王 慧，金武龍

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C作用下兔舌癌高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立

王 慧，金武龍

舌癌是口腔癌中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直接影響患者的生存及治療。利用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C的生物學(xué)作用，建立具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的舌癌動(dòng)物模型，提高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，對(duì)推動(dòng)舌癌發(fā)病機(jī)制和防治措施的研究具有重要意義。作者對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C作用下兔舌癌高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型建立的原理及方法作一綜述。

舌癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C；動(dòng)物模型

舌癌是最常見的口腔癌，其生物學(xué)特征具有生長(zhǎng)快、浸潤(rùn)性強(qiáng)、早期可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1-2]。隨著診治技術(shù)，尤其是綜合序列治療在臨床上的應(yīng)用，舌癌患者的治愈率和生存率已有明顯提高。但局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍是舌癌患者主要致死因素，并以區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為其主要表現(xiàn)形式，也是判斷患者愈合的可靠指標(biāo)。因此，建立具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的舌癌動(dòng)物模型，完整再現(xiàn)舌癌的臨床特點(diǎn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性，為舌癌的預(yù)防及治療提供更好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前所建立的大動(dòng)物舌癌模型，均存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率不穩(wěn)定、建模周期長(zhǎng)、成功率低等缺點(diǎn)。因此，提高舌癌動(dòng)物模型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率對(duì)舌癌的研究至關(guān)重要。

1 舌癌動(dòng)物模型

人類疾病動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料。使用動(dòng)物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)極為重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段，有助于更方便、更有效地認(rèn)識(shí)人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。

1.1 舌癌動(dòng)物模型的種類及優(yōu)缺點(diǎn) 在舌癌的研究中，以何榮根等[3]首次建立國(guó)內(nèi)第1株人舌癌細(xì)胞系Tca8113為開端，舌癌動(dòng)物模型從化學(xué)致癌劑誘發(fā)模型、腫瘤移植模型到遺傳工程動(dòng)物模型，經(jīng)歷了一系列不斷優(yōu)化的過程。早期許多學(xué)者采用化學(xué)制劑誘發(fā)舌癌動(dòng)物模型，常用化學(xué)制劑為4-硝基喹啉-1-氧化物，誘發(fā)因素、條件可控性強(qiáng)，但動(dòng)物模型制作周期長(zhǎng)，目前廣泛應(yīng)用于舌癌分子學(xué)的研究和化學(xué)預(yù)防藥物的研究[4]。移植性腫瘤動(dòng)物模型包括同種移植和異種移植，人舌癌動(dòng)物模型屬異種移植，將人舌癌組織或細(xì)胞系移植到動(dòng)物體內(nèi)重新成瘤。該模型不能用于病因?qū)W、癌前病變和癌變的研究，但對(duì)成瘤、治療、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等研究非常有意義[5]。遺傳工程動(dòng)物模型將目的基因插入到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因序列中，最終使外源基因得到表達(dá)并可傳代。該技術(shù)層次達(dá)細(xì)胞分子水平，由動(dòng)物整體水平產(chǎn)生效應(yīng)，因此可以對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、腫瘤細(xì)胞與機(jī)體之間的免疫學(xué)關(guān)系、腫瘤的發(fā)展演變及凋亡進(jìn)行更全面的研究[6]；但同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求高，易發(fā)生突變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可控性較弱。舌癌轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型選用鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，產(chǎn)生的原發(fā)腫瘤不單一，且不發(fā)生轉(zhuǎn)移，這與人舌癌的臨床特點(diǎn)有較大區(qū)別[7]。因此，在建立舌癌動(dòng)物模型方法的選擇上，對(duì)于研究舌癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)展、轉(zhuǎn)歸，選用移植型動(dòng)物模型較適宜。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 舌癌動(dòng)物模型常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有裸鼠、小鼠、大鼠和兔。其中，裸鼠飼養(yǎng)、繁殖條件要求高，實(shí)驗(yàn)成本大；小鼠和大鼠雖然繁殖周期短、產(chǎn)仔數(shù)多、容易飼養(yǎng)及腫瘤生長(zhǎng)迅速，遺傳資源極為豐富，但鼠類動(dòng)物模型在腫瘤感染、免疫與人類有較大差別[8]，且生物存在個(gè)體小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低的缺點(diǎn)。兔個(gè)體相對(duì)較大，建模時(shí)操作簡(jiǎn)單、瘤體存活率高、建模周期短，且淋巴管轉(zhuǎn)移方式與舌癌相似，因此與鼠類動(dòng)物模型相比有很大優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)在常用的口腔癌動(dòng)物研究模型[9]。即通過體內(nèi)建模后，按照“兔舌癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)—接種同種異體新西蘭白兔皮下擴(kuò)散—接種到兔舌中1/3黏膜下—淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移”，多次反復(fù)，使兔舌癌的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)到100%，從而建立高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兔舌癌動(dòng)物模型。

