孫燕 宋正波

肺癌是目前我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是目前肺癌發(fā)病率最高的病理亞型，約占所有肺癌患者的80%左右，其中晚期NSCLC占新發(fā)肺癌患者的60%以上。NSCLC常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、腦及胸膜腔等。晚期NSCLC一般預(yù)后不良，中位生存時間僅約10個月-12個月左右。目前不可手術(shù)NSCLC主要的治療手段為化療、放療、分子靶向治療。其中，分子靶向治療在延長NSCLC患者，特別是東亞、不吸煙的腺癌患者生存時間和提高生活質(zhì)量方面發(fā)揮了越來越重要的作用[2-4]。靶向治療的基礎(chǔ)是驅(qū)動基因的檢測，目前臨床上應(yīng)用較廣泛的驅(qū)動基因是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、ALK、ROS1等。對于驅(qū)動基因陽性的患者，使用對應(yīng)的靶向藥物可使患者的中位生存時間大大延長[5]。

腫瘤組織標(biāo)本是目前驅(qū)動基因檢測的金標(biāo)準，常見的獲取組織標(biāo)本的方式包括縱隔鏡或胸腔鏡活檢、淋巴結(jié)活檢等，但實際上多數(shù)晚期NSCLC患者往往拒絕接受創(chuàng)傷性的檢查，因此大多數(shù)晚期NSCLC患者都無法獲得足夠的腫瘤標(biāo)本用于檢測基因突變。國內(nèi)的一項多中心調(diào)查[6]表明，2009年中國患者EGFR突變檢測的比例僅有9.6%，而2012年也僅僅有20%，這提示大多數(shù)患者無法獲取足夠的標(biāo)本用于基因檢測。而對于靶向藥物耐藥后的活檢標(biāo)本比例較初診患者的標(biāo)本取材率更低。IPASS研究[2]納入的1,038例患者中只有681例能夠提供標(biāo)本，最后僅437例患者能夠評價EGFR基因突變狀態(tài)。單純的細胞學(xué)診斷僅能夠滿足診斷的需要，往往無法行進一步的檢測。如何尋找創(chuàng)傷性小、有效的替代檢測標(biāo)本是臨床中的熱點問題。

1 外周血

目前國內(nèi)外學(xué)者研究最多的是外周血檢測作為組織標(biāo)本的替代進行相關(guān)基因檢測。腫瘤患者外周血中存在因瘤細胞凋亡、壞死而釋放的游離DNA。這些游離的DNA攜帶了腫瘤組織中重要的驅(qū)動基因的信息。對于外周血作為驅(qū)動基因檢測替代品的研究主要集中于EGFR檢測方面。目前多項研究對血液中EGFR突變進行了分析。SLOG研究[7]是西班牙進行的一項對于存在EGFR突變者給予厄洛替尼治療的前瞻性、II期、多中心、單臂臨床研究。在2,105例篩選的NSCLC患者中，存在組織EGFR突變者有350例（16%）。其中217例接受厄洛替尼治療，164例有配對的血清標(biāo)本。結(jié)果顯示，血清和組織EGFR突變檢測的一致率為59.1%（97/164）。國內(nèi)王潔等[8]利用變性高效液相色譜法對230例晚期NSCLC患者的配對組織和血漿EGFR突變的檢測結(jié)果進行了分析，其中102例接受了吉非替尼治療。兩種標(biāo)本的一致性為78%，該研究是迄今有關(guān)外周血與配對組織檢測EGFR突變的最大人群的報道。2013年美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年會報道了FAST-ACT2研究通過血漿檢測EGFR突變的結(jié)果，共224例患者的血漿進行了EGFR突變檢測，檢測方法為cobas EGFR blood test試劑盒，結(jié)果顯示血漿檢測和石蠟組織EGFR突變的陽性/陰性預(yù)測值分別為93%（68/73）和86%（130/151），總一致性為88%（198/224），血漿檢測的敏感性為77%（69/90），特異性為96%（129/134）[9]。通過幾項研究不難發(fā)現(xiàn)，血清或血漿用于臨床EGFR突變檢測代替組織具有一定的預(yù)測作用。當(dāng)然，目前血液中檢測EGFR突變結(jié)果與組織中的一致性方面還存在一定的問題，部分研究存在假陰性率較高，這可能會使一部分真正“陽性”的患者失去治療的機會。目前血液作為組織標(biāo)本替代品的研究多數(shù)集中在EGFR檢測方面，在血液作為ALK、ROS1等基因檢測方面還缺少相關(guān)的報道。血液學(xué)檢測還有很多問題需要解決，如血液標(biāo)本的留取時間和質(zhì)控，檢測的方法學(xué)等都還需要進一步探索。

