張旭生 劉黎青 王 媛

山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟南 250355

腦缺血動物模型制備的研究進展

張旭生 劉黎青 王 媛

山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟南 250355

缺血性腦血管病是臨床上的常見病、多發(fā)病，是近年來醫(yī)學(xué)臨床基礎(chǔ)研究的熱點。腦缺血動物模型分為全腦性和局灶性兩種，以局灶性腦缺血動物模型較為常用，后者的制備有開顱閉塞法、血栓法、線栓法等多種方法。其中線栓法在實驗研究中應(yīng)用最為廣泛，自Koizumi首次制備該模型以來，醫(yī)學(xué)研究人員不斷對其進行改進，取得了良好的實驗效果。另外，由于基因工程在技術(shù)上有著無可比擬的優(yōu)勢，因此可以大膽預(yù)測其將在以后的腦缺血動物模型制備方面發(fā)揮越來越重要的作用，能夠更好地服務(wù)于臨床實驗研究。

腦缺血動物模型；制備；分類

缺血性腦血管病是內(nèi)科疾病的常見病、多發(fā)病，占全部腦卒中的60%～80%[1]，嚴重威脅人類的健康。腦缺血動物模型在缺血性腦血管相關(guān)疾病的實驗研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前腦缺血模型主要分為全腦缺血模型和局灶性腦缺血模型兩類，然而針對各種腦缺血模型的制作方法、適用范圍、影響因素等方面沒有全面的認知，這必將會影響腦缺血動物模型制備的進一步發(fā)展及更為廣泛的應(yīng)用。本研究將對腦缺血動物模型制備的研究進展做如下綜述：

1 全腦缺血模型

全腦缺血是指絕大部分或全腦血流量的降低，制作該模型對腦缺血實驗中的某些生理代謝研究有著重要作用[2]。此外，該模型穩(wěn)定性高，病理改變充分，海馬、丘腦、尾狀核、皮質(zhì)記憶區(qū)受損嚴重，可以模擬血管性癡呆的發(fā)病機制，也可用于神經(jīng)保護藥的評價研究[3]。此模型的造模方法多樣，有心跳驟停、主動脈血流阻斷、斷頭術(shù)、頸動脈氣囊阻斷大出血、低血壓、低氧性缺血、雙血管栓塞+低血壓、四血管栓塞、三血管阻斷、單向性頸動脈栓塞等[4]；其中比較常用的為四血管閉塞模型、雙血管栓塞+低血壓模型、三血管阻斷缺血模型。

1.1 雙血管栓塞+低血壓模型

Eklof等[5]首先設(shè)計并制備該模型，通過阻斷大鼠雙側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）合并使用降壓藥物使其平均動脈血壓降至50 mmHg（1 mmHg =0.133 kPa）左右，前腦血流量下降到基礎(chǔ)血流量的15%以下，產(chǎn)生可逆性前腦缺血。此法具有手術(shù)難度低、可操作性強、模型死亡率低等特點。但是血壓下降時易使其他重要器官的功能受到影響。武釗等[6]利用靜脈留置針代替頭皮針行靜脈插管術(shù)，避免了由于針頭過于銳利對血管造成的損傷；另外利用三通管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的靜脈穿刺來抽放血液，實現(xiàn)了對血液的自由抽放、回輸及血壓的監(jiān)測，使得造模成功率達87.5%。

1.2 三血管阻斷缺血模型

此模型在1985年由Kameyama等首先建立，大鼠麻醉后，做頸部正中切口，分離雙側(cè)CCA，除去枕骨腹側(cè)面部分顱骨，電灼斷扎基底動脈（basilar artery，BA），通過對雙側(cè)CCA的夾閉實現(xiàn)全腦缺血再灌注時間。這種造模方法成功率高，可通過阻斷雙側(cè)CCA時間的長短控制腦缺血的程度。但此造模方法是在顯微鏡下進行的，BA在電灼斷過程中易出血，手術(shù)難度大。

