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(1.南華大學(xué),湖南 衡陽 421001；2.海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

·文獻(xiàn)綜述·

RNA干擾在生物基因治療中的應(yīng)用及意義

肖倩1,2,孫曉寧2*

(1.南華大學(xué),湖南 衡陽 421001；2.海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

RNA干擾(RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。RNAi以其高特異性、高效性等顯著優(yōu)勢將成為研究基因功能的全新手段，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本文擬就RNAi作用機(jī)制，及其在功能基因組學(xué)、基因治療(如腫瘤、病毒、自身免疫性疾病等)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀簡要作一綜述。

RNA干擾； 基因沉默； 功能基因組學(xué)； 基因治療

RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是指雙鏈RNA(double strands RNA，dsRNA)與細(xì)胞內(nèi)的同源序列mRNA相結(jié)合并使其降解的現(xiàn)象，從而特異抑制相應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng),是生物進(jìn)化過程中發(fā)展起來的自我保護(hù)機(jī)制。RNAi現(xiàn)象廣泛存在于各種生物中，如果蠅、水稻、小鼠及人類等，屬于RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式，對(duì)生物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。自發(fā)現(xiàn)以來，RNAi的研究取得了巨大的進(jìn)展，被廣泛用于探索基因表達(dá)調(diào)控、基因治療及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

RNA干擾現(xiàn)象最早應(yīng)追溯到1990年矮牽牛花顏色基因的共抑制現(xiàn)象。1995年，Guo等[1]用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲par-1基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)正義RNA具有與反義RNA同樣可以抑制該基因表達(dá)的作用。這一現(xiàn)象直到1998年才有了新的解釋，F(xiàn)ire等[2]推斷之前提到的ssRNA(single strand RNA,單鏈RNA)導(dǎo)致par-1基因沉默是因?yàn)橹苽鋯捂湑r(shí)混有微量的dsRNA所致，發(fā)現(xiàn)這種抑制現(xiàn)象在原核生物中具有可遺傳性，將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾(RNA interference),簡稱RNAi。2001年Elbashir等[3]率先在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觀測到了RNAi現(xiàn)象,從而開啟了RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用研究的閘門。2002年研究發(fā)現(xiàn)RNAi能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效沉默目標(biāo)基因的表達(dá)后，RNAi技術(shù)開始應(yīng)用在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。目前，實(shí)驗(yàn)中常用的RNAi手段主要包括直接轉(zhuǎn)染小或短干擾RNA(sm1all/short interfering RNA，siRNA)以及轉(zhuǎn)染攜帶小或短發(fā)卡RNA(small/short hairpin RNA，shRNA)的質(zhì)粒。

2 RNAi的作用機(jī)制

RNAi的作用機(jī)制目前還不十分清楚。目前初步闡明RNAi發(fā)生的機(jī)制大致可分成3個(gè)階段：(1)啟動(dòng)階段:外源性基因如病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因等隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞組內(nèi)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的dsRNA被一雙鏈RNA酶III型(Dicer酶)剪切成21～23nt的小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)。另外，siRNA的5′端磷酸化，3′端為羥基末端且有兩個(gè)不配對(duì)核苷酸，此結(jié)構(gòu)形式可能是siRNA進(jìn)入RNA干擾的通行證[4-5]。(2)效應(yīng)階段:siRNA與細(xì)胞內(nèi)的特異蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，但激活RISC得需要一個(gè)ATP依賴的siRNA解雙鏈的過程[5]。之后正義鏈RNA被置換出來，而反義鏈RNA仍結(jié)合在復(fù)合物上，從而形成具有生物活性的復(fù)合物。具有活性的RISC作用于與其上的單鏈siRNA序列互補(bǔ)的mRNA，由核酸內(nèi)切酶在距離siRNA 3′端12個(gè)堿基的位置將mRNA剪切成21～23 nt的片段,從而特異性地抑制了靶基因的表達(dá)[6]。(3)級(jí)聯(lián)放大階段:RISC與靶mRNA結(jié)合后以siRNA反義鏈為引物，以靶mRNA為模板，在RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下，將單鏈mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈。后者再由Dicer酶切割產(chǎn)生新的大量siRNA,使得RNAi的作用進(jìn)一步放大,最終把靶mRNA完全降解,從而顯著增強(qiáng)了對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用[6-8]。

3 RNAi的應(yīng)用及意義

3.1 RNAi與功能基因組學(xué)

人類已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代，基因組學(xué)的重心已由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，RNAi技術(shù)以其高度特異性、高效、操作簡單及周期短等特點(diǎn)，也就義不容辭的成為研究基因功能的強(qiáng)大工具。將功能未知的基因的編碼區(qū)(外顯子)或啟動(dòng)子區(qū),以反向重復(fù)的方式由同一啟動(dòng)子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個(gè)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA形成dsRNA產(chǎn)生RNA干涉，使得目的基因沉默，從而進(jìn)一步研究目的基因的功能[9]，使目的基因按照人們的意圖去表達(dá)。所以，RNAi能夠在后基因組時(shí)代里發(fā)揮其不一般的作用。

3.2 RNAi在基因治療中的應(yīng)用

RNAi作用的這種高度特異性有可能特異地抑制致病的突變等位基因，且又不影響正常的等位基因[9]，所以RNAi在治療疾病方面較傳統(tǒng)治療方法更有效而副作用更小。

