李美姿姜夢(mèng)迪黃 楷綜述 丁之德審校

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系（上海 200025）；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系

表觀遺傳學(xué)與哺乳動(dòng)物配子和胚胎發(fā)生發(fā)育的研究進(jìn)展

李美姿1姜夢(mèng)迪1黃 楷1綜述 丁之德2審校

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系（上海 200025）；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系

表觀遺傳學(xué)是指在細(xì)胞有絲分裂或減數(shù)分裂中未經(jīng)DNA序列變化所引起的基因功能發(fā)生遺傳學(xué)改變的學(xué)說。它的研究現(xiàn)已跨越了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多不同領(lǐng)域。近年來，表觀遺傳學(xué)在生殖醫(yī)學(xué)的研究中發(fā)展迅速，如在配子和胚胎形成過程中包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA調(diào)控等修飾。其中，DNA的甲基化調(diào)控包括高甲基化、低甲基化、從頭甲基化和去甲基化，在此過程中需要甲基化酶如DNMT或去甲基化酶的調(diào)控；組蛋白修飾則是在組蛋白的氨基酸殘基上所進(jìn)行的諸如甲基化、乙酰化、泛素化以及巴豆?；纫幌盗懈淖円约敖M蛋白本身在配子或胚胎形成過程中的變化；RNA調(diào)控包括配子形成過程的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和非編碼RNA所扮演的各種不同角色。本文將根據(jù)近年來表觀遺傳學(xué)在生殖領(lǐng)域的研究進(jìn)展作相關(guān)綜述。

一、表觀遺傳與精子

（一）DNA甲基化

DNA甲基化（methylation）是哺乳動(dòng)物實(shí)施基因調(diào)控和轉(zhuǎn)座子(transposons)沉默的典型性表觀遺傳修飾。它通?？梢酝ㄟ^直接修飾位于CpGs(CpG雙核苷酸序列)的胞嘧啶殘基（5-mC）來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。Molaro等[1]研究表明，在人類精子基因組中，96%的CpGs均有甲基化修飾。在此過程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（De novo methylation transferase，DNMT）家族扮演著不可或缺的角色——從頭甲基化（de novo methylation）和甲基化維持（maintenance methylation）。從頭甲基化是指不依賴已有的甲基化DNA鏈，而是在一個(gè)新位點(diǎn)上將DNA鏈中的胞嘧啶C5甲基化，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），與維持甲基化對(duì)應(yīng)。直接負(fù)責(zé)從頭甲基化的酶包括DNMT3A（DNMT3a），DNMT3B （DNMT3b）和DNMT3L（DNMT3l）。DNMT3A和DNMT3B均含有催化結(jié)構(gòu)域，使之能對(duì)靶基因位點(diǎn)直接甲基化，而DNMT3L則與DNMT3A和DNMT3B相互協(xié)調(diào)決定適當(dāng)?shù)募谆稽c(diǎn)。當(dāng)甲基化標(biāo)記相繼成立，DNMT1可在細(xì)胞分裂中維持這些標(biāo)志。

甲基化在生殖細(xì)胞中一個(gè)重要作用就是沉默特定的基因，從而形成大部分印記基因（imprinted gene）。哺乳動(dòng)物細(xì)胞印記基因來自于親代遺傳下來的表觀遺傳標(biāo)志[2]。在雄性精子中，只有少部分基因被發(fā)現(xiàn)具有父系印跡，包括IGF2/H19、RASGRF1和GTL2位點(diǎn)[3]。

（二）組蛋白修飾

雄性生殖細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育中通過核凝聚來更好的完成后續(xù)發(fā)生的精子入卵過程，因此需要特定的后天修飾，而如此嚴(yán)苛的體積控制有利于父系DNA入卵的有效性和安全性。該過程需要精子特異核蛋白——魚精蛋白（protamine）來完成，它能通過中和DNA的負(fù)電荷使染色質(zhì)結(jié)合得更緊密。精子中組蛋白（histone）與魚精蛋白之間的替換是一漸進(jìn)過程。首先，一些典型的組蛋白被睪丸特異性組蛋白變體所代替；隨后，90%左右的組蛋白被過渡蛋白（transition protein, TP）代替；最后，魚精蛋白替代過渡蛋白完成整個(gè)替換過程，至此形成緊密裝配的精子細(xì)胞核。