田鶴邨等[7]將此法改良，在直視下采用特制的動脈夾以控制BA的缺血-再灌注時間，使BA的損傷減輕。結(jié)果表明，在實驗過程中，模型大鼠血壓正常穩(wěn)定，避免了由血壓降低引起的其他重要臟器的再灌注壓不足而導(dǎo)致的功能損害。

1.3 四血管閉塞模型

1979年由Pullsineli等[8]建立該模型。大鼠成功麻醉后，分離并暴露其雙側(cè)CCA和寰椎兩側(cè)橫突孔，剝離兩側(cè)椎動脈（vertebral artery，VA）并用電凝器將其阻斷。24 h后夾閉其雙側(cè)CCA，造成全腦缺血。此模型可根據(jù)實驗要求，通過控制動脈夾的夾閉來實現(xiàn)腦缺血-再灌流，從而實現(xiàn)不同程度的腦缺血損傷。有學(xué)者在此基礎(chǔ)上采用3階段制作方法對其進行改良，第1階段：分離雙側(cè)CCA；第2階段：沿寰椎內(nèi)斜向上的神經(jīng)來尋找橫突孔，分2次灼燒阻斷雙側(cè)VA；第3階段：24 h后夾閉CCA 10 min。此法可顯著提高模型制作成功率和存活率[9]。

1.4 局灶性腦缺血模型

與全腦缺血模型比較而言，局灶性腦缺血模型的優(yōu)勢在于可對腦缺血特定部位進行干預(yù)，全身不良反應(yīng)較小，與人類腦缺血發(fā)病情況更為相似，因此，此類模型應(yīng)用也更廣泛。局灶性腦缺血模型可以通過開顱閉塞法、血栓栓塞法、線栓法、化學(xué)刺激誘導(dǎo)血栓阻斷法、內(nèi)皮素誘導(dǎo)法和光化學(xué)誘導(dǎo)法等多種方法實現(xiàn)[10]。目前常用制備方法主要為前3種。

2 制備方法

2.1 開顱閉塞法

1981年Tamura等[11]建立該模型。首先經(jīng)顳下部或眼眶入顱，阻斷大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）及其分支，造成局灶性腦缺血。此法的可視性高，缺血效果好，術(shù)后神經(jīng)功能評分普遍要好于線栓組，其術(shù)后生存時間也長于線栓組，可達2周，甚至更長[12]。但是開顱創(chuàng)傷大，對術(shù)者的手術(shù)技巧要求較高，尤其是MCA閉塞后無法實現(xiàn)再灌注，限制了其推廣應(yīng)用。2013年Yang等[13]采取氟烷吸入麻醉小鼠成功后，電凝其左側(cè)MCA，同時阻斷雙側(cè)頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）血流15 min的方法建立模型。此手術(shù)操作用時短，腦缺血后小鼠死亡率低。該模型可用于評估小鼠局灶性缺血性腦卒中、遠期神經(jīng)功能[14]。

2.2 血栓栓塞法

Kudo等[15]在1982年報道了該模型。此模型的優(yōu)點在于利用大鼠自體血栓栓塞，更加接近人類腦缺血的實際情況；并且還可用來探索溶栓機制、評價溶栓藥物療效，具有其他模型無可替代的優(yōu)勢[16]。缺點在于存在栓子的走行和栓子是否阻塞期望血管不確定性等問題。2012年Durand等[17]在此模型基礎(chǔ)上，經(jīng)顳葉開顱，向MCA注射凝血酶，造成原位血栓，然后應(yīng)用溶栓藥物成功溶栓。開辟了血栓栓塞-溶栓這一新的腦缺血模型研究領(lǐng)域。