2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也稱血管滲透因子。1989年Ferrara等[10]首先從牛垂體濾泡星形細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化出血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，其在人和動(dòng)物的腦、腎、肝、脾、胰腺和骨骼等組織中均有廣泛分布。大量研究資料證實(shí)，VEGF的生物學(xué)作用可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)淋巴管增生、抑制癌細(xì)胞的凋亡等直接或間接地促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[11]。其中，VEGF-C作為VEGF家族中的一員第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有特異性的淋巴管增生因子[12]，可以誘導(dǎo)腫瘤淋巴管增生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。VEGF-C對(duì)惡性腫瘤的影響是多方面的，是目前惡性腫瘤研究中非常熱門的一個(gè)因子。

2.1 VEGF-C與腫瘤淋巴管形成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系VEGF-C特異性作用于淋巴管內(nèi)皮，調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在人體不同器官的腫瘤組織中均有VEGF-C的表達(dá)，且其表達(dá)對(duì)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的促進(jìn)作用[13]。Lohela等[14]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3來刺激原發(fā)腫瘤組織內(nèi)淋巴血管增生；其血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2結(jié)合使淋巴管的通透性增加，腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是典型的淋巴管生成因子。田峰等[15]利用免疫組化染色法觀察在鼻咽癌組織中VEGF-C、VEGF-D的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-C、VEGF-D主要表達(dá)于鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并且證實(shí)VEGF-C、VEGF-D的高表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。溫玉明等[16]在研究口腔癌VEGF-C及其受體與腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組瘤周的血管和淋巴管密度均明顯增加，其VEGF-C表達(dá)率明顯高于非轉(zhuǎn)移組，進(jìn)一步證明VEGF-C促進(jìn)了口腔癌周淋巴管和血管的增生。還有學(xué)者[17]通過動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C的表達(dá)促進(jìn)腫瘤淋巴管生成。目前，已證實(shí)VEGF-C與腫瘤的分化程度、病理分型、侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[18]。

2.2 VEGF-C在舌癌中的表達(dá) 淋巴管增生是惡性腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要條件。目前大部分研究已經(jīng)證實(shí)，淋巴管生成在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不同舌癌患者中均存在[19]。李慧文和張秀清[20]在研究舌癌組織中發(fā)現(xiàn)，VEGF-C在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，VEGF-C的表達(dá)與臨床病理間存在聯(lián)系。證實(shí)VEGF-C的表達(dá)和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有肯定的相關(guān)性，VEGF-C誘導(dǎo)的淋巴管增生是腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)之一。黃玉娥[21]在舌癌組織與正常舌組織的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，利用免疫組化染色法檢測(cè)p53、VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在正常的舌組織中p53、VEGF的表達(dá)均呈陰性，而在舌癌組織中p53、VEGF的表達(dá)高達(dá)66%和58%。提示p53、VEGF的表達(dá)與舌癌組織病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)(P＜0.05)。因此，p53、VEGF的表達(dá)可以作為判定舌癌惡性程度的重要指標(biāo)。鄒浩等[22]研究VEGF-C在舌癌的表達(dá)中收集T1、T2期行淋巴結(jié)清掃術(shù)的舌癌病例74例，進(jìn)行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，VEGF-C高表達(dá)的為39例、低表達(dá)的為35例、有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為38例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)T1、T2期舌癌VEGF-C表達(dá)與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此可以認(rèn)為VEGF-C表達(dá)對(duì)評(píng)估早期舌癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要意義。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)研究表明，VEGF-C在舌癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用，VEGF-C的高表達(dá)是舌癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的唯一危險(xiǎn)因素[23]。另外，郭水根[24]在舌癌組織與正常舌組織的比對(duì)實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組化染色法研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞特異性分子(endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)、VEGF的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的舌癌組織中ESM-1和VEGF的表達(dá)均明顯高于正常舌組織，且晚期舌癌中兩者表達(dá)也高于早期舌癌，證實(shí)ESM-1、VEGF的表達(dá)與舌癌的生成、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