在精子形成過程中，組蛋白變體（histone variant）的地位十分重要。然而，在組蛋白至魚精蛋白的替換中，還需要進(jìn)行大量的組蛋白乙?；╝cetylation）過程。有趣的是，乙酰化可能又是睪丸蛋白降解的標(biāo)志，數(shù)據(jù)顯示乙?；牟G丸蛋白通過乙?；蕾囃緩蕉皇欠核鼗╱biquitination）依賴途徑進(jìn)行蛋白降解[4]。精子形成中組蛋白的泛素化修飾與體細(xì)胞中的蛋白降解過程也不同，它能夠通過RNF8（E3泛素化連接酶）依賴途徑沉默性染色體。RNF8基因敲除的小鼠睪丸顯示組蛋白泛素化抑制和H4K16乙?；瘡U除，由此可見，組蛋白泛素化和乙?；歉叨嚷?lián)系的過程[4]。

組蛋白甲基化是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone melthyltransferases，HMT）催化，常發(fā)生在H3、H4組蛋白N端賴氨酸或精氨酸殘基，包括單甲基化、雙甲基化和三甲基化。組蛋白甲基化參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組完整性維持及表觀遺傳模式的傳遞。不同的甲基化模式扮演著不同的角色，如H3K4me3（活化模式）或H3K27me3（抑制模式），它們分別標(biāo)志著不同的父系基因啟動(dòng)子，活化模式為精子形成過程基因表達(dá)所需，而抑制模式則扮演著調(diào)節(jié)子的角色[5]。

（三）精子RNA

對(duì)于精子來說，遺傳信息準(zhǔn)確的時(shí)空表達(dá)對(duì)于其正常發(fā)生和發(fā)育極為重要，一般調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平。mRNA的命運(yùn)主要由

NA結(jié)合蛋白（RNA binding protein）控制，人體內(nèi)有多種不同的RNA結(jié)合蛋白，其中有睪丸特異的

NA結(jié)合蛋白。它們?cè)跍p數(shù)分裂和減數(shù)分裂前期的細(xì)胞中合成并通過識(shí)別靶mRNA形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）復(fù)合物參與mRNA調(diào)節(jié)[6]。

由于精子在染色質(zhì)濃縮前也存在活躍的基因表達(dá)，其中的非編碼RNA如Dicer酶依賴性小RNA （Dicer-dependent miRNA）和Dicer酶無關(guān)的piRNA （Dicer-independent PIWI-interacting RNAs）也逐漸為人們所了解[7]。性染色體上的基因通常在減數(shù)分裂Ⅰ期時(shí)就隨著性染色體失活而沉默，而X染色體上miRNA基因簇所編碼的產(chǎn)物似乎為進(jìn)化所青睞，以致其逃過性染色體失活而重現(xiàn)表達(dá)。雄性小鼠在早期生活中如遭遇壓力將會(huì)改變其精子中miRNA表達(dá)，并可能將相應(yīng)的抑郁癥狀遺傳給后代[8]。而對(duì)于iRNA研究顯示，它是一類與PIWI蛋白聯(lián)合發(fā)揮作用的RNA，在精子形成中，PIWI通路在沉默轉(zhuǎn)座子方面具有特殊的作用[9]。另一方面，精子的正常發(fā)育及受精后精子在卵子中表達(dá)相關(guān)蛋白以保護(hù)自身的遺傳信息都與轉(zhuǎn)座子的調(diào)控密不可分。