2.3 線栓法

線栓法造模因其可操作性高，缺血部位固定，并可按照實驗要求控制缺血-再灌注時間，成為沿用至今的經(jīng)典MCAO模型制備方法。1986年Koizumi等[18]首次報道該模型，將大鼠麻醉成功后，行頸部正中切口，玻璃分針分離其右側(cè)CCA、頸外動脈（external carotid artery，ECA）、ICA，結(jié)扎ECA后，在CCA分叉處下方用眼科剪沿ICA方向做一楔形切口，將線栓插入切口，通過ICA到達MCA起始端感到阻力后，結(jié)扎CCA近心端，由此造模成功。若要進行再灌注，則由ECA插入線栓至MCA起始端，然后再將尼龍線往回抽到ECA處。

近年來，研究者們在線栓制備、麻醉、手術(shù)等環(huán)節(jié)加以改良優(yōu)化，使該模型更加完備。

2.3.1 線栓影響因素

線栓的直徑及插線深度、表面涂層及末端平滑度對栓塞效果影響較為顯著。

2.3.1.1 線栓的直徑及插線深度 關(guān)于線栓的直徑，1989年Longa等[19]將4-0單尼龍線頭端燙成光滑而膨大的球形，使其直徑稍大于尼龍線本身替代Koizumi的線栓制備方法，此法優(yōu)點是較為便捷，缺點在于沒有考慮到因大鼠體重的不同而產(chǎn)生的血管直徑差異。有研究表明，隨著大鼠質(zhì)量的增加，其線栓的直徑也隨之增加[20]。杜郭佳等[21]認為體重在250～300 g的大鼠，對手術(shù)的耐受性強，血管變異小，更適宜制備MCAO模型。

關(guān)于線栓的插線深度，文獻報道不一。崔龍等[22]采用測量TC線[門齒根部前沿（T點）至CCA分叉點（C點）的連線]長來確定穿線深度，并給出公式：插線深度=1.0657×TC線長（mm）-2.6345，對預(yù)估插線深度有著很好的指導(dǎo)作用。

2.3.1.2 線栓涂層 劉運泉[23]在線栓頭端覆以硅橡膠，然后用左旋多聚賴氨酸處理，此法避免了因線栓頭端太銳利刺破動脈血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，同時也增強了缺血的穩(wěn)定性，保證了可靠的缺血效果。有研究表明，石蠟涂層線栓的建模成功率達100%，與裸露尼龍線栓相比，梗死效果更好，模型動物死亡率更低，是一種新型可靠的MCAO制備方法[24]。

2.3.2 手術(shù)方法

有學(xué)者在實驗中采用頸部旁正中切口，不用微血管夾，改用線套法控制CCA以及ECA血流，松開套線恢復(fù)血液循環(huán)，避免空間小、血管夾夾閉困難及易出血等問題。此法視野暴露充分，易于分離肌肉和血管，出血少，對氣管刺激小，總模型成功率為93.75%[22]。

馮珂等[25]在造模過程中發(fā)現(xiàn)，從CCA分出的ICA和ECA基本呈背腹分布，正面觀察不宜辨別。經(jīng)過進一步剝離才可確定在腹側(cè)的是ECA，在背側(cè)的是ICA。而孫念霞等[26]在結(jié)扎ICA斷端外，線結(jié)外端用電刀阻斷，并在插線時借助彎鑷的力量使線栓沿CCA分叉處ICA血管的方向前行。此法可使線結(jié)不易脫落，插線成功率亦隨之提高。

2.3.3 麻醉方法及麻醉劑的選擇

常用的麻醉方法有氣體麻醉和腹腔注射麻醉。氣體麻醉優(yōu)點是作用迅速，易于控制麻醉時間。缺點是需持續(xù)給藥，且對呼吸道有一定的刺激作用。腹腔注射麻醉常用藥物為戊巴比妥鈉和水合氯醛。有學(xué)者對兩者的麻醉效果進行對比研究，結(jié)果顯示，戊巴比妥鈉應(yīng)用劑量較水合氯醛小，前者有效量與致死量更接近。且戊巴比妥水溶液不穩(wěn)定，易分解。因此，就穩(wěn)定性及安全性而言，腹腔注射麻醉劑優(yōu)于水合氯醛[27-28]。