研究結(jié)果表明，VEGF-C在舌癌的發(fā)生、發(fā)展及愈后中起重要作用，利用VEGF-C在舌癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用的優(yōu)點(diǎn)，提高舌癌動(dòng)物模型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，為建模環(huán)節(jié)提供良好的理論基礎(chǔ)，證實(shí)該方法具有可行性。

2.3 VEGF-C基因轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞的影響 在對(duì)VEGFC基因的研究中，潘劍等[25]構(gòu)建70～419個(gè)氨基酸的編碼序列，而該序列中缺少信號(hào)肽69個(gè)氨基酸。Joukov等[26]研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C變異體，其可模擬并保持VEGF-C多肽活性，無突變。在之后諸多學(xué)者的實(shí)驗(yàn)研究中，均保留其VEGF-C信號(hào)肽部分，完整保留活性，再現(xiàn)人體VEGF-C的生物學(xué)作用[27-28]。

單明等[29]在研究VEGF-C基因轉(zhuǎn)染至人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，觀察VEGF-C表達(dá)的變化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞)細(xì)胞全部死亡，而轉(zhuǎn)染組和空載組中細(xì)胞存活；且經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)染組中VEGF-C表達(dá)較空載組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明VEGF-C基因順利導(dǎo)入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，為進(jìn)一步研究建立了平臺(tái)。陳星等[30]的研究中，將VEGF-C經(jīng)脂質(zhì)體成功轉(zhuǎn)染至人宮頸癌HeLa細(xì)胞后，重組細(xì)胞形態(tài)與原始細(xì)胞接近，且觀察其細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，提示成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比原始細(xì)胞生存能力更強(qiáng)。Yonemura等[31]將VEGF-C和VEGF-D的基因轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞系KKLS得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染重組細(xì)胞后，將重組細(xì)胞系接種到裸鼠胃的漿膜下層及皮下組織，結(jié)果在腫瘤組織中有新的淋巴管生成。華成舸等[32]將VEGF-C轉(zhuǎn)染至Tca8113并得到穩(wěn)定表達(dá)，用該重組細(xì)胞株建立動(dòng)物模型，VEGF-C在動(dòng)物體內(nèi)也能達(dá)到高表達(dá)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組頸部的高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)VEGF-C的高表達(dá)確實(shí)促進(jìn)了動(dòng)物移植瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

近年來，通過VEGF-C基因轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞得到重組細(xì)胞系、建立動(dòng)物模型的方法，已廣泛用于人體各部位腫瘤的基礎(chǔ)研究，為實(shí)現(xiàn)VEGF-C轉(zhuǎn)染至人舌癌細(xì)胞從而建立高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

基因轉(zhuǎn)染是將具有生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能，核酸包括DNA(質(zhì)粒和線性雙鏈DNA)、反義寡核苷酸及RNA干擾?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能(基因表達(dá)調(diào)控、基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物篩選研究)和基因治療的研究中。隨著基因工程的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成熟運(yùn)用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，目前已廣泛用于舌癌的研究中。

建立舌癌動(dòng)物模型，再現(xiàn)舌癌生物學(xué)特點(diǎn)，避免人體試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)舌癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及治療的研究具有重要意義。利用VEGF-C的生物學(xué)特性，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，培養(yǎng)重組人舌癌細(xì)胞系，從而建立具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的動(dòng)物模型，為舌癌的研究搭建一個(gè)良好的研究平臺(tái)。

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Vascular endothelial growth factor-C under high lymph node metastasis of tongue cancer in rabbits animal model

WANG Hui1，JIN Wulong2
(1.Inner Mongolia Medical University，Hohhot Inner Mongolia 010059，China；2.Department of Stomatology，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot Inner Mongolia 010050，China)

Tongue cancer is the highest incidence of malignant tumors of oral cancer，and its high lgmph node has metastasis direct impact on the survival and treatment of patients.The use of the biological role of vascular endothelial growth factor(VEGF-C)by establishing animal models tongue cancer with high potential lymph node metastasis，to increase lymph node metastasis rate.It is important to understand the pathogenesis and control of tongue cancer.Principles and methods on VEGF-C induced rabits tongue cancer in animal models on the mechanism of high lymph node metastasis were reviewed.

Tongue cancer；Lymph node metastasis；Vascular endothelial growth factor (VEGF-C)；Animal model

R739.86－332

A

2095-3097(2015)01-0061-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.01.016

2014-08-14 本文編輯:張?jiān)谖?

010059內(nèi)蒙古呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)(王 慧)；010050內(nèi)蒙古呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科(金武龍)