3.2.1 RNAi與腫瘤 腫瘤是由多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常的結(jié)果，如果只針對(duì)單個(gè)突變基因進(jìn)行的腫瘤基因治療，效果并不理想。而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性設(shè)計(jì)，針對(duì)這一序列的dsRNA分子只需導(dǎo)入一種dsRNA就可以使多個(gè)基因同時(shí)沉默多種癌基因可以作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的siRNA。目前RNAi對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療主要集中在與腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(如癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因)以及與腫瘤耐藥基因、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)、有絲分裂及腫瘤血管生長等一系列有關(guān)的基因方面。如Zhang等[10]以人的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC7721為模型檢測到信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物5(signal transducer and activator of transcription 5,Stat5)(Stat5在人的多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá))在細(xì)胞系中高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)用RNAi介導(dǎo)的Stat5基因沉默可以抑制腫瘤細(xì)胞生長，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Qiu等[11]利用慢病毒包裝針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)基因的RNAi載體，導(dǎo)入結(jié)直腸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)VEGFA表達(dá)被抑制后，結(jié)果有效的抑制了腫瘤細(xì)胞的生長、遷移及增殖。以上研究說明RNAi的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的基因治療帶來了希望之光。

3.2.2 RNAi與病毒 RNAi是機(jī)體的一種由小分子RNA介導(dǎo)的序列特異性免疫保護(hù)性機(jī)制。RNAi能夠通過直接靶向病毒的mRNA從而導(dǎo)致病毒主要蛋白的降解[12-13]。RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)并且已經(jīng)成功抑制了多種病毒的復(fù)制。RNAi治療最關(guān)鍵的一點(diǎn)是尋找合適的靶點(diǎn)。到目前為止，幾乎所有的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)編碼和調(diào)控基因已經(jīng)被用作抗HIV RNAi治療的靶點(diǎn)并在體外實(shí)驗(yàn)中得以驗(yàn)證。其中效果比較好的有tat、rev基因等[14]。來自宿主的RNAi靶點(diǎn)，目前已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明有效的包括NF-κB、CD4、趨化因子受體CCR5和CXCR4等，抑制這些分子的表達(dá)可以有效的抑制病毒復(fù)制和病毒感染過程[15-16]。此外，在體內(nèi)外的研究均證實(shí)了RNAi在抗乙型肝炎病毒[17-18](hepatitis B virus，HBV)、抗(hepatitis E virus，HEV)[19]等病毒感染中的作用。RNAi已成為抗病毒感染治療的有力工具。

3.2.3 RNAi與自身免疫性疾病 RNAi亦被用于自身免疫性疾病的研究。導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)關(guān)節(jié)退化的機(jī)制之一是滑膜細(xì)胞異?？沟蛲龅拇嬖?產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子和金屬蛋白酶。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的是一種常見的死亡受體,其中大部分屬于腫瘤壞死因子(TNF)的家庭。用抗TNF-α的單克隆抗體治療可顯著減少軟骨和骨侵蝕[20]。用siRNA技術(shù)沉默疾病相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)RA的治療也具廣泛的應(yīng)用前景。如運(yùn)用siRNA沉默樹突細(xì)胞中的CD40、CD80、和CD86可抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。慢病毒載體介導(dǎo)的TNF超家族成員B細(xì)胞激活因子的基因沉默，可抑制Th17細(xì)胞的增殖以改善小鼠中自身免疫性關(guān)節(jié)炎的病情[21]。Crispin等[22]用siRNA技術(shù)處理系統(tǒng)性紅斑狼瘡瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的T細(xì)胞，結(jié)果顯示白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的分泌水平得以恢復(fù)。而IL-2的減少是SLE最主要的免疫病理學(xué)表現(xiàn)。RNAi為各種自身免疫病的治療提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并發(fā)揮著重要作用。

3.2.4 RNAi與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病。對(duì)AD進(jìn)行的RNA干擾的研究也最為深入。AD主要表現(xiàn)為腦組織淀粉性斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[23]。淀粉樣斑塊由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解過程產(chǎn)生的β淀粉樣蛋白( β-amyloid protein，Aβ) 錯(cuò)誤折疊組成。RNAi技術(shù)被用來減少體內(nèi)的Aβ肽，其原理是作用于APP水解蛋白水解過程所需的酶(如BACE1)的表達(dá)或者直接作用于APP的表達(dá)[24-25]。在不同情況下，Aβ肽水平的明顯減少與改善神經(jīng)病理學(xué)和記憶相關(guān)的表型有關(guān)。AD另外一個(gè)病理學(xué)特點(diǎn)是NFTs，它是由高度磷酸化的Tau組成[26]，Tau是AD的另一個(gè)治療靶點(diǎn)[27]。Tau似乎對(duì)于哺乳動(dòng)物的功能來說并不是必不可少的，而且會(huì)引起一系列的神經(jīng)退化性疾病[28]。雖然沒有在AD模型的小鼠上直接以Tau的表達(dá)為目標(biāo)研究，但有研究在轉(zhuǎn)基因的AD小鼠模型上通過沉默細(xì)胞周期素依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)(CDK5是Tau高磷酸化所需要的酶)來阻礙NFTs的產(chǎn)生[29]。所以這項(xiàng)研究證實(shí)了CDK5也間接的證實(shí)了把Tau作為RNAi治療AD的靶點(diǎn)的可行性。

4 結(jié) 語

RNAi現(xiàn)象一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就成為科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，且在生物醫(yī)學(xué)方面的研究成果斐然，但仍有一系列問題亟待解決。如RNAi的具體作用機(jī)制、病毒的逃逸、如何把理論上可行的治療模型用于人體以及評(píng)價(jià)其作用效果等。相信隨著RNAi的深入研究，RNAi有望在將來成為一種高度特異的以核苷酸為基礎(chǔ)的基因治療技術(shù),不僅只應(yīng)用在腫瘤、抗病毒等治療中,甚至在功能性疾病的治療中發(fā)揮巨大作用。

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2014-10-24；

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*通訊作者，E-mail：xnsun-0108@163.com.

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(此文編輯：朱雯霞)