3 結(jié)語

隨著臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究水平不斷提高，腦缺血動物實驗?zāi)Ｐ偷脑炷７椒ㄔ谠械幕A(chǔ)上不斷被加以改良和優(yōu)化，使其能夠更好地模擬出人類腦缺血時出現(xiàn)的病理生理變化，為臨床醫(yī)學(xué)工作者提供了有力的動物實驗研究基礎(chǔ)設(shè)施。目前，國外有學(xué)者在基因水平對實驗動物加以篩選，培育出更加適用于實驗研究的轉(zhuǎn)基因大鼠。依據(jù)基因改造方法的不同可分為R169C、R90C、R142C和C428S 4種CADASIL大鼠模型，由于基因改造方法的差異，造成各個模型的基因表達水平不同[29-30]。在沒有血-腦屏障破壞和血管結(jié)構(gòu)改變的情況下，CADASIL大鼠模型易出現(xiàn)腦血管功能紊亂、循環(huán)障礙、腦血管內(nèi)徑變窄、肌源性反應(yīng)減弱、自動調(diào)節(jié)能力減弱等表現(xiàn)[31]。但是目前的腦缺血動物模型仍受到動物體重、性別、麻醉方法、操作熟練程度、溫度、栓子類型等諸多因素的影響。如何能夠簡便有效地制作出損傷小，成功率高，重復(fù)性好的腦缺血模型是亟待解決的問題。相信在不久的將來，通過廣大學(xué)者不懈的努力和鉆研，腦缺血動物模型的制備方法將更加完善，能夠更好地服務(wù)于臨床實驗研究，為腦缺血疾病提供更多的理論依據(jù)。

[1]王擁軍，張?zhí)K明.中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級預(yù)防指南2010[J].中華神神經(jīng)科雜志，2010，43（2）：154-160.

[2]孫蓉，張亞囡.缺血性腦血管病動物模型研究概況與中藥藥效學(xué)評價思考[J].中國中藥雜志，2011，36（16）：2299-2302.

[3]欒永福，李曉驕陽，孫蓉.多梗死性腦癡呆模型研制與中藥藥效評價思考[J].中藥藥理與臨床，2012，28（4）：121-124.

[4]鄒永杰，崔高宇，馮華.腦缺血動物模型的研究進展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2012，39（5）：423-426.

[5]Eklof B，Siesjo BK.The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state of the rat brain[J].Acta Physiol Scand，1972，86（2）：155-165.

[6]武釗，黃偉青，文銳玲，等.改良二血管阻斷加低血壓法制作大鼠全腦缺血再灌注模型[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（17）：4-5.

[7]田鶴邨，陳前芬，謝群.三血管阻斷與重開放造成的大鼠全腦缺血再灌流損傷的實驗研究[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1993，18（2）：113-116.

[8]Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke，1979，10（3）：267-272.

[9]李文東，姜洪波，連曉清，等.Pulsinelli四血管法大鼠全腦缺血模型制作方法的改進[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，27（3）：237-239.

[10]陳曉娟，肖宗宇，潘琪，等.改良線栓法大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（3）：24-27.

[11]Ginsberg MD，Busto R.Rodent models of cerebral ischemia[J].Stroke，1989，20（12）：1627-1642

[12]趙強，朱偉杰，王芙昱，等.小鼠局灶性腦缺血模型的比較分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35（8）：870-872.

[13]Yang D，Nakajo Y，Iihara K，et al.A logliptin，a dipeptidylpeptidase-4 inhibitor，for patients with diabetes mellitus type 2，induces tolerance to focal cerebral ischemia in non-diabetic，normal mice[J].Brain Res，2013，1517（6）：104-113.

[14]Ma J，Peng C，Guo W，et al.A modified model of middle cerebral artery electrocoagulation in mice[J].CNS Neuroscience&Therapeutics，2012，18（9）：796-798.

