、每日兩次的用藥方案。共計46例患者以推薦劑量進行了治療，其中43例患者獲得客觀緩解，客觀緩解率（objective response rate,ORR）達93.5%（95%CI: 82%-98.6%），其中2例（4.3%）為完全緩解。12例（26%）患者出現(xiàn)了治療相關的3級不良反應，包括中性粒細胞減少和血液肌酸激酶含量升高。5例患者出現(xiàn)了嚴重的副作用（11%）。中位PFS尚未達到?；谶@一結果，日本衛(wèi)生部、勞動和福利局批準了該藥的使用。同樣在美國，食品與藥物管理局（Food and Drug Administration,FDA）已經(jīng)批準alectinib用于克唑替尼治療后發(fā)生進展的ALK+ NSCLC患者的治療，并授予該藥突破性治療的稱號。

2.1.2 Ceritinib Ceritinib是瑞士諾華公司研發(fā)的二代ALK抑制劑。其體外研究[31]表明：ceitinib對ALK+并表達突變C1156Y的腫瘤細胞均具有良好的活性。Ceritinib的劑量遞增I期單臂試驗計劃入組131例ALK+的經(jīng)過標準治療失敗的進展期腫瘤患者[32]。試驗分為3個組；之前接受過克唑替尼治療的ALK+ NSCLC，之前未接受過克唑替尼治療的ALK+ NSCLC和ALK+的除肺癌之外的其他惡性腫瘤。截止2012年11月8日，共入組130例患者，其中59例為劑量爬坡組，確認最大耐受劑量（maximum tolerated dose,MTD）為750 mg/d；后續(xù)71例患者為MTD擴展組。在79例對克唑替尼耐藥的ALK+ NSCLC亞組中，ORR為57%。剩余35例未經(jīng)克唑替尼治療的ALK+ NSCLC組中，ORR為60%。在114例NSCLC患者中，中位PFS為8.6個月（95%CI: 5.7-9.9）。最常見的不良反應為惡心（73%）、腹瀉（72%）、嘔吐（58%）和疲勞（41%）。最常見的3級-4級不良事件為丙氨酸氨基轉移酶升高（19%），天冬氨酸氨基轉移酶升高（10%）和腹瀉（8%）。該項研究結果表明LDK378在400 mg/d-750 mg/d劑量范圍內顯示出較強的抗腫瘤活性（無論其是否接受過克唑替尼治療）。最常見的不良反應為惡心、腹瀉、嘔吐和乏力，且多為1級或2級，患者耐受性較好。目前ceritinib已經(jīng)被FDA批準用于進行多項其他II期和III期的臨床研究。

2.1.3 AP26113 AP26113是一種新型的ALK-/EGFR-TKI雙重抑制劑，可強效抑制ALKL1196M突變和EGFRT790M突變[33,34]。一項開放標簽、多中心I期/II期臨床試驗共納入44例晚期實體瘤病例，37例是耐受現(xiàn)有治療藥物或沒有標準治療的NSCLC?；颊呙咳湛诜?次的AP26113。與治療相關的3級-4級最常見不良事件為腹瀉（5%）。兩種劑量限制性毒性出現(xiàn)在240 mg劑量組（丙氨酸轉氨酶升高3級事件）和300 mg劑量組（呼吸困難4級事件）。II期臨床試驗以＜300 mg的劑量進一步研究，設4個受試群體：ALK+ NSCLC初治組、ALK靶向治療后耐藥組、耐藥EGFR突變型組、其他ALK變異或其他以AP26113為靶點的腫瘤。

綜上所述，第二代ALK抑制劑對于仍依賴于ALK信號通路的ALK激酶區(qū)耐藥突變也許是最佳的選擇。

2.2 聯(lián)合其他治療 上文提到，不占優(yōu)勢的ALK耐藥突變存在其他信號旁路激活的現(xiàn)象。因此，應用ALK抑制劑和其他信號傳導通路抑制劑，有可能改善此類機制導致耐藥問題的臨床療效。

2.2.1 聯(lián)合熱休克蛋白（heat shock protein 90,HSP90）抑制劑HSP90是一類稱為“分子伴侶”的蛋白質，可幫助新合成的蛋白質形成發(fā)揮他們特定生物學功能的正確形狀[35]。體外細胞系研究中發(fā)現(xiàn)HSP90的抑制劑ganetespib對ALK+的未經(jīng)過克唑替尼處理或對克唑替尼耐藥的細胞系均有活性[21,36]。一項關于ganetespib的II期臨床試驗中[37]，ganetespib單藥治療ALK基因重排的IIIb期/IV期NSCLC，患者之前未接受過直接ALK抑制劑治療。主要終點是ORR，計劃招募受試者約100例。目前試驗正在進行中，已經(jīng)報道的結果顯示4例獲部分緩解的病例均為未經(jīng)克唑替尼治療的ALK陽性型。最常見不良反應為腹瀉、乏力、惡心和食欲減退。另一種HSP90抑制劑是AUY922[38]，目前正在進行用于包括ALK+NSCLC在內的II期試驗。劑量為每周70 mg/m2，121例受試者均為復治NSCLC患者。22例ALK+病例中，客觀緩解7例（32%），其中3例是克唑替尼耐藥者；疾病控制率為59%（未經(jīng)克唑替治療組為100%，克唑替尼耐藥組為36%）。不良事件主要是1級-2級事件，包括眼睛不適（77%）、腹瀉（74%）和惡心（46%）。其他聯(lián)合HSP90抑制劑與選擇性ALK抑制劑的臨床研究正在進行中（NCT 01712217和NCT01579994）。