（四）精子的表觀遺傳與男性不育

隨著精子的表觀遺傳修飾不斷被證明，許多新技術(shù)也被應(yīng)用于探索其對(duì)男性不育所造成的影響。甲基化已成為研究最多的領(lǐng)域，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多基因啟動(dòng)子的超甲基化（hypermethylation）被證實(shí)與男性不育有關(guān)，如：MTHFR，PAX8，NTF3，F(xiàn)N，HRAS，JHM2DA，IGF2，H19，RASGRF1，

TL2，PLAG1，D1RAS3，MEST，KCNQ1，LIT1 和SNRPN等[10]。精子染色質(zhì)重塑過程中兩種魚精蛋白比例P1:P2的紊亂也為男性不育的因素之一，同時(shí)在輔助生殖時(shí)也可作為精子質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)[11]。此外，組蛋白修飾的紊亂和RNA的相關(guān)變化也均與男性不育有一定的相關(guān)性。

二、表觀遺傳與卵子

（一）DNA甲基化

在原始生殖細(xì)胞中會(huì)發(fā)生基因甲基化的清除，而在此之后，全基因組的從頭開始甲基化以及在印記位點(diǎn)的等位基因（allelic genes）建立起特異性標(biāo)記[12]。對(duì)于雌性來說，從頭甲基化是在卵細(xì)胞進(jìn)入卵泡發(fā)育生長(zhǎng)階段獲得的，發(fā)生于初級(jí)卵泡至竇狀卵泡時(shí)期，并且印跡基因甲基化與卵細(xì)胞大小相關(guān)，即隨著卵泡直徑增加甲基化水平也相應(yīng)增加[13]。受精后至桑葚期前，母系基因組再被動(dòng)的發(fā)生去甲基化（demethylation）[14]。

卵細(xì)胞的發(fā)育成熟中，通過對(duì)其DNA中CpG島的甲基化和去甲基化調(diào)控很多關(guān)鍵基因的表達(dá)，如在性激素的合成以及卵細(xì)胞對(duì)其敏感性方面，多梳蛋白家族基因（Polycomb group，PcG）中Eed和Cbx7其啟動(dòng)子甲基化會(huì)解除對(duì)kiss1基因的抑制以促進(jìn)青春期開始，使GnRH呈正常的脈沖式釋放[15]。另外，該甲基化對(duì)類固醇合成基因的調(diào)節(jié)也較多見，如低濃度雙酚A（bisphenol A）可使Star基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的CpG島甲基化水平發(fā)生改變，同時(shí)可通過核受體5a1s（nuclear receptor, Nr5a1s），也稱類固醇合成因子1（steroidogenic factor-1，Sf-1）來調(diào)節(jié)類固醇的合成，促進(jìn)性腺發(fā)育，引發(fā)性早熟[16]。

（二）組蛋白乙?；?/p>

從卵細(xì)胞發(fā)育中期開始，轉(zhuǎn)錄逐漸降低，完全成熟的卵細(xì)胞幾乎沒有轉(zhuǎn)錄活性，因此，對(duì)于卵細(xì)胞發(fā)育能力的獲得，轉(zhuǎn)錄沉默（transcription silencing）是必要的，并且它與染色質(zhì)緊縮和組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾（Post-transcriptional Modification，PTM）有關(guān)。PTM含磷酸化（phosphorylation）、甲基化、泛素化和乙?；揎?，尤其以組蛋白乙?；^為多見。