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）是有關(guān)外周血分子標(biāo)志物研究的另一焦點。其作為完整的、無損傷的腫瘤細胞，能反映腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥、進展等過程。一項來自Dana-Farber癌癥中心的研究應(yīng)用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對血液中CTC進行腫瘤分型，探究其是否具有較高的特異性和定量能力。結(jié)果提示CTC作為腫瘤組織替代品具有良好的敏感性和特異性，且能從服用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）藥物的患者中更早地檢測出T790M突變[10]。

2008年發(fā)表在N Engl J Med上的一篇文章[11]報道了12例晚期NSCLC的患者的外周血CTC和血漿標(biāo)本，結(jié)果二者EGFR突變檢出率分別為92%和33%，這提示我們CTC可能是更好的組織替代品。

耐藥是靶向治療不可回避的問題，也是臨床診療的難點和熱點問題。目前臨床中常用的EGFR-TKIs藥物及ALK抑制劑的中位有效時間約為10個月左右，絕大多數(shù)患者會出現(xiàn)耐藥。目前耐藥后的治療還缺乏相關(guān)的標(biāo)準，對于EGFR突變的患者耐藥的原因包括T790M突變，CMET擴增、小細胞轉(zhuǎn)化等[12]。部分耐藥靶點的抑制劑已經(jīng)開始進入臨床研究階段，如2014年ASCO報道的T790M抑制劑AZD9291對于靶向藥物耐藥后的患者可使患者的中位無進展生存期達到12個月以上。通過血漿檢測T790M的情況可預(yù)測靶向藥物的療效，但血液中采用常規(guī)的PCR檢測技術(shù)同樣存在檢測敏感性低的問題。數(shù)字PCR檢測被證實敏感性高于普通PCR檢測，值得進一步探索和臨床應(yīng)用。

2 胸腔積液

晚期NSCLC首診患者約10%-15%存在惡性胸腔積液，復(fù)治患者中惡性胸腔積液的比例更高，可達到50%以上[13]。多項小樣本回顧性研究均表明胸腔積液作為標(biāo)本替代品有明顯的優(yōu)勢：①胸腔積液多為治療需要時獲取，即僅在患者出現(xiàn)臨床相關(guān)癥狀用于治療需要時獲取，因而相對容易，不增加患者額外的負擔(dān)。②部分患者的胸腔積液可以反復(fù)出現(xiàn)，這對于動態(tài)監(jiān)測患者的腫瘤的分子特征起到了重要的作用。③較血液學(xué)的檢測等其他手段，胸腔積液中的腫瘤信息更加豐富。

目前已有多項臨床研究顯示采用胸腔積液作為組織替代品進行檢測有較高的可行性。Kimura等[14]采用ARMS法對23例晚期肺癌患者的胸水中的腫瘤細胞進行檢測顯示，陽性率為35%，Zhang等[15]采用突變富集PCR法對胸水中的沉淀細胞和無細胞液檢測，結(jié)果顯示EGFR檢出率為50%。Wu等[16]研究通過PCR方法檢測136例非小細胞肺腺癌患者的惡性胸腔積液發(fā)現(xiàn)64%的患者存在EGFR突變，且突變率高于組織標(biāo)本中EGFR積液突變率。Smits等[17]的研究表明，胸腔積液中EGFR突變的比例高于組織標(biāo)本，但該研究采用的并非配對的組織標(biāo)本。當(dāng)前對于組織標(biāo)本和胸腔積液中驅(qū)動基因發(fā)生率存在差異的原因可能歸結(jié)于腫瘤的異質(zhì)性。

目前多數(shù)關(guān)于胸腔積液中驅(qū)動基因的研究集中在EGFR基因檢測方面，對于ALK融合基因的檢測還缺少在胸腔積液中的數(shù)據(jù)，目前僅有來自臺灣的一項回顧性研究。該研究[18]分析了116例EGFR陰性的患者中采用RTPCR的方法檢測ALK融合基因的表達情況，結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)39例患者為ALK陽性，ALK陽性患者達到34%。通過與組織樣本對比發(fā)現(xiàn)，其檢測一致率達到85%。該研究顯示RT-PCR對于胸腔積液檢測具有可行性，但研究中10例患者具有配對的組織標(biāo)本。 而目前對于臨床中開始廣泛應(yīng)用的其他驅(qū)動基因，如ROS1、T790M等檢測的研究報道較少，是否具有可行性還缺乏研究支持。胸腔積液在靶向藥物耐藥的患者中出現(xiàn)的比例較高，可達到40%-50%左右，因此，胸腔積液作為耐藥患者檢測的組織替代品可能有一定的價值。但目前還缺少相關(guān)的研究。