2.2.2 聯(lián)合其它TKI 既往的研究[39,40]表明，在ALK+NSCLC患者中，5%-8%的ALK+細胞并存EGFR突變。在基于亞裔患者的研究[27]中發(fā)現(xiàn)，18.6% ALK+患者合并EGFR突變；3.9%的EGFR突變患者合并ALK融合。對于這些患者，聯(lián)合使用EGFR和ALK TKI相對于單獨使用任何一種TKI可以起到更好的抑制效果。但是目前該結論多見于病例報道研究，尚缺乏相關的大型臨床數(shù)據(jù)的支持。

2.2.3 聯(lián)合化療EGFR突變陽性NSCLC患者對EGFR-TKI耐藥后，立即停止EGFR-TKI治療可導致腫瘤出現(xiàn)“閃耀”現(xiàn)象（即暴發(fā)性進展），可能的原因是停止EGFR-TKI治療后，對EGFR-TKI敏感的細胞再次快速增殖，導致腫瘤暴發(fā)性生長。同理，對克唑替尼敏感的ALK+ NSCLC亦可出現(xiàn)相似的過程。因此，當該類患者出現(xiàn)對克唑替尼獲得性耐藥時，在全身化療同時是否需要繼續(xù)克唑替尼治療，尚無確切答案，通過一些前瞻性臨床研究有助于回答這一問題。正在設計的SWOG1300研究即是針對ALK+ NSCLC患者出現(xiàn)克唑替尼耐藥后隨機分配至培美曲塞單藥或培美曲塞聯(lián)合克唑替尼治療組。值得關注的是，在這項研究中，如果單藥培美曲塞治療失敗后，將允許患者再次接受克唑替尼治療?；诖搜芯?，亦能回答“在具有明確腫瘤驅動基因的患者出現(xiàn)獲得性耐藥后，兩種不同的治療模式孰優(yōu)孰劣（繼續(xù)原小分子靶向藥物聯(lián)合全身化療vs先全身化療，待疾病再次進展后重新使用小分子靶向藥物）”這一問題。研究結果將對臨床實踐具有重要的指導意義。

2.3 繼續(xù)克唑替尼治療 對于靶向藥物治療出現(xiàn)獲得性耐藥的NSCLC患者，一個很重要的觀點是認為這種耐藥往往不完全，因此當疾病進展時，仍有部分腫瘤細胞能夠繼續(xù)被靶向藥物所抑制。一項關于繼續(xù)使用克唑替尼抑制ALK+ NSCLC疾病進展的研究[41]發(fā)現(xiàn)，克唑替尼治療ALK+NSCLC患者疾病進展后，繼續(xù)使用克唑替尼對比未使用克唑替尼，6個月總生存率為76.3%vs31.2%，1年總生存率為64.7%vs32.9%，OS為16.4個月vs3.9個月。對其總生存的Cox生存分析發(fā)現(xiàn)，克唑替尼持續(xù)使用可以使生存獲益（風險比：0.27，95%CI: 0.17-0.45，P＜0.000,1）。而患者的性別、吸煙史、體力狀態(tài)評分等對生存均無影響。對于具有驅動基因突變的NSCLC患者，在更改治療方式之前，區(qū)分出僅可檢測的疾病進展與臨床進展非常重要。這是由于某些患者雖然出現(xiàn)了局部的、無癥狀性進展，但與接受靶向治療之前相比，腫瘤負荷仍能有較好的控制。還有些患者發(fā)現(xiàn)疾病進展后停用TKI，出現(xiàn)了疾病暴發(fā)性進展。這時給予患者同一種TKI或作用于同一靶點的不同種TKI，疾病可再次獲得良好控制。該現(xiàn)象說明TKI仍能抑制對其敏感的腫瘤細胞亞群。因此，區(qū)分不同的耐藥模式對后續(xù)治療至關重要。

3 結論

克唑替尼是繼EGFR-TKI類藥物用于治療EGFR突變的NSCLC靶向藥物后又一重要的小分子靶向抑制劑，其對帶有ALK融合基因陽性的NSCLC患者顯示了良好的臨床效果。然而由于多種原因導致的耐藥問題則限制了克唑替尼的臨床應用。對于克唑替尼耐藥機制的深入探討將有助于我們改善這類患者的臨床結局。我們應該清楚，目前出現(xiàn)的二代ALK抑制劑等藥物，雖然可以克服一代ALK TKI的部分耐藥問題，但是解決耐藥問題的最佳方法還有待于我們對腫瘤異質性的深入研究。