組蛋白中賴氨酸乙?；{(diào)節(jié)由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）協(xié)調(diào)完成。HDACs可以對(duì)組蛋白和其他蛋白進(jìn)行去乙?；?，如微管蛋白和轉(zhuǎn)錄因子TRP53（P53）等。哺乳動(dòng)物的HDAC有18種，分為4類。HDAC2是卵細(xì)胞發(fā)育中主要的組蛋白乙酰化調(diào)節(jié)酶，也是H4K16主要的去乙?；?。在HDAC2缺乏的卵細(xì)胞中，H4K16乙?；砍试黾于厔?shì)并會(huì)損害著絲點(diǎn)即動(dòng)粒的功能，因?yàn)橥蛔兟鸭?xì)胞的動(dòng)粒較少能形成穩(wěn)定的微管連接，造成MII期卵細(xì)胞染色體的分離障礙，這表明HDAC2在染色體分離中具有重要作用[17]。Hdac1和Hdac2都缺失時(shí)，卵泡發(fā)育就會(huì)停滯在次級(jí)卵泡期，H3K4的甲基化明顯降低，同時(shí)在突變的卵細(xì)胞中TRP53乙?；裁黠@增加，凋亡率增高[18]。此外，最近發(fā)現(xiàn)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白7（Retinoblastoma associated protein 7, RBBP7）含組蛋白去乙?；?，這是一種來自母體休眠的mRNA（dormant maternal mRNA），在卵細(xì)胞成熟時(shí)其關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)譯中被招募以調(diào)節(jié)組蛋白乙?；绕涫切∈舐鸭?xì)胞染色體的減數(shù)分裂成熟中在其特異組蛋白的去乙?；{(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[19]。

（三）miRNA作用

microRNAs（miRNAs）在卵泡發(fā)育和成熟調(diào)節(jié)中扮演了重要的角色，如敲除雌鼠Dicer1基因后，可抑制該miRNA生成且首次發(fā)現(xiàn)其在卵泡生長(zhǎng)和子宮功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著特殊的作用。隨后有一系列miRNA的具體功能被發(fā)現(xiàn)：（1） MiR-133b在卵細(xì)胞生長(zhǎng)成熟中受到IGF-1信號(hào)通路調(diào)控，并調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白TAGLN2的表達(dá)[20]；（2）miR-21可阻斷排卵前小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,維持黃體功能[21]，并通過著床前調(diào)節(jié)PTGS2和RECK基因表達(dá)以調(diào)控雌激素和孕酮對(duì)子宮的作用，保證著床的準(zhǔn)確性；（3）miR-383通過靶向Rbms1使c-Myc失活以促進(jìn)類固醇激素的合成[22]。

（四）表觀遺傳在雌性生殖中的應(yīng)用

很多表觀遺傳的標(biāo)記可作為人工輔助生殖的測(cè)評(píng)指標(biāo)[23]。而對(duì)卵泡發(fā)生中的表觀遺傳變化進(jìn)行研究，可更好的模擬體內(nèi)自然過程，增加人工輔助生殖的成功率[24, 25]，減少倫理和經(jīng)濟(jì)上的風(fēng)險(xiǎn)且提高人口素質(zhì)[26, 27]。另外，對(duì)于一些表觀遺傳關(guān)鍵過程的調(diào)控和維持還可成為某些生殖系統(tǒng)疾病甚至腫瘤治療的新方法[28]。而相對(duì)遺傳信息影響較小的miRNA，更可應(yīng)用于一些避孕藥物的研發(fā)[29]。

三、表觀遺傳與胚胎

（一）DNA甲基化和去甲基化

從頭甲基化酶DNMT對(duì)胚胎的影響主要有：（1）Dnmt1，在小鼠原腸胚形成前或過程中，敲除其Dnmt1會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化水平廣泛降低，直至死亡；（2）Dnmt3，其中Dnmt3b在囊胚期顯著表達(dá)。敲除Dnmt3b基因?qū)?dǎo)致胚胎死亡，而Dnmt3a敲除卻部分可行。Dnmt3l缺乏雖有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的結(jié)構(gòu)域，但作為Dnmt3a和Dnmt3b必需的輔助因子，Dnmt3l基因敲除小鼠可存活，但缺乏從頭DNA甲基轉(zhuǎn)移酶完整性會(huì)導(dǎo)致雄性不育和無母系遺傳障礙的小鼠胚胎死亡。