當(dāng)前對于胸腔積液中驅(qū)動基因的檢測目前也存在幾個問題：①目前對于胸腔積液中驅(qū)動基因的檢測方法還沒有確定，是采用傳統(tǒng)的測序法還是敏感度更高的方法。②多數(shù)患者的胸腔積液為血性積液，積液中混雜的多數(shù)是血細胞，如何通過有效的方法篩選出腫瘤細胞也是當(dāng)前的難點。③目前臨床中多數(shù)的回顧性分析采用的是腫瘤細胞包埋形成蠟塊后再行基因檢測，但這無疑增加了病理工作的負擔(dān)，是否可通過直接抽提積液中的游離腫瘤的DNA或RNA可以替代目前的蠟塊還有待于進一步探討。④目前的多數(shù)研究樣本量較小，且均為回顧性研究，缺少胸腔積液驅(qū)動基因與組織標(biāo)本配對的研究。

3 其他細胞學(xué)標(biāo)本

由于細胞學(xué)樣本中通常情況下細胞含量較少，通過敏感性較低的檢測方法往往無法獲取有價值的基因檢測信息。隨著新的敏感性更高的方法的臨床應(yīng)用，越來越多的研究采用細胞學(xué)樣本進行基因檢測。除上述提到的胸腔積液樣本外，研究較多的是內(nèi)鏡下穿刺細胞學(xué)、腦脊液、痰液細胞學(xué)、肺泡灌洗液等樣本。

Navani等[19]的研究納入119例超聲內(nèi)鏡穿刺細胞學(xué)標(biāo)本，結(jié)果共107例可進行EGFR基因檢測。Santis等[20]的研究共納入131例超聲內(nèi)鏡細針穿刺標(biāo)本，結(jié)果126例可進行基因檢測。這兩項研究均提示超聲內(nèi)鏡下細針穿刺的細胞學(xué)樣本進行基因檢測有較高的可行性。另外，一項臨床研究[21]采用細針穿刺轉(zhuǎn)移灶，如淋巴結(jié)、骨轉(zhuǎn)移灶、氣管鏡刷檢和沖洗液進行EGFR基因檢測，均提示具有較高的可行性。

Yang等[22]的研究納入30例NSCLC患者的腦脊液樣本，采用ARMS法檢測EGFR突變，結(jié)果共有13例患者（43%）明確為EGFR突變，與組織標(biāo)本比較顯示腦脊液作為EGFR基因檢測的敏感性和特異性分別為67%和82%。

Hubers等[23]對晚期肺癌患者痰液中細胞DNA檢測，共10例患者納入研究，結(jié)果表明，采用不同方法檢測可以發(fā)現(xiàn)30%-50%左右的患者存在EGFR基因突變，提示痰液檢測可能是一個良好的替代品。

有研究者[24]采用肺泡灌洗液進行EGFR突變檢測，發(fā)現(xiàn)有部分患者能夠檢測到EGFR突變，但研究的樣本量較小，還有待于進一步探索。

4 展望

組織標(biāo)本是晚期NSCLC基因檢測的金標(biāo)準，在晚期肺癌無法獲取組織標(biāo)本進行基因檢測的情況下，盡可能的獲得有價值的替代品進行驅(qū)動基因的檢測具有重要的臨床意義，但進一步優(yōu)化檢測流程，提高檢測的敏感度需要臨床進一步探索。在個體化治療的時代，單純定性檢測EGFR及ALK等單一基因突變遠遠不夠，實現(xiàn)定量、動態(tài)、尤其無創(chuàng)的基因檢測才能指導(dǎo)更為精準的個體化治療。目前高通量的二代測序技術(shù)已經(jīng)開始在臨床中使用，也有相關(guān)報道采用循環(huán)游離DNA及胸腔積液等組織替代品進行測序的相關(guān)報道，二代測序技術(shù)實現(xiàn)了從單基因檢測到多基因檢測、基因檢測從定性到定量的轉(zhuǎn)變，是腫瘤驅(qū)動基因檢測的發(fā)展方向。