[15]Kudo M，Aoyam A，Ichimori S，et al.An animal model of cerebral infarction；hanologous blood clots boli in rats[J]. Stroke，1982，13（4）：505-508.

[16]孫文昊，陳會生.嚙齒類動物腦缺血模型的回顧與研究進展[J].中國腦血管病雜志，2013，10（8）：432-443

[17]Durand A，Chauveau F，Cho TH，et al.Spontaneous reperfusion after in situ thromboembolic stroke in mice[J]. PLoS One，2012，7（11）：50083.

[18]KoizumiJ，Yoshida Y，NakazawaT，etal.Experimentalstudies of ischemic brain edema.1.A new experimental model of cerebral embolism infarcts in the ischemic area[J]. Japan J Stroke，1986，（8）：1-8.

[19]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Recersible middlecerebralartery occlusion without craniectomyin rats[J]. Storke，1989，20（1）：84-91.

[20]Kuge Y，Minematsu K，Yamaguchi T，et al.Nylon mono of filament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke，1995，26（9）：1655-1657.

[21]杜郭佳，朱國華，范雁東，等.改良法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型[J].中國醫(yī)刊，2013，48（12）：42-44.

[22]崔龍，李忠仁.“同身寸”法估算大鼠局灶性腦缺血模型線栓深度[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，21（1）：40-42.

[23]劉運泉，戴穎.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的改進[J].中國臨床解剖學(xué)雜志，2005，23（2）：222.

[24]Zuo XL，Wu P，Ji AM.Nylon filament coated with paraffin for intraluminal permanent middle cerebral artery occlusion in rats[J].Neuroscience Letters，2012，519（1）：42-46

[25]馮珂，紀立金.線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型的體會[J].遼寧中醫(yī)雜志，2013，40（1）：21-23.

[26]孫念霞，高維娟，易忠良.改良線栓法制作SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型[J].中國組織工程研究，2014，18（2）：225-230.

[27]謝健，閔蘇.參附注射液對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)的影響[J].中國藥房，2011,22（27）：2517-2519.

[28]盧英，蔡光先，譚琥，等.大腦中動脈線栓法腦缺血模型制作的改進及經(jīng)驗探討[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，34（1）：6-9.

[29]AyataC.CADASIL：experimental insights from animal models[J].Stroke，2010，41（10）：129-134.

[30]劉勝敏，楊志宏，孫曉波.沙鼠腦缺血模型特點及應(yīng)用的研究進展[J].中國實驗動物學(xué)報，2013,21（6）：79-83.

[31]Joutel A，Monet-Leprêtre M，Gosele C，et al.Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease[J].J Clin Invest，2010，120（2）：433-445.

Research progress of preparation of cerebral ischemia animal model

ZHANG Xusheng LIU Liqing WANG Yuan
School of Basic Medicine,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong Province,Ji'nan 250355, China

Ischemic cerebrovascular disease is a common and frequently occurring disease.It is a recent hotspot in the field of clinical basic research.Animal model of cerebral ischemia is divided into global cerebral ischemia and focal cerebral ischemia,and the animal model focal cerebral ischemia is more commonly used.There are several methods for preparing the latter model,including occlusion method with craniotomy,thrombosis method,suture-occluded method etc.In which the suture method is the most widely used in experimental research.Since Koizumi prepared the model for the first time,medical researchers have continued to improve it and achieved good experimental results.Besides, since genetic engineering technology has unparalleled advantages,it is a bone predict that it will play an increasingly important role in the preparation of future animal models of cerebral ischemia,and it will better serve the clinical studies.

Cerebral ischemia animal model;Preparation;Classification

R743.9

A

1673-7210（2015）11（c）-0056-04

2015-08-14本文編輯：趙魯楓）

國家自然科學(xué)基金項目（8140151367）。

張旭生（1984-），男，山東中醫(yī)藥大學(xué)2013級中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的實驗及臨床研究。

劉黎青（1961-），女，教授，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的實驗及臨床研究。