（二）組蛋白修飾

組蛋白修飾作為調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制, 可影響下游蛋白的表達(dá)及功能的發(fā)揮,進(jìn)而決定了細(xì)胞的狀態(tài)，影響胚胎的發(fā)生和發(fā)育。如組蛋白乙?；瘜?duì)于胚胎發(fā)育十分重要，敲除組蛋白乙?；窰ATs家族的不同成員，小鼠胚胎發(fā)育會(huì)嚴(yán)重受阻，表現(xiàn)為缺少特異性脊索中胚層和軸旁中胚層分化來的胚胎結(jié)構(gòu)，如嚴(yán)重的顱神經(jīng)管閉合缺陷、心臟發(fā)育缺陷等。在去乙酰化酶HDAC家族中，HDAC1，HDAC2和HDAC3在小鼠胚胎發(fā)育后期均有較強(qiáng)表達(dá)，在植入前早期的胚胎中HDAC1表達(dá)更強(qiáng)，并且HDACs時(shí)序性規(guī)律的表達(dá)對(duì)小鼠腸的發(fā)育至關(guān)重要，同時(shí)還可參與胚胎心臟和骨骼肌的發(fā)生[30]。

除此外，組蛋白甲基化也在胚胎發(fā)生和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。研究表明，小鼠胚胎早期WDR82 （HMT復(fù)合體的亞基之一）基因沉默，將引起轉(zhuǎn)錄因子POU5F1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)H3K4me3減少，并伴隨著胚泡細(xì)胞數(shù)目減少、胚胎細(xì)胞凋亡及胚胎發(fā)育遲緩等現(xiàn)象發(fā)生[31]。

（三）miRNA與胚胎發(fā)生和發(fā)育

哺乳動(dòng)物胚胎的正常發(fā)育需要廣泛的基因轉(zhuǎn)錄阻滯和母源性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的清除，這一過程與胚胎基因組的激活即母體至受精卵轉(zhuǎn)化（maternal to zygote transition，MZT）相一致。MZT進(jìn)程中，母源性mRNA的清除正是通過3’UTR區(qū)域的相關(guān)作用實(shí)現(xiàn)的，而miRNA在此過程中發(fā)揮動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。研究表明，DNA甲基化和組蛋白修飾作為表觀遺傳經(jīng)典調(diào)節(jié)方式影響miRNA的表達(dá)。反之，miRNA也可通過調(diào)節(jié)DNMT來調(diào)控DNA甲基化：miR-148a與miR-148b以DNMT3b的mRNA某一編碼區(qū)為靶點(diǎn)，抑制DNMT3b的表達(dá)；而miRNA-140、miRNA-1與HDAC4基因的3’UTRs結(jié)合，也可抑制其基因表達(dá)。在臨床宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）胎兒的臍血CD34+干細(xì)胞中，檢測(cè)到肝細(xì)胞核因子4α基因（HNF4A gene）啟動(dòng)子區(qū)的DNA發(fā)生甲基化修飾改變，這是幼年速發(fā)2型糖尿病發(fā)病的重要誘因之一[32]。其機(jī)制是HNF4A基因涉及胚胎時(shí)期肝臟和胰腺的功能發(fā)育，并且與這兩種組織中許多代謝通路的基因表達(dá)主動(dòng)協(xié)調(diào)相關(guān)。

四、總結(jié)與展望

由于在生殖細(xì)胞的發(fā)生中表觀遺傳的表現(xiàn)各有特點(diǎn)，因此對(duì)精子和卵細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)研究也就各有重點(diǎn)。在胚胎期，由于受精后各種標(biāo)記需重新建立，同時(shí)又受到親代配子的影響，所以其變化更為復(fù)雜。目前表觀遺傳對(duì)生殖影響的研究除了廣泛的探索和描述外，對(duì)其機(jī)制和信號(hào)通路的研究已逐漸成為熱點(diǎn)，但具體的環(huán)節(jié)還亟待完善，而這也正是表觀遺傳學(xué)的研究成果應(yīng)用于生物學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。

致謝：本文由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第八期大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（2014011）基金項(xiàng)目資助

關(guān)鍵詞哺乳動(dòng)物; 表觀遺傳; 配子發(fā)生; 胚胎發(fā)育

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（2014-09-05收稿）

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中圖分類號(hào